このプロトコルは、表在性膀胱がんの同所性モデルを構築するための独自の方法を説明しています。
この記事について
サマリー
要約
この研究は、高効率で正確な腫瘍局在化を備えた同所性マウス膀胱腫瘍モデルを確立するための革新的な方法を提示します。雌のC57BL/6Jマウスを仰臥位で麻酔した後、24Gの静脈注射針を膀胱に挿入して内容物を排出します。次に、34 G の分注針をカテーテルに通し、5 回回転させて膀胱ドーム粘膜に限局性損傷を生じさせ、その後抜去します。MB49細胞懸濁液は吸引され、30Gの分注針に接続され、カテーテル を介して 膀胱に挿入されます。腫瘍細胞は、圧力下で膀胱に粘膜下注入されます。この技術により、マウスへの外傷が最小限に抑えられ、腫瘍の取り込み率が高くなり、腫瘍の位置が固定されます。シンプルさと優れた再現性が特徴です。このモデルは、膀胱がんの膀胱内療法を開発するための理想的な実験プラットフォームを提供し、この悪性腫瘍の治療戦略の進歩と最適化を促進します。
概要
膀胱がんは世界的に大きな健康負担となっており、発生率と予後には性差が顕著である。この悪性腫瘍は、それぞれが多様な病原性経路に関連する異なる分子サブタイプによって特徴付けられます。非筋層浸潤性膀胱がん(NMIBC)と筋層浸潤性膀胱がん(MIBC)では、分子的および病理学的特徴が大きく異なります1,2。NMIBCは症例の約75%を占め、転移や転移を伴わずに限局性が残る移行性上皮起源の腫瘍を特徴としています。一方、MIBCは、がん細胞が膀胱の筋肉層に浸潤することを特徴とし、播種のリスクが高いため、臨床現場では膀胱切除術が必要になることがよくあります3。
前臨床研究では、薬物療法の評価には、疾患の表在性を正確に表すモデルが不可欠です。したがって、表在性膀胱がんのin situモデルの確立は最も重要であり、臨床薬の開発や革新的な点滴療法のための重要な研究ツールとして機能します。
マウスの同所性膀胱がんモデルの開発は、伝統的に課題に直面してきました。化学的に誘導されたモデルは、多くの場合、表在性の腫瘍として開始されますが、浸潤性に進化する可能性があり、大規模な実験ではその有用性を制限する変動性があります4。従来の同所性移植モデルは、膀胱壁5からの腫瘍細胞の注入に依存しており、表在性膀胱がんを忠実に再現するのに苦労しています。腫瘍細胞点滴6,7,8,9,10と組み合わせた粘膜損傷を含む代替方法が試みられてきたが、高い死亡率と低い腫瘍摂取率によって制限され、それらの広範な適用を妨げている。
この研究は、既存のモデルと比較して、より高い安定性、低い死亡率、および固定された腫瘍の位置を示す表在性膀胱がんモデルを構築するための新しい方法を開発することを目的としています。現在のモデルは、疾患の初期段階をより正確に表現することで、予防的および治療的介入の厳密な評価を強化し、それによって膀胱がんの治療を前進させる態勢を整えています。
プロトコル
すべての動物実験のプロトコルと手順は、中国天津の天津医科大学の動物実験倫理審査委員会によって承認されました(承認番号SYXK:2020-0010)。この研究では、6〜8週齢の雌C57BL / 6Jマウスを使用しました。動物は、12時間の明暗サイクル、21〜25°Cの範囲の温度、30%〜70%の調整可能な湿度レベル、特に指定がない限り食物と水への無制限のアクセスなど、制御された環境条件下で飼育されました。使用した試薬や機器の詳細は 、資料表に記載されています。
1. 細胞調製
- マウス膀胱がん細胞株MB49を完全ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で培養し、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加して最適な増殖をサポートします。
- 細胞培養物を37°Cの標準条件下で、5%CO2の加湿インキュベーターで維持します。細胞の健康と生存率を確保するために、2〜3日ごとに培地を更新してください。
- 標準化されたトリプシン消化手順を使用して細胞を回収します。トリプシンを塗布し、短時間インキュベートした後、静かにピペットで細胞を培養フラスコから取り除きます。
- 血球計算盤を使用して採取した細胞をカウントし、正確な細胞密度を決定します。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を2 x 103/μLに再懸濁して、シングルセル懸濁液を調製します。この懸濁液を氷上に置いて、細胞の生存率を維持します。
2.動物の調理
- マウス(ケージあたり5匹)をグループハウスで、個別に換気されたポリカーボネートケージに入れます。
- 研究開始の7日前からマウスを順応させます。
3. 動物同所性腫瘍モデル作製
- Avertin の 2.5% 溶液を使用して腹腔内注射 により マウスに麻酔を投与します (施設で承認されたプロトコルに従います)。
- マウスが手術に適したレベルの麻酔に達するまで待ちます。これは、深さの増加に伴う呼吸数の減少、まぶたと角膜反射の欠如、筋緊張と反射反応の低下、尻尾のピンチに対する反応がないことから示されます。
- 麻酔をかけたマウスを仰臥位にして、手順を容易にします。
- 尿道カテーテル法のために針スタイレットを取り外した24G静脈内カテーテルを使用してください。カテーテルに十分な潤滑剤を塗布して、不快感を最小限に抑え、スムーズな挿入を容易にします。
- マウスを仰臥位に保ちながら、外陰部のひだのすぐ後方、膣の前方に位置する尿道を特定します。
- カテーテル法は、恥骨の下を移動するために45度の角度で尿道に近づくことから開始します。より浅い角度に調整して、カテーテルを尿道を通って膀胱に導きます。
- 抵抗に対して過度の力を加えると、尿道や膀胱の穿孔につながる可能性があるため、避けてください。カテーテル内の尿をチェックして、膀胱内腔内のカテーテルの位置を確認します。
- マウスの下腹部にやさしく圧力をかけ、膀胱からの尿の排出を促進します。手順の後続のステップに備えるために、膀胱が完全に空になっていることを確認してください。
- 24G静脈カテーテルを膀胱の上部に向かってそっと押します。カテーテルの先端が膀胱の頂点に接触していることを確認します。
- 接触が確認されたら、カテーテルを放し、カテーテルがわずかに引っ込められるのを待ちます。カテーテルをマウスに対して固定位置に保持して、安定性を確保し、脱落を防ぎます。
- 修正した34Gディスペンシングニードルを24Gカテーテルに沿って挿入します。針が膀胱の上部に達するまで針を進めます。
- 位置を特定したら、針を6回回転させて、膀胱の頂点に局所的な粘膜損傷を作成します。回転が完了したら、カテーテルに沿って針を慎重に引き抜きます。
- 30 Gの分注針を1 mLシリンジの上部に接続します。針とシリンジをしっかりと接続してください。
- 接続したら、プランジャーを静かに引き戻して、事前に調製した2 x 10³/μL MB49細胞懸濁液をシリンジに引き込みます。細胞懸濁液が気泡なしでシリンジに吸引されることを確認します。
- 30Gのディスペンシングニードルを24Gのカテーテルに沿って挿入します。針が適切に位置合わせされ、カテーテル内に固定されていることを確認してください。
- 位置決めしたら、1 mLシリンジのプランジャーに圧力を加えて内容物を注入します(ステップ1で調製)。プランジャーに一定の圧力を60秒間維持して、内容物が大幅に体積を減少させることなく供給されるようにします。
- 60秒後、シリンジと30Gの分注針をカテーテルから慎重に引き出します。.
4. 術後モニタリング
- 麻酔をかけたマウスを、右向き反射が戻るまで加熱パッドの仰臥位に置きます。
- 動物が十分な意識を取り戻すまで、動物が放置されていないことを確認してください。
- 動物が完全に回復するまで、動物を他の動物と一緒に戻さないでください。
結果
粘膜下注射の有効性は、最初にトリパンブルーの投与によって評価されました。.注入後、粘膜下層内の色素の分布が明確に可視化され、注入された物質の正確かつ制御された送達が確認されました(図1)。
腫瘍の発生は細心の注意を払って追跡されました。着床後約14日で、膀胱腫瘍を示す重篤な症状である血尿の顕著な発生率が観察されました。腫瘍は、膀胱の粘膜下層内にしっかりと確立されていると同定されました。これらの腫瘍の初期の成長パターンは、NMIBCの分類と一致する、広範で非浸潤的な拡大によって特徴付けられました。組織学的検査では、筋肉浸潤がないことが確認され、腫瘍は粘膜下層に限局しているため、NMIBCの基準と一致しています(図2)。
肉眼的観察により、腫瘍形成過程がさらに裏付けられました。腫瘍は視覚的に明瞭で、さまざまなサイズと形状の乳頭状の成長を示しました(図3)。さらに、腫瘍は比較的ゆっくりと成長したため、実験での研究に十分な時間を確保できました(図4)。
本研究では、腫瘍の位置と尿道播種がないことを検証するために、MB49-luc細胞を移植用とし、続いて小動物イメージングを行いました。 図5 は、腫瘍細胞注入の35日後に撮影された in vivo 生物発光画像を示しており、腫瘍が尿道などの異所性播種の証拠がなく、膀胱に位置していることを明確に示しています。
腫瘍組織は通常、移植後14日で検出可能になります。私たちの経験では、マウスの70%以上が14日目までに血尿を示します。この手順は一般的に死亡率をもたらしません。介入がなければ、60日目までに安楽死が必要になります。安楽死の基準には、嗜眠、悪液質、毛皮の波立ち、猫背、反応しない行動、または初期体重の≥20%の減少が含まれます。
図1:トリパンブルーによる粘膜下注射の有効性。 トリパンブルーを用いた粘膜下注射効果の実証。矢印は、PBSで3回洗浄した後も残留トリパンブルーが見える注入部位を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:腫瘍移植の組織学的確認。 H&E染色による粘膜下組織への腫瘍移植の組織学的確認。スケールバー:50μmこの 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:膀胱腫瘍の直接可視化。 膀胱腫瘍を直接視覚化し、腫瘍基部での明らかな血管増殖を強調します。スケールバー:2 mm。 この 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:移植後35日目の腫瘍の状態。 移植後35日目の腫瘍状態の評価。腫瘍基部の膀胱壁は、血管の肥大と無秩序さを示し、広範囲にわたる腫瘍基部を伴います。スケールバー:2 mm。 この 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:膀胱がんの in vivo 生物発光イメージング MB49-LUC膀胱がん細胞を移植した35日後のマウスの in vivo 生物発光画像。画像は蛍光強度を表すために色分けされており、赤は高蛍光(腫瘍活性が高い)を示し、青は低蛍光(腫瘍活性が低い)を示します。膀胱領域で関心領域(ROI)を選択し、腫瘍に特異的な生物発光シグナルを定量化しました。この結果は、腫瘍が膀胱に局在し、尿道などの異所性播種による証拠がないことを示しています。シグナル領域が低いのは、組織を貫通する高強度領域からのシグナルの散乱による場合があり、必ずしも腫瘍細胞の存在を示すものではありません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:がん細胞の膀胱内投与の図。 表在性膀胱癌の同所性モデルを構築するための癌細胞の膀胱内投与の概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:変更されたディスペンシングニードルの構成。 24Gカテーテル内の変更された分注針の構成。(A)24Gカテーテル内の34Gディスペンシングニードルの写真。(B)24Gカテーテル内の30Gディスペンシングニードルの写真。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ディスカッション
膀胱がんの研究は、基礎研究と応用研究の両方に不可欠な動物モデルに依存しています。腫瘍の成長環境をよりよく模倣するために、同所性膀胱腫瘍モデルは、皮下腫瘍モデル11と比較して優れたアプローチを提供します。
現在、同所性膀胱がんモデルは、実験目的に基づいて、免疫不全マウスを利用するもの(PDX)モデル1 や細胞株由来異種移植片(CDX)モデル5などのものと、免疫コンピテントマウスを利用するもの(同系生着モデル12)の2つに分類できます。
PDXモデルでは、患者由来の腫瘍組織を免疫不全マウスに移植し、化学療法薬に対する腫瘍の反応を個別化して評価することができます。しかし、これらのマウスには無傷の免疫系がないため、免疫関連メカニズムの研究には大きな限界があります。同様に、ヒト由来の腫瘍細胞株を使用するCDXモデルは、高い腫瘍形成率を提供しますが、免疫微小環境の欠如にも悩まされます5。
免疫コンピテントマウスの状況では、同所性膀胱腫瘍を構築するための主要な方法は、マウス由来MB49細胞株を膀胱壁に注入して in situ 膀胱腫瘍を形成することを含む12。この手順では、開腹術と腫瘍細胞の膀胱内注射が必要であり、潜在的な腫瘍細胞の漏出や針路の播種などの課題が生じます。その結果、表在性膀胱腫瘍を作成することは困難であり、非筋肉浸潤性ステージ13へのヒト膀胱がんの進行の正確な再現を妨げます。
表在性同所性膀胱腫瘍を確立するために、従来のモデリング技術では、通常、酸塩基溶液や電気焼灼などの薬剤を使用して粘膜損傷を誘発し、続いて腫瘍細胞懸濁液の膀胱内点滴を行い、保持時間は2時間以上です8,14。ただし、これらの方法論にはいくつかの重大な制限があります。まず、膀胱内の腫瘍インプラントの数と位置の均一性を確保できないため、モデルの再現性が損なわれます。さらに、これらの技術はしばしば重度の膀胱損傷を引き起こし、高い死亡率につながります。結果として生じる膀胱瘢痕化と容量の低下は、膀胱内注入を繰り返す必要がある新しい治療薬の研究に大きな障害をもたらします。これは、実験結果の信頼性を損なうだけでなく、動物福祉に関する倫理的な懸念も引き起こします。
したがって、表在性のヒト膀胱がんを正確にシミュレートできる動物モデルを開発することで、腫瘍の増殖と進行を理解するためのより良い実験プラットフォームが提供されることになります。このようなモデルは、新しい膀胱内治療薬を研究し、膀胱がんの生物学に関する知識を進歩させるために非常に貴重です。
この研究では、先端が鈍い分注針を使用して、圧力下で腫瘍細胞を粘膜下に注入する in situ 移植法を概説しています(図6)。この研究では、MB49細胞株と雌のC57BL / 6Jマウスを使用して、 上皮内 腫瘍モデルを構築します。
このモデルの構築中、正常な膀胱粘膜表面の保護層は、腫瘍細胞の直接注入に大きな課題をもたらし、しばしば効果的な腫瘍形成を妨げます8。したがって、腫瘍細胞の移植に適した「土壌」を作り出すために、34Gの鈍い針を使用して膀胱ドームに局所的な損傷を誘発する必要があります。
この研究で使用された 34 G および 30 G のディスペンシング針は、部分的に変更されています。34Gの針の先端は、わずかに不規則な端を作るためにクランプされており、粘膜の損傷を引き起こす能力を高めています。34 G と 30 G の両方の針の接続ポイントは、24 G カテーテルの露出部分がそれぞれ 0.3 mm から 0.5 mm (図 7A) と 1 mm から 1.5 mm (図 7B) になるようにトリミングされています。
この全処置は10分以内に完了し、開腹術や膀胱内点眼のための長期の尿道結紮術が不要になります。ただし、このアプローチには制限もあります。このモデリング方法には、尿道から膀胱に留置カテーテルを挿入し、膀胱壁を穿孔せずに適切な程度の粘膜損傷を達成するために34 Gの鈍い針を回転させるなど、複数の技術的ステップが関与するため、実験者は腫瘍移植の成功率を高めるために練習する必要があります。さらに、粘膜損傷や腫瘍細胞注射中に過度の力がかかると、膀胱穿孔や筋肉層への腫瘍移植につながる可能性があります。
結論として、この技術は、侵襲的な処置や長期の膀胱内保持を必要とせずに、処置時間の短縮、死亡率の低下、腫瘍の局在化と成長の一貫性の向上など、従来の方法に比べて大きな利点を提供します。これらの利点により、膀胱がんの新しい治療薬の評価を目的とした前臨床試験の貴重なツールとなっています。
開示事項
著者は、競合する利益がないことを宣言します。
謝辞
この研究は、天津市健康産業主要プロジェクト基金(助成金番号。TJWJ2022XK014)、天津市教育委員会の科学研究プロジェクト基金(助成金番号2022ZD069)、天津泌尿器科学研究所人材資金プログラム(助成金番号。MYSRC202310)、天津医科大学第二病院臨床医学研究プロジェクト基金(助成金番号2023LC03)、天津医科大学第二病院青少年基金(助成金番号2022ydey15)、天津医科大学第二病院泌尿器科人材育成プロジェクト(助成金番号2022ydey15)、天津医科大学第二病院泌尿器科の人材育成プロジェクト(助成金番号。MNRC202313)。スポンサーは、原稿の準備、レビュー、承認に役割を果たしました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 34 G ディスペンシング ニードル | Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China | SGL-362 | |
| 30 G ディスペンス ニードル | Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China | SGL-362 | |
| Avertin | Sigma-Aldrich LLC | T48402 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich LLC | 302643 |
参考文献
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