可視から短波赤外までの生体吸収スペクトルの特性評価

サマリー

生体試料は、可視(VIS)および近赤外(NIR)の波長範囲と比較して、短波赤外(SWIR)で異なる光学特性を持っています。しかし、純粋なSWIR吸収スペクトルの記録は困難であり、生体分子に対して行われることはめったにありません。この記事では、生体吸収体のVIS-SWIR吸収スペクトルを特徴付ける方法を紹介します。

要約

非侵襲的な光ベースの生理学的モニタリングでは、吸収分光法を使用して個々の組織成分の最適な波長を特定できます。しかし、より長い波長ではハードウェアの感度が不足しているため、吸収分光法は通常、400〜1,000nmの可視(VIS)および近赤外(NIR)範囲の波長に適用されてきました。短波赤外線(SWIR)範囲のハードウェアの進歩により、研究者は、脂質、タンパク質、および水の落下特性吸収ピークが1,000nm~3,000nmの範囲の波長を探索することが可能になりました。これらの分子は、VIS-NIRで視覚化するのが難しく、ラベルフリーの生物学的コントラスト源を提供できます。さらに、皮膚の色素沈着の原因となる主要な発色団であるメラニンについては、SWIR吸収の低下が観察されています。臨床的に標準的なパルスオキシメータのような 生体内光学デバイスは、おそらくVIS範囲でのメラニン吸収が強いため、色素沈着が濃い肌の人では精度が低下することがわかっています。したがって、SWIRで動作するデバイスを使用することで、皮膚の色素沈着に関連するエラーを減らすことができます。光学機器の設計は、VISからSWIR範囲までのコア組織コンポーネントの吸収特性を理解することによって容易になります。この記事では、一般的な組織吸収体(酸素化ヘモグロビン、脱酸素化ヘモグロビン、メラニン、水、脂質)のVIS-SWIR吸収スペクトルを取得するためのプロトコルと装置について説明します。

概要

ほとんどの生物学的吸収体は、可視(VIS、~400-700 nm)および近赤外(NIR、~700-1,000 nm)のスペクトル範囲で光学的に特徴付けられていますが、短波赤外(SWIR、~1,000-3,000 nm)1,2,3,4では特徴付けられていません(図1)。これは、SWIRが組織散乱の減少とメラニン吸収の減少、および水、脂質^{、およびタンパク質1,5,6}に対する追加のラベルフリーの生物学的コントラストにより、より深い光透過を提供するにもかかわらずです。VIS-SWIRにまたがる吸収スペクトルの欠如は、これらのSWIRの利点を活用する生物医学光学デバイスの開発を妨げる知識のギャップを生み出しました。スペクトルを特徴付ける試みは過去に何度か発表されてきましたが、大きな溶媒アーティファクトのない純粋な成分の高品質のVIS-SWIR吸収スペクトルには^{1,7,8が欠け}ています。例えば、ヘモグロビンのような水溶性物質は、SWIRにおいて、水を溶媒として使用し、結果として得られるスペクトル9から純水の吸収を差し引くことによって特徴付けられ^ている。しかし、この地域では水が主要な吸収体であるため、このアプローチの精度は不明です。

SWIRでの作業には、in vivo光学診断を使用する場合にVISでの強いメラニン吸収によって引き起こされるバイアスを低減または除去するという追加の利点があります。多くの研究により、パルスオキシメータは黒人患者の酸素化を過大評価しており、そのため、黒人患者はパルスオキシメータが検出しなかった危険なほど低い酸素レベルを持っている可能性が高いことがわかっています¹⁰。この皮膚の色素沈着バイアスは、多くの黒人低酸素患者^11,12の遅れと不十分な治療をもたらし、すべての肌の色調¹³の光学デバイスの精度を向上させるための光学およびエンジニアリングコミュニティでの行動の呼びかけを促しました。メラニンを吸収するVIS波長が高いVIS波長からNIRおよびSWIRへの移行は、非常に重要な生物医学光学技術における人種格差を縮小できるエキサイティングな技術革新の1つです。

生体分子のグラウンドトゥルース吸収スペクトルを記録することは、さまざまな工学および生物医学的アプリケーションで使用される組織サンプルの光学特性を理解するために不可欠です¹⁴。吸収分光法は、分子特異的な光吸収を波長の関数として測定します。溶液中での吸収測定値を取得するためのゴールドスタンダードの方法は、コリメートされた単色光を溶解したサンプルに導き、光源からサンプルの反対側に配置された検出器で透過光を記録することです。サンプルの吸収(A)は、式(1)で定義されます。

A = log₁₀(I₀/I) (1)

ここで、I_o はサンプル上の入射光強度、Iは検出器に当たるサンプルを透過する光の強度です。I_o は、I.吸収分光法は定量的な吸収特性を提供し、ランベルトベールの法則(式 2)によって管理され、光散乱のあるサンプルには適用されません。この式は、光吸収は、波長λにおける試料のモル吸収係数(ε、単位L・mol⁻¹・cm⁻¹)にそのモル濃度(C、単位mol・^L-1)を掛けたもの、および試料¹⁵を通過した距離として定義される光路長(L、単位cm)によって決定されると述べています。

A(λ)= ε(λ)* L * C(2)

重要なことに、モル吸収係数は各生物学的吸収体に固有であり、サンプルが特定の波長¹⁶で光をどれだけ強く吸収するかを示す。

VISからSWIRまでの吸収分光法測定を行う場合、ハードウェア、サンプル調製、およびスペクトル後処理の調整が標準のVIS-NIRスペクトルを超えて必要になります。

ハードウェア
VIS-NIR測定は通常、UV-VIS光子に敏感な光電面を備えたシリコン検出器または光電子増倍管(PMT)を使用しますが、SWIR吸光度には、インジウムガリウムヒ素(InGaAs)検出器¹⁷などのSWIR光子に敏感な光検出器が必要です。VIS、NIR、およびSWIRシステムでは、通常、これらの光学範囲での光分散のために、光学格子などの波長固有の分散要素も必要です。さらに、SWIRの吸収にはガラスまたは石英キュベットが必要であり、SWIRではプラスチックキュベットよりも透過率が高いため、VIS-SWIRスペクトルにより適しています。タングステンハロゲンランプ(このプロトコルで使用)のように、VIS-SWIRをカバーする広範で比較的均一な発光を持つ光源を選択する必要があります。入射光出力、露光時間、または光検出器が光にさらされる時間を調整すると、吸光度測定を最適化するのに役立ちます。

サンプル調製
試料の濃度またはキュベットの光路長は、式(2)で上述したように発生する吸収量を直線的に変化させ、したがって、いずれかを変更して、スペクトルの異なるセクションで、比較的高いまたは低いスペクトルの異なるセクションで、高い信号対雑音比(SNR、ここではSNR、ここではピーク振幅をスペクトルのトレンド除去領域の標準偏差で割った比として計算され、通常はSNR>30は高品質と見なされます)測定を達成することができます吸光度。水溶液中のSWIR測定を最適化するために、SWIR¹の吸収ピークが大幅に低いため、水(H₂O)の代わりに酸化重水素(D₂O)(重水または重水素化水とも呼ばれる)を使用することができます。これにより、SWIRの主要な吸水率に干渉することなく溶質の特性評価が可能になります。

スペクトルの後処理
VIS-SWIR スペクトルには、可視近赤外 (通常はシリコンまたは UV-VIS 感度 PMT) 用と SWIR (通常は InGaAs) 用の 2 つの検出器が必要であり、スペクトルをつなぎ合わせて完全な VIS-SWIR スペクトルを実現する必要があるため、後処理が必要です。スペクトルがVIS-SWIRにまたがる場合、吸収は波長領域によって大きく異なる可能性があり、飽和を防ぐためにサンプルを希釈するか、一部の領域で光路長を短くする必要がある場合があります。スペクトルは、サンプル濃度または光路長の変化を考慮して線形にスケーリングし、次につなぎ合わせて、2つの波長領域を含む単一のスペクトルを作成する必要があります。

次のプロトコルでは、VISからSWIRへの5つの例の生物学的吸収剤の調製と分光測定について詳しく説明します:水(体重の~60%を含む)、メラニン(皮膚の色素沈着のための一次吸収剤)、コーン油(バッチ間の変動性が低く、人間と動物の脂質に近い化学組成であるため、人間の脂質の類似体として使用されます)。 および最小限の散乱)、および酸素化および脱酸素化ヘモグロビン(血液中の主要な吸収物質)。

プロトコル

1.サンプルの調製

1. 水サンプルの調製
   1. サンプルを調製するには、清潔な容器に超純水を入れ、0.22 μmシリンジフィルターでろ過します。シリンジの出力が清潔なガラスまたは石英キュベットに向けられ、サンプルの吸収分光測定を行うことを確認してください。
   2. リファレンスを調製するには、清潔な容器に重水素水を満たし、0.22 μmシリンジフィルターを使用してろ過します。シリンジの出力が、参照として機能するサンプルキュベットと同じきれいなガラスまたは石英キュベットに向けられていることを確認してください。
      注:フィルタリングステップは、可視領域に強い寄与を持つ水中の小さな粒子をフィルタリングすることにより、サンプルからの光散乱を最小限に抑えます。
2. メラニンサンプルの調製
   1. 3.5 mLのジメチルスルホキシド(DMSO)で満たされた遠心分離チューブに粉末メラニンを加えて、1.7 mg / mLのメラニン溶液を調製します。.まず、測定は、予想される吸収が最も低い波長から開始し、メラニンの濃度が最も高い必要があります。SWIRに対して約1.7 mg / mLでメラニン測定を開始し、後でDMSOでVIS / NIR領域に対して10倍希釈(約0.17 mg / mL)に希釈します。
   2. 粉末状のメラニンがDMSOに溶解することを確認し、溶液をきれいなガラスまたは石英キュベットに移して分光測定するために、チューブを10分間超音波処理します。
   3. 分光器の線形吸光度範囲内にとどまり、濃度や光路長を変更することで(たとえば、短い光路長(1 mmまたは2 mm)から10 mmの光路長キュベットに切り替えるなどして)、高いSNR測定を確保します。メラニンの吸収は、VISからSWIRまで幅広く吸収されます。VISには、モル吸光係数が高いため、メラニンの濃度および/または経路長のキュベットが最も低いものを使用してください。SWIRの場合、最高濃度のメラニンおよび/または光路長キュベットを使用して、定性的にクリーンな分光測定を取得します。
3. コーン油サンプルの調製
   1. 分光測定のために、きれいなガラスまたは石英キュベットにコーン油を加えます。
   2. 参考にオープンエアを使用してください。キュベットや溶液は参照として使用されません。
4. 全ヘパリン化ヒト血液を用いた酸素化ヘモグロビン試料の調製
   注:全ヘパリン化ヒト血液は購入され、米国にあるFDA認可の収集センターで収集されました。
   1. 赤血球(RBC)からヘモグロビンを分離し、血液からできるだけ多くの水分を除去するには、まずヘパリン化したヒト全血1,800μLを微量遠心チューブにピペットで入れ、9.6 × g で10分間遠心分離します。
      注:約4〜6本の微量遠心チューブが推奨されます
   2. 遠心分離後、微量遠心分離機からチューブを取り出し、遠心分離した血液サンプルから上清(約850μL)をペレットを乱さずに取り出して廃棄します(図2)。上清は、赤血球ペレットの上の液体(主に血漿と血小板)で構成されています。微量遠心チューブの底にある赤血球ペレットを探します。
   3. 各ペレットを、廃棄された上清の量と同じ量の重水素化水で再構成します。再度9.6 × g で10分間遠心分離します。
   4. 遠心分離機からチューブを取り外し、ペレットを乱さずに上清を捨てます。
   5. 廃棄された上清の量と同じ量の重水素化水でペレットを再構成します。9.6 × g で10分間再遠心分離します。
   6. 遠心分離機からチューブを取り外し、ピペットを使用して上清を取り除き、廃棄します。
   7. 赤血球(RBC)の溶解:RBCペレットを大量の(4.5 mL)重水素水で再構成すると、低張バーストが発生します。ペレットがチューブに付着している場合は、測定した4.5mLの重水素水の一部ですすいでほぐします。
      注:上清の量は、各遠心分離ステップ後に増加します。この上清の量は、800 μLから1,600 μLの範囲です。溶解用の重水素水の量は、目的のサンプル濃度によって変わる可能性がありますが、低張バーストを引き起こすのに十分な高さである必要があります。
   8. 溶解した血液溶液を針と注射器でチューブから取り出します。次に、先端が鈍いシリンジ針を慎重に取り外し、バイオハザードシャープ容器に廃棄します。.シリンジを0.22 μmシリンジフィルターに接続し、シリンジの内容物をフィルターを通して10 mmの光路長3.5 mLガラスまたは石英キュベットに押し込みます。
      注:フィルタリングステップは、溶液中の細胞小器官と膜をフィルタリングすることにより、サンプルからの光散乱を最小限に抑えます。サンプルの濃度が高く、シリンジフィルターが押しにくくなった場合は、シリンジフィルターを複数台使用してください。
   9. キュベットを気密ストッパーでキュベットに固定し、空気からの水蒸気がサンプルを汚染するのを防ぎます。ストッパーの外側にパラフィルムを貼ることで、汚染をさらに防止し、気密シールを確保します。
      注:600 nm〜1,600 nmの測定では、約1,200〜1,600 μLのペレットを4.5 mLの重水素化水に溶解すると、定性的にクリーンな測定が得られます。
      注:予想される吸光度が高いスペクトル領域(400 nm〜600 nm)の場合、サンプルを重水素化水を使用して希釈して、非飽和吸光度値を取得し、吸光度値が検出器の線形範囲内にあることを確認する必要があります。さらに、サンプルとリファレンスは、短いパス長のキュベット(1 mmまたは2 mm)に配置する必要があります。ここに示すスペクトルについて、サンプルを400〜500 nmで10倍、500〜600 nmで5倍に希釈し、2 mmの光路長キュベットで測定しました。
      光路長が短い(1mmまたは2mm)ため、吸収率の高い波長での光の吸収が少なくなり、一部の光子が検出器に透過し、線形検出範囲内に留まることができます。
   10. ろ過された血液溶液を含むサンプルキュベットと同じ経路長と体積のきれいなキュベットを入手し、ベースラインおよび参照測定のために重水素化水で満たします。異なるスペクトル範囲のキュベットのパス長を変更する場合は、キュベットのパス長ごとに新しい参照スペクトルを記録します。
5. 全ヘパリン化ヒト血液を用いた脱酸素化ヘモグロビン試料の調製
   1. 手順1.4.1〜1.4.8に従います。
   2. キュベットの血液溶液にジチオン酸ナトリウムを加え、穏やかに攪拌します。キュベットを気密ストッパーでキュベットに固定し、空気からの水蒸気がサンプルを汚染するのを防ぎます。ストッパーの外側にパラフィルムを貼ることで、汚染をさらに防止し、気密シールを確保します。キュベットを左右に慎重に傾けて、ジチオン酸ナトリウムが溶液に溶解することを確認します。血液溶液は赤色から濃い紫赤色に変わります。
      注:ヘモグロビンを完全に脱酸素化するには、必要なジチオン酸ナトリウムの質量は、血液溶液1mLあたり約0.007gです。Briley-Sӕbø と Bjørnerud によると、全血を完全に脱酸素化するには、少なくとも 2.5 mg のジチオン酸ナトリウム/g の血液が必要です¹⁸。しかし、この濃度はここでの研究では不十分であることがわかりました。全血の約3.4 mg / gの濃度は、光散乱の導入なしに血液溶液を完全に脱酸素化することがわかりました。.400〜600nmの測定では、血液溶液を重水素化水で希釈する必要があります。希釈後の量ではなく、使用したbood溶液の量に基づいて、必要なジチオン酸ナトリウムの質量を計算します。600 nm〜1,600 nmの測定では、約1,200〜1,600 μLのペレットを4.5 mLの重水素化水に溶解すると、高いSNR測定が得られます。
      光路長が短いキュベット(1mmまたは2mm)は、吸収率の高い波長での光吸収が少なくなり、一部の光子が検出器を通過し、線形検出範囲内に留まるのに役立ちます。
   3. ベースラインおよび参照測定のために、ろ過された血液溶液と重水素化水を含むキュベットとして、経路長が一致する別のキュベットを満たします。異なるスペクトル範囲のキュベットのパス長を変更する場合は、キュベットのパス長ごとに新しい参照スペクトルを記録します。

2. 高品質な吸収測定が可能

1. セクション1で説明されているようにサンプルと参照を準備し、VIS NIR-SWIR測定のためにガラスまたは石英キュベットに入れます。分光計のランプと検出器をオンにし、分光計システムと光源に応じて、システムを少なくとも5〜20分間ウォームアップします。
   注:5分間で、本明細書で収集されたスペクトルに対して十分な検出器冷却およびランプ出力安定性が得られましたが、これは吸光度測定値を捕捉する前に、各システムについて特性評価する必要があります。
   この収集期間中は、サンプルと参照を手元に置いてください。キュベットの蓋がしっかり閉まっていることを確認してください。周囲光による吸収測定の歪みを防ぐために、測定スペースはできるだけ暗くしてください。
2. VIS-SWIR 全体の吸収の大きな変動により、スペクトルの異なる領域に対して次の手順を繰り返します。
   1. デュアルビーム構成(サンプルとリファレンス用に2つの別々の検出器)を使用している場合は、システムがベースライン化されていることを確認してください。溶媒を含む同一の参照サンプルを各検出器の前に置いてベースラインを取得し、サンプル吸光度スペクトル収集に使用する正確な取得パラメータを使用して吸光度測定値を収集します。検出器は理論的にはゼロ吸収を示すはずですが、通常は完全ではありません。同じ設定を使用して取得したすべてのサンプル吸光度スペクトルから、結果の吸光度スペクトルを減算します。
      注:データ収集の集録設定が変更されるたびに、ベースラインを繰り返す必要があります。
   2. サンプルを分光器にセットし、測定する領域(VIS-NIR = シリコンまたはUV-VIS PMT、SWIR = InGaAs)に関連する検出器を選択し、測定パラメータの調整に応じて測定値が継続的に更新される ライブモードで吸光度を表示します。
   3. デフォルトの分光計パラメータから始めて、飽和のない定性的にクリーンな吸収スペクトルが得られるまで、 入射光量 と 露光時間 を調整します。
      1. パラメータを調整しても質的にクリーンなスペクトルが得られない場合は、 入射光量、露光時間、光路長、 サンプル濃度などのパラメータを変更します。まず、 パワー と 露光時間を調整してみてください。これらのパラメータを調整してもSNRスペクトルが高くならない場合は、 サンプル濃度 またはサンプルとリファレンスの 光路長 を変更してください。
         注:ここに示されているスペクトルの収集に使用されたデフォルトのパラメータは、400 nmで 15 nW 、1,000 nmで 20 nW の入射光出力、 30 msの露光時間、 10 mmのキュベット経路長、およびサンプル比濃度:100%水、メラニン1.7 mg / mL、100%コーン油、酸素化ヘモグロビン(15.9 g / dL)、 脱酸素化ヘモグロビン(15.9 g / dL)。
      2. SNR を上げるには、データ ポイントごとに平均されるデータ読み取りの数を増やします。平均化されたデータ読み取り数が多いほど、測定あたりの時間が長くなります。
      3. スペクトル分解能を上げるには、測定のステップサイズ(nm)を分光器の分解能限界まで下げます。これにより、測定あたりの時間が長くなります。さらに、入射光電力帯域幅を、最も狭いピークの全^{幅の 1}/10 (半値¹⁹) に縮小します。
      4. サンプルの測定設定が最適化されたら、取得した各スペクトル の設定 を文書化します。
      5. スペクトルを取得するには、最適化された設定を使用して、リファレンスのみを測定します。次に、基準キュベットをサンプルキュベットに交換し、別の測定を行います。参照測定値とサンプル測定値の両方を別々に保存してください。
         注:基準測定値が飽和しないことが不可欠です。その場合は、飽和状態になるまで入射光電力および/または露光時間を短縮します。基準測定とサンプル測定の間ですべてのシステムパラメータを同じに保ちます。一方を変更する必要がある場合は、もう一方もそれに合わせて繰り返す必要があります。
      6. 参照測定値とサンプル測定値のペアセットごとに、参照測定値をI_o、サンプル測定値をIとして扱い、吸光度A(式1)を計算します。
      7. サンプル濃度や光路長の違いが必要な異なる領域をつなぎ合わせるには、スペクトル領域の1つに乗算係数を適用します。たとえば、濃度が 1/10 で、経路長が 2 番目の領域と同じである最初の領域の場合、最初のスペクトル領域に 10 を掛けて、2 つの領域を一緒に適切にスケーリングします。
         注:乗算係数は、領域間の濃度および/または経路長の差である必要があります。
      8. 光路長や濃度の違いをスペクトルで補正したら、2つのスペクトル領域で重なり合う波長を選択して、2つの領域をつなぎ合わせます。
      9. 2つのスペクトルを切り捨てて、オーバーラップ波長で終了します。遷移スペクトル値を含めるスペクトルを 1 つ選択します。2 つの切り捨てられたスペクトルを連結して、より広い波長範囲の 1 つのスペクトルを作成します。

結果

データは、WUSTL Digital Research Materials Repository (DRMR) doi: https://doi.org/10.7936/6RXS-108249

水のスペクトル特性評価
最も一般的な生物学的吸収体の1つである水は、NIRとSWIRに特徴的で吸収性の高いピークを持っています。これらの特性ピークは非常に強いため、水の吸光度を測定するときは、飽和を防ぐために重水素水で希釈する必要があることがよくあります。水と重水素化水との間の吸光度の差を 図3に示し、重水素化水に対する吸水率の桁違いの増加を強調しています。SWIRでの強い吸水は、サンプルに水を含む、または溶媒および参照として水を使用する他の生物学的吸収体の吸収スペクトルを取得することも困難にします。この問題を解決するために、水の代わりに重水素化水を使うことができます。重水素化水は水と同様に作用しますが、SWIR吸収体ははるかに弱いため、SWIR分光測定では水の理想的な代替品となります。

水の吸収スペクトルを測定するために、水をサンプルとして使用し、重水素化水を基準として使用しました。SWIRの飽和を防ぐために、サンプルはSWIR領域で重水素水で希釈されました。結果として得られる吸水スペクトルは、VISでの吸収が低く、より長い波長で増加します。約750 nm、970 nm、1,200 nm、1,450 nmに特徴的な吸収ピークが見られます(図4)。得られた水スペクトルのSNRは3536.6で、Hale and Querryの吸水スペクトル²⁰と比較すると、~500 nmから1,600 nmまで同様の吸収曲線が示されました。ただし、400 nmから500 nmでは、吸収曲線は異なり、HaleとQuerryは低波長でより高い吸光度値を示しています。この違いは、水中に残留する小さな粒子が、長波長3と比較して短波長でより高い散乱を持つためである^{可能性があり、ラン} ベルトビールの法則に基づく吸収測定で散乱がないという仮定を無効にする可能性があります。

メラニンのスペクトル特性評価
皮膚の主要な光吸収体であるメラニンは、粉末メラニンをサンプルとして、DMSOを溶媒および参照として使用してスペクトル特性評価されました。得られたスペクトルのSNRは172で、Sarnaら^21,22およびCrippaら²³のユーメラニンデータと比較しました(図5)。ユーメラニンは肌の色に関与する主要な色素であるため、メラニンが光学デバイスにどのように影響するかについて最も正確なデータを提供します。本明細書に記載のプロトコルを用いて収集されたスペクトルは、これらの文献値と高い相関を示す。

コーン油のスペクトル特性評価
脂質の吸収スペクトルを調査するために、コーン油は、他の脂質と比較した場合の光散乱が最小限であり、化学組成が動物性脂肪1に類似していることが知られているため、コーン油が選択され^ました。コーン油の吸収スペクトルを取るために、コーン油をサンプルとして使用し、空気を基準として使用しました。 図6に見られるように、コーン油のスペクトルには、約930 nm、1,210 nm、および1,410 nmに特徴的なピークが含まれています。得られたコーン油スペクトルのSNRは10363.1で、Caoらのコーン油スペクトル¹と重ね合わせると、強い相関関係が見られました。

酸素化および脱酸素化ヘモグロビンのスペクトル特性評価
酸素化ヘモグロビンと脱酸素化ヘモグロビンの吸収の特性評価は、生物医学光学における最も重要な偉業の1つですが、VISからSWIRまでの吸収スペクトルはよくわかっていません。SWIR中の酸素化ヘモグロビンと脱酸素化ヘモグロビンの吸収スペクトルを決定する上で最も困難な側面の1つは、血液中の水分を除去することであり、これは比較的小さなヘモグロビンの吸収を圧倒します。ヘモグロビンと水の吸収率を解きほぐすために、まず遠心分離法を用いてヒト全血からヘモグロビンを単離し、上清を除去して重水素化水に置換しました。重水素化水は、ヘモグロビンが再構成されて低張バーストを引き起こすための基準および溶媒としても使用されました。 図3に示すように、重水素化水は水よりもはるかに光吸収が低いため、SWIR吸収測定の理想的な溶媒および基準となります。得られた酸素化ヘモグロビンスペクトルは、SNRが23118.7でVISからSWIRにまたがり、Prahl氏が発表した酸素化ヘモグロビンスペクトル⁴ (図7)と非常に密接に一致しました。VISでは、酸素化ヘモグロビンスペクトルは高い吸収を示し、約415 nmに特徴的な吸収ピーク、約540〜575 nmにダブレットピークを示します。NIRでは、酸素化ヘモグロビンスペクトルは、約800nmから1,100nmのより広い波長範囲にわたる特徴的なピークを示します。SWIRでは、ヘモグロビンの吸収は低いです。しかし、約1,400 nmから1,600 nmまでは、ヘモグロビンスペクトルはピークでより高い吸収を示しますが、これはおそらくヘモグロビン中の水分が遠心分離プロセス中に完全に除去できなかったためです。

脱酸素化ヘモグロビンについては、ヘモグロビン溶液にジチオン酸ナトリウムを添加して、酸素化ヘモグロビンから二酸素を解離させ、サンプルを脱酸素化ヘモグロビンに変換しました。得られたスペクトルのSNRは9813.9で、Prahlの脱酸素化ヘモグロビンスペクトルと比較したところ、400 nmと1,000^nmの間に 非常に強い相関関係が示されました4(図8)。得られた脱酸素化ヘモグロビンスペクトルは、約430 nm、560 nm、および760 nmに特徴的な吸収ピークを示します。この後、脱酸素化ヘモグロビンの吸収は低下しますが、1,200 nm付近と1,400 nmから1,600 nm付近の小さな吸収ピークが含まれます。1,400〜1,600 nmの吸光度は、遠心分離プロセス中にヘモグロビンサンプルから完全に除去されなかった水が原因である可能性があります。

VIS-SWIRからの生物学的吸収体の比較
このプロトコルで特徴付けられるすべての生物学的吸収体からの完全なVIS-SWIRスペクトルを 図9に示し、組織²中の生物学的濃度に基づいてスケーリングし、生物学的吸収体間の明確なスペクトルの違いを強調しています。例えば、メラニン、酸素化ヘモグロビン、脱酸素化ヘモグロビンは、VISで強く特徴的な吸収を持ち、一般的に波長とともに減少しますが、水と脂質はNIRとSWIRで特徴的なピークを示します。生体組織では、メラニンとヘモグロビンの減少、および光散乱の減少が組み合わさることで、NIRとSWIRの光学透過深度が増加します。さらに、NIRとSWIRのメラニン吸収の減少により、皮膚の色素沈着による影響を最小限に抑えて、酸素化および脱酸素化されたヘモグロビン、脂質、および水を光学的に調査できます。

図1:以前に発表された、UVからSWIRまでの一般的な生物学的吸収体のスペクトル。 酸素化ヘモグロビンスペクトルと脱酸素化ヘモグロビンスペクトルは、Prahl⁴のデータを使用してプロットされました。メラニンスペクトルは、Sarna²¹ およびCrippa²³のデータを使用してプロットされました。脂質スペクトルは、van Veen²⁴のデータを使用してプロットしました。水スペクトルは、Hale and Querry²⁰ のデータを使用してプロットされました。略語:SWIR=短波赤外線。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:遠心分離した全血の上清と赤血球ペレットの写真。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:log(左)と線形(右)の吸光度スケールで同じ取得設定で収集された水と重水素化水の吸光度スペクトルの比較。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:本書に記載されている方法とHale and Querry²⁰を用いて取得された水吸光度スペクトルの比較。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図5:本明細書に記載されている方法を使用して取得されたメラニン吸光度スペクトルとSarnaら^21,22およびCrippaら²³の比較。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:本明細書に記載されている方法とCaoら¹を用いて取得されたコーン油吸光度スペクトルの比較1。 この 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:本明細書に記載されている方法を用いて取得された酸素化ヘモグロビン吸光度スペクトルとPrahl⁴の比較。 1,400 nmから1,600 nmのスペクトルの特徴は、サンプル中の残留水に起因する可能性があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図8:本明細書に記載されている方法を用いて取得された脱酸素化ヘモグロビン吸光度スペクトルとPrahl⁴の比較。 1,400 nmから1,600 nmのスペクトルの特徴は、サンプル中の残留水に起因する可能性があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図9:一般的な生物学的吸収体のVIS-SWIRスペクトル。 略語:VIS-SWIR =可視短波赤外線。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この記事で概説されているプロトコルは、生物学的吸収体および造影剤のVIS-SWIR吸収スペクトルを取得するために使用できます。ここでは、400 nmから1,600 nmにわたる水、メラニン、コーン油、酸素化ヘモグロビン、および脱酸素化ヘモグロビンのスペクトルを取得するための具体的な手順を示します。以下の説明では、重要なステップ、測定の最適化のためのヒント、メソッドの限界、およびバイオメディシン内でのこのプロトコルの応用について説明します。

すべてのプロトコルステップは重要ですが、このプロトコルで正確なスペクトルを取得するには、いくつかの重要なステップに従う必要があります。まず、サンプルは非散乱性でなければなりません。例えば、血液から酸素化ヘモグロビンおよび脱酸素化ヘモグロビンを得る場合、サンプル中の散乱体を濾過する必要があります(ここでは、0.22μmシリンジフィルターを使用しました)。脱酸素化ヘモグロビンを調製する場合、添加されるジチオン酸ナトリウムの量は、より高い重量パーセンテージでサンプルを濁らせ、ランベルトビール法の要件を無効にするため、提供された重量を超えてはなりません。

次に、重水素化水は、ヘモグロビンなどの水溶性溶質のサンプル溶媒および参照として使用する必要があります。SWIRでは吸水率が強く、他の吸収剤を覆い隠すことができます。第三に、検出器の線形範囲(検出器に到達する光子の変化が検出器信号の線形変化をもたらす領域として定義される)内で測定値を取得する必要があります。最小の吸収が発生すると、検出器は、吸光度が発生していても、吸光度がゼロを記録することがあります。これは、サンプルが希薄すぎる、露光時間が短すぎる、キュベットの光路長が短すぎる場合に発生しますが、サンプル濃度、キュベットの光路長、および/または露光時間を増やすことで改善できます。同様に、高い吸収が発生した場合、検出器は光子を記録せず、吸光度の変化に敏感でない「飽和」と呼ばれる平坦な線を生成する可能性があります。これは、サンプルの濃度が高すぎる、露光時間が短すぎる、および/または光路長が長すぎる場合に発生しますが、サンプル濃度を上げる、露光時間を増やす、および/またはキュベット光路長を短くすることで修正できます。

第 4 に、使用する検出器は線形である必要があります。検出器に到達する光子の数に対して検出器が線形応答を示すかどうかが不明な場合は、サンプルのさまざまな希釈値を同じ取得設定で測定して、それらの吸光度値が吸光度と濃度の間の予想される線形傾向を示しているかどうかを確認できます。あるいは、単一のサンプルを測定し、露光時間を長くして、検出器の強度が直線的に増加するかどうかをテストすることもできます。どちらのテストも、ユーザーがその線形制限内で操作している場合、線形関係を生成する必要があります (上記の 3 番目の重要なポイントを参照)。

第5に、VIS-SWIRスペクトル範囲全体にわたって検出器の線形範囲内にとどまるためには、サンプル濃度、検出器の露光時間、および/またはキュベット光路長を、開始スペクトル領域からの吸光度が著しく高いまたは低いスペクトル領域ごとに変更する必要があります。

第 6 に、異なるスペクトル領域に対して異なるサンプル濃度または光路長を使用して取得したスペクトルは、濃度または光路長の既知の変化に基づいて 1 つの領域を線形スケーリングすることによってつなぎ合わせる必要があります。スケーリング後、スペクトルは2つの領域間で重なり合う波長でつなぎ合わせる必要があります。測定が異なる検出器からの測定にまたがる場合、目的の検出器遷移波長を含む吸光度スペクトルが重なり合う必要があります(UV-VISおよびSWIR領域をステッチする場合は800nmが一般的に使用されます)。各スペクトルは検出器の遷移波長で切り捨てられ、1つのスペクトルが元の検出器遷移吸光度値を含むように選択されます。次に、2つの切り捨てられたスペクトルが連結されて、1つの細長いスペクトルが作成されます。

高品質の吸収スペクトルを取得するためのその他のヒントには、測定対象の全スペクトル範囲をカバーしていない場合でも、対象サンプルの以前に公開されたスペクトルを使用して測定をガイドすることが含まれます。吸光度が最も低い波長範囲を 先験 的に把握しているため、この領域で最高濃度のサンプルで測定を開始し、そこから調整して希釈することができます。これは、予想される吸光度の変化の大きさに基づいて、測定する必要がある個別の領域の数を通知するのに役立ちます。また、期待されるスペクトルが公表されたスペクトルと一致する場合、または公表されたスペクトルと一致しない場合は、サンプル調製方法を再検討し、スペクトルを歪める可能性のある問題も確認できます。

吸収スペクトルは、後処理が必要な場合があります。たとえば、デジタル移動平均フィルタを使用して吸収測定を平滑化したり、既知のエラーのポイントをデータセットの修復で削除したりして、エラーのないポイント間で補間を実行できます。

この方法の限界には、全血などの光散乱を伴うサンプルの精度が悪いことが含まれます。ヘモグロビンを正確に測定するために、血液サンプルを溶解し、次にシリンジでろ過して、光散乱を引き起こす他のほとんどの残留細胞成分を除去します。同様に、この方法は組織飛散のためにin vivoでは使用されません。ランベルトビールの法則に基づく吸光度測定は面倒で、時には難しい場合もありますが、純粋な光吸収測定のゴールドスタンダードな方法です。さらに、一部の溶媒では、特定の溶質の純粋な吸光度スペクトルを取得することが特に困難です。例えば、酸素化ヘモグロビンと脱酸素ヘモグロビンの天然溶媒は水ですが、SWIRでは水の吸収が強く、酸素化ヘモグロビンの吸収が支配的です。そこで、遠心分離を繰り返し、上清を除去し、SWIR吸収の弱い重水素水で再溶解することで、血液中の水分を除去しようと試みます。図3に示すように、全ヘパリン化ヒト血液から得られた酸素化および脱酸素化ヘモグロビンスペクトルには、約1,300 nmから1,600 nmの水吸収によるわずかな残留吸収が含まれていることが疑われます。酸素化ヘモグロビンおよび脱酸素化ヘモグロビンからの水の完全なもつれの解き方ではない可能性が高いですが、400 nmから1,000 nmまでの高度に引用された公開された酸素化および脱酸素化ヘモグロビンスペクトルとの密接な一致が観察され、スペクトルが数百ナノメートル拡張されます^2,3。

本明細書に記載されているプロトコルは、研究者が吸収スペクトルライブラリを拡張して、多くの生物学的成分および造影剤のVIS-SWIRスペクトルを含めるのに役立ちます。この知識は、非侵襲的な生物医学イメージングと、現在ほとんどのシステムが動作しているよりも深い波長でのセンシングを通じて、基本的な生物学と生理学の理解を深めるために使用できます。SWIR波長の追加により、非侵襲的にモニタリングできる組織成分の種類が広がり、新しいモニタリングと診断の開発に役立つ可能性があります。さらに、NIRおよびSWIRで動作するデバイスは、VISおよびNIR範囲で動作する光学デバイスで報告されている皮膚の色素沈着バイアスを最小限に抑えるのに役立ち、公平な医療機器を作成するための有望な戦略です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.22 以上m径シリンジ	フィルターSigma-Aldrich	SLGPM33RS
1000 µL ピペット	ミリポア シグマ	EP3124000121
200 & マイクロ;L ピペット	ミリポア シグマ	EP3124000083
コニカルチューブ	アバンター VWR	21008-089
コーンオイル	ハッピーベリー	n/a	48 液量オン
酸化重水素	ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ	DLM-4-100
酸化重水素	Sigma-Aldrich	7789-20-0
ジメチルスルホキシド (DMSO)	Sigma-Aldrich	D5879-1L
ディスポーザブル 1 mL シリンジ	BH サプライ	BH1LL
ディスポーザブル ニードル	Atshuhut/Amazon	66941
フリーザー (-80 °C)	フィッシャーサイエンティフィ	IUE386FARK
ガラスビーカー	ミリポアシグマ	CLS1000PACK
ガラスまたは石英キュベットシ	グマアルドリッチ	Z802875-1EA	700&マイクロ;L容量
ガラスまたは石英キュベット	Thorlabs		CV10Q35EP 3500mL容量
ヘパリン処理ヒト血液	ランプ 7203710
微量遠心チューブ	Costar	3213
微量遠心分離機--accuSpin Micro 17	Fisher Scientific	13-100-675
MilliQ Water	Millipore Sigma	ZMQSP0D01
OSRAM FCS 64640 150 W 24 V HLX ハロゲン電球	Amazon	B0001221DG
Parafilm	ミリポア シグマ	HS234526B
ピペットチップ	エッペンドルフ	22492055
粉末合成メラニン	Sigma-Aldrich	8049-97-6
スケール	ザルトリウス	UX-11976-09
ジチオナイト	ナトリウムシグマ・アルドリッチ	1065070500
ソニケーター	フィッシャーサイエンティフィ	CPX1800
スパチュラ	Aozita	000 00 0 1 2 3
UV/VIS/SWIR 分光光度計	オンライン 計器システム	Olis Cary 14
Weigh Boats	Amazon