このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

繊毛形成の細胞モデルにおけるソニックヘッジホッグシグナル伝達を測定するための定量的PCRベースアッセイ

1.3K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/67407

⸱

2025年1月31日

 , 
1CellBio Lab, Institute of Health Sciences, Presidency University

この記事について

サマリー

この研究は、繊毛形成の細胞モデルにおけるSHHアゴニストを用いた一次繊毛媒介性ソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達経路活性化のための定量的PCRベースのアッセイを実証しています。

要約

繊毛症とは、微小管ベースの細胞突起である運動性または非運動性(一次性)繊毛の構造または機能の異常により生じる、多系統性および多遺伝子性のヒト疾患および障害の集合体を指します。一次繊毛(PC)は、ほとんどのヒト上皮組織および内皮組織に存在し、ソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達を含む生理学的シグナル伝達のハブとして機能します。さまざまな状況でPCの機能を調べる必要がありますが、これは、PCによってほぼ独占的に媒介される標準的なSHHシグナル伝達経路を測定することによって達成される可能性があります。ここでは、主にPCを含む静止期のhTERT-RPE1(またはRPE1)細胞におけるSHH経路遺伝子の転写レベルを測定するための定量的PCR(qPCR)ベースの技術が開発されています。RPE1細胞の静止は、48時間の血清飢餓によって達成されますが、SHH経路の活性化は特定のアゴニストによって促進されます。この細胞培養ベースのアッセイは、追跡が容易で感度が高いです。繊毛RPE1細胞におけるこのアッセイの成功した実証は、さまざまな繊毛障害に関連する可能性のある1つまたは複数の遺伝子の遺伝的またはエピジェネティックな変化に対するPCの適切な機能を調べるin vitro アッセイとしてのその計り知れない可能性を示しています。

概要

繊毛は、細胞表面からの微小管ベースの膜被覆突起であり、基底体1上に組み立てられています。脊椎動物では、運動性と非運動性の2種類の繊毛が観察されます。運動性繊毛は特殊な組織に位置し、運動性を与えます。非運動性の一次繊毛(PC)は、ほとんどの脊椎動物細胞に存在し、感覚機能を果たし、細胞外環境から細胞内部に重要なシグナルを伝達します2。組み立てられると、毛様体伸長は、キネシン(順行性運動)とダイニン-IIモータータンパク質(逆行性運動)によって駆動される貨物を運ぶ双方向輸送システムである鞭毛内輸送(IFT)機械によって助けられます3,4。運動性繊毛または一次繊毛の構造的または機能的欠陥は、繊毛症と総称される多数の多系統性ヒト疾患につながる可能性があります5,6。

PCは、Wingless(Wnt)、G-protein-coupled receptors(GPCR)、receptor-tyrosine kinases(RTK)、Transforming growth factor β of s(TGFβ)、Platelet-derived growth factor(PDGF)シグナル伝達など、さまざまな発生シグナル伝達プロセスのハブとして機能します7,8。哺乳動物では、ソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達は重要なものであり、PC9,10,11を含む細胞内では、ほぼ独占的にPCによって形質導入されます。PCの構造または機能の異常は、先天性心疾患、多発性嚢胞腎、頭蓋顔面異常、網膜ジストロフィーなどの疾患、およびバルデ・ビードル症候群(BBS)、ジュベール症候群(JBTS)、アルストロム症候群、ジューヌ窒息性胸部異形成(JATD)などのいくつかのまれな疾患に関連するシグナル伝達経路の減衰につながります12,13,14,15.これらのほとんどは上皮組織または内皮組織の多遺伝子性疾患であり、これらの疾患の早期診断と治療に課題をもたらします。このような変異が細胞培養モデルにおけるPC媒介シグナル伝達の減弱にどのように寄与するかを明らかにすることは、そのシグナル伝達経路の分子的複雑さについての洞察を提供するだけでなく、さまざまな繊毛症の診断を容易にし、治療的介入を示唆する可能性があります。この概念により、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素 (hTERT) 不死化網膜色素上皮細胞 (hTERT-RPE1、ここでは RPE1) における PC 媒介性 SHH シグナル伝達経路の変化を決定するための定量的 PCR (qPCR) ベースのアッセイが開発されています。RPE1細胞は、RPE1細胞の非同期増殖培養物におけるわずか15%〜18%の繊毛と比較して、これらの細胞の約75%〜80%が血清飢餓(無血清培地中で細胞をインキュベート)すると24〜48時間PCを組み立てるので、繊毛形成の細胞モデルとして広く使用されている、ほぼ二倍体、非形質転換ヒト細胞である16。

ハリネズミシグナル伝達(HH)は、胚発生のために脊椎動物間で保存されています17。哺乳類では、ソニック(SHH)、インディアン(IHH)、デザート(DHH)の3種類のヘッジホッグシグナル伝達が見られ、そのうちSHHとIHHは組織レベルで重複する機能を示しています11。SHHシグナル伝達は、神経系における四肢のパターン形成および細胞型の仕様を調節し、成体組織の恒常性を維持することにより、胚発生において重要な役割を果たす10,11,18。SHHシグナル伝達は複雑ですが、標準的なSHHシグナル伝達がPC7,11,19に依存しており、これはGli転写因子(Gli1、Gli2、およびGli3)の集合機能によって媒介されていることを示唆する証拠が増えています。HHシグナル伝達とPCは共進化しており、重要なシグナル伝達成分が繊毛先端のコンパクトなボリュームに集中して、低いリガンド比に対する効果的な応答を可能にしていることが示唆されています11。

SHHリガンドがない場合、PCメンブレンに局在するPatched1(Ptch1)は、脂質輸送が関与している可能性が高いよく理解されていないメカニズムを通じてSmoothened(Smo)の活性を阻害し、経路を抑制したままにします7,20。G共役タンパク質受容体であり、システムの負の調節因子である構成的に活性な繊毛GPR161は、プロテインキナーゼA(PKA)21の活性を増加させる高レベルの繊毛環状AMP(cAMP)を保持し、PKA7の繊毛局在を維持することにより、抑制が維持されることを保証します。PKA活性は、カゼインキナーゼ1(CK1)およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ3 β(GSK3β)とともに、PC内のGliタンパク質Gli2およびGli3の複数の残基をリン酸化します。Gli2およびGli3は、標的遺伝子の転写の活性化因子および抑制因子の両方として作用することができます。PKAを介したリン酸化は、Gli2の活性化因子機能の阻害を引き起こすが、リン酸化されたGli3はプロテアーゼによって切断され、リプレッサー形態のGli3R22を生成する。全体として、SHH標的遺伝子の発現はそのような条件で抑制されます。

SHHリガンドが存在すると、Ptch1が結合し、GPR161がPCから出て、Gタンパク質共役受容体(GPCR)キナーゼ2(GPRK2)とCK1によってリン酸化されたSmoは、β-アレスチンと微小管モーターKIF3A23とともにPCに輸送されます。これと協調して、毛様体先端でのGli2/3、Suppressor of Fused(SUFU)、およびKif7の局在化が促進され、Gli2/3切断の減少と関連し、それによってGli2/3の活性化因子機能が向上します24,25。活性化されると、Gli2/3は、活性化因子としてのみ機能できるGli1の発現を誘導し、それによりSHH経路22の応答を増幅する。SHHのPtch1への結合は、CAM関連/がん遺伝子によるダウンレギュレーション(CDO)、CDOの兄弟(BOC)、増殖停止特異的1(GAS1)、および低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質2(LRP2)によって促進されます。逆に、ヘッジホッグ相互作用タンパク質(HHIP)は、SHHと直接相互作用することでSHHを隔離することができ、また、SHH26と相互作用することでPtch1と競合します。重要なことは、GLI1、HHIP、およびPTCH1はSHH経路の活性化時に転写されるのに対し、最後の2つはSHH経路の負の調節に関与することです。

以前の研究では、SHH標的遺伝子の転写レベルを測定してSHH経路を評価することができることが示されたが、それは異なる細胞タイプで有意に異なる可能性がある27,28。SHH経路応答のこのような変動は、PCが介在するSHHシグナル伝達と細胞膜により媒介されるSHHシグナル伝達の異なる組み合わせに起因する可能性があり、おそらくPCが存在しない。SAGは、この方法で使用されるSmoアゴニストであり、主に繊毛のある血清飢餓状態のRPE1細胞におけるSHHシグナル伝達の活性化を模倣します。HHIP、GLI1、PTCH1などのSHH標的遺伝子と非標的遺伝子SMOの転写レベルを、コントロール細胞とSAG処理細胞でqPCRを使用して測定し、SHH経路の活性化を決定するために比較しました。この細胞培養ベースの高感度アッセイによるPC媒介SHHシグナル伝達の測定の成功例は、一次繊毛機能に関連する生物医学研究への有望な応用を示唆しています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1. 細胞培養

  1. RPE1細胞のほぼコンフルエントなT-25細胞培養フラスコを、元の培養液の1:5希釈で、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%ペニシリン-ストレプトマイシンミックス(最終濃度-100 U / mLペニシリンGおよび100μg / mLストレプトマイシン)を補充した5 mLのダルベッコ改変イーグルス培地(DMEM)を含む新鮮なT-25細胞培養フラスコに継代します。この媒体は、完全な媒体と呼ばれます。5% CO2の存在下で37°Cで細胞を増殖させます。
    注:RPE1細胞は、細胞培養におけるPCの組み立てと分解の分子調節を研究するために一般的に使用される非形質転換細胞です。RPE1細胞の約80%は、血清飢餓時にPCを組み立て、血清16の再添加時に再びPCが分解されます。
  2. 12 mmの丸型ガラスカバースリップは、ウォーターバスまたはインキュベーターで60°Cで振とうせずに、蓋付きガラスビーカーで1 N HClの50 mLにインキュベートして調製します。
  3. 翌日、25mLのピペットを使用して、酸性溶液をピペットで取り出し、化学薬品の危険容器に適切に廃棄します。次に、カバーガラスを100 mLの蒸留水で3回洗浄し、15分間インキュベートし、時々振とうした後、ピペッティングで洗い流します。
  4. 70%エタノールと95%エタノールで洗浄手順を繰り返します。カバースリップをバイオセーフティキャビネット内の実験室用あぶらとり紙に個別に置いて乾燥させます。乾燥したら、UV照射で60分間滅菌します。

2. 細胞増殖、血清飢餓、SAG治療

  1. 予め温めた0.25%トリプシン-EDTA溶液の酵素活性によって細胞を脱落させた後、予め温めた完全な培地でT-25フラスコ内の細胞を再懸濁します。血球計算盤を使用して細胞をカウントすることにより、懸濁液の細胞密度を決定します。
  2. 35 mm細胞培養ディッシュを2つ調製し、それぞれに滅菌済みの12 mmカバースリップを2枚入れます。継代:2 x 105 coverslipsを含む各35 mmディッシュでRPE1細胞を非同期に増殖させ、2 mLの完全培地で細胞を24時間増殖させます。
  3. 24時間後、増殖中のRPE1細胞の培地を取り出し、予め加温した1mLのDPBSバッファーで細胞を1回洗浄します。1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含み、FBS(無血清培地)を含まない予熱したDMEM培地2 mLを各ディッシュに加え、細胞を5%CO2の存在下で37°Cで24時間インキュベートします。
  4. 24時間後、培地を最終濃度250 nMのSAGまたはコントロール溶媒としてDMSOを含む無血清培地と交換し、細胞をさらに24時間インキュベートします。細胞培養プロトコルの漫画図を 図1Aに示します。

3. 細胞コレクション

  1. カバースリップを、各ウェルに1枚のカバースリップがある24ウェルプレートに移します。各ウェルに0.5 mLの冷却メタノールを加え、プレートを-20°Cで10分間インキュベートして、細胞をカバーガラスに固定します。直後に、カバーガラスを0.5 mLの洗浄バッファー(0.5 mM MgCl2 および0.05% Triton-X 100を含む1x PBS)で3回洗浄します。
  2. 培地を廃棄し、0.5 mLのトリゾール試薬を各皿に直接加えます。均等に分散させ、5分間保管します。ピペットを数回上下させて均質な混合物を作り、1.5 mLのヌクレアーゼフリー微量遠心チューブに回収します。

4. 全RNAおよびcDNAの調製

  1. 溶解した細胞を含む各チューブに0.1 mLのクロロホルムを加え、2〜3分間インキュベートします。各サンプルを12,000 x g 、4°Cで15分間遠心分離します。 RNAを含む水相を新鮮な微量遠心チューブに移します。
  2. 0.25 mLのイソプロパノールを水相に加え、10分間インキュベートします。12,000 x g 、4°Cで10分間遠心分離します。 RNA沈殿物は白いゲル状のペレットを形成します。マイクロピペットを使用して、上清を捨てます。
  3. RNAペレットを0.5mLの新たに希釈した75%エタノールに再懸濁します。サンプルを短時間ボルテックスした後、7500 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。 上清をマイクロピペットで捨てます。
  4. RNAペレットを10分間風乾し、25μLのヌクレアーゼフリー水に再懸濁します。マイクロボリューム分光光度計を使用して260nmの吸光度を測定することにより、全RNAの濃度を決定します。
  5. 両方のサンプルから1〜3 μgの全RNAを使用して、製造元のcDNA合成キットの指示に従ってcDNAを調製します。cDNAを-20°Cで保存します。

5. 定量PCR

  1. 各サンプルの1:5希釈cDNAとGLI1、PTCH1、HHIP、SMO、およびβ-ACTIN(ハウスキーピング遺伝子として; 表2)適切なDNAポリメラーゼ、dNTP、およびバッファーを含むqPCRマスターミックスを、適切なマルチウェルの蛍光感受性PCRプレートに添加した遺伝子。
  2. プレートを適切なシーラーで覆い、適切なqPCR装置に入れ、プログラムの最後に40回の増幅サイクルと融解曲線分析ステップで標準化されたqPCRプログラムを実行します。融解曲線分析を含む標準化された40サイクルqPCRプログラムを 図1Bに概略的に示します。
  3. qPCRプログラムが完了したら、各アンプリコンの融解曲線を確認し、目的の温度で1つのピークを確認します。
    注:増幅サイクルの終了時に、関連する融解曲線分析では、各ウェルの温度を65°Cから95°Cに上昇させ、ステップごとに0.5°Cずつ5秒の持続時間でアンプリコンの融解温度を測定します。
  4. 増幅データをスプレッドシートにエクスポートし、各サンプルのβ-ACTIN遺伝子の相対発現に対して正規化することにより、各転写産物の相対発現(2−ΔΔCT法)を計算します。グラフをプロットし、対応のないT検定を使用して、各転写産物の相対発現の変化の統計的有意性を計算します。

6. 蛍光顕微鏡を用いた免疫染色と画像取得

  1. 200 μLのブロッキングバッファー(2% BSAおよび0.1% TritonX-100 in 1x PBS)でカバースリップ上に固定した細胞を30分間インキュベートします。
  2. 一次抗体(通常はPC軸索のアセチル化α-チューブリンに対する抗マウス抗体、繊毛膜および中心小体に対する抗ウサギ抗体)をブロッキングバッファー(最終希釈については 表を参照 )で希釈した混合物を加湿チャンバー内で4°Cで一晩インキュベートします。
    1. 空の1mLピペットチップボックスの下半分に濡れたペーパータオルを入れて、加湿チャンバーを作成します。透明フィルムのストリップをラック表面に置き、抗体溶液の液滴(20〜25μL)をフィルム上にスポットします(インキュベートするカバースリップごとに1つずつ)。液滴の上にカバースリップを敷いて細胞を浸し、チップボックスの蓋を閉めます。
  3. 翌日、カバースリップを再度反転させ、24ウェルディッシュに戻します。カバースリップを洗浄バッファーで洗浄し、150 μLの二次抗体混合物に、あらかじめ標準化された希釈量の抗体(ここでは、ブロッキングバッファーで希釈した緑色蛍光色素標識抗マウスおよび赤色蛍光色素標識抗ウサギ)および核DNA染色試薬を室温で1時間インキュベートします。カバースリップを3回洗います。
  4. ガラス顕微鏡スライド上に、退色防止剤を含む埋込溶液の液滴(約3〜5μL)を見つけます。セル側を下にして、カバースリップを取り付けソリューションに置きます。きれいなワイプをそっと押して、余分な液体を拭きます。カバーガラスの端に沿って透明なマニキュアを塗り、スライドに密封します。
  5. 電動ステージとデジタルイメージングが可能なカメラを取り付けた顕微鏡( 資料の表を参照)にスライドを置きます。60倍Plan Apo油浸対物レンズ(開口数1.4)を使用して、周囲温度で血清飢餓状態のRPE1細胞の画像を取得し、前述の抗体でマークされた細胞内のPCを視覚化します。
  6. デジタル顕微鏡イメージングソフトウェアパッケージを使用して、Z軸に沿った異なる蛍光色素について同じ露光時間を使用して、別々のカバーガラス上の異なるサンプルの画像を取得します。少なくとも500個の細胞からPC含有細胞の数を数え、48時間の血清飢餓状態における繊毛率を決定します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

PCを介したSHHシグナル伝達経路の活性化は、PC7の適切な機能を理解する方法です。ここでは、主に繊毛のあるRPE1細胞におけるSHH経路のSAG媒介活性化時に、RT-qPCRアッセイを用いてSHH経路標的遺伝子の相対発現を測定します。SHH経路の直接的な転写出力であるGLI1およびPTCH1は、この経路11の活性を測定するために頻繁に使用されます。このプロトコルには、SHH経路によって調節されているHHIP転写産物も含まれています。SMOはSHH経路の直接の標的ではないため、SMOの転写レベルはSHH経路の活性化によって変化することはなく、したがってコントロールとして使用されます。β-ACTINは、血清飢餓状態のRPE1細胞におけるSAG刺激によってそのレベルが変化しないため、正常化に使用されました(データは示されていません)。

この場合、RPE1細胞を繊毛形成の誘導のために血清飢餓培地で48時間インキュベートした。最後の 24 時間の間に、細胞を SAG またはコントロール溶媒 DM...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

PCの機能を調べることは、PCの機能不全に関連する繊毛と疾患または障害のダイナミクスを理解するための重要なステップです。繊毛マーカーまたは蛍光色素タグ付き繊毛構造成分の免疫染色による繊毛検査とは別に、PCの機能は、蛍光顕微鏡27,31を使用して組織および細胞におけるSmoの毛様体転座を測定することにより、標準的なSHH経路活性化をアッセイすることによって一般的に決定される。ここで説明するRT-qPCRベースのアッセイは、適切な毛様体の機能の尺度として、SAG刺激に応答したPC媒介性SHHシグナル伝達の変化を検出します。明らかに、これはこのプロトコルの最も重要なステップです。細胞培養におけるSHH経路転写レベルを評価するための同様の方法は、SHH経路が異なる細胞タイプでどのように異なり、血清飢餓培地で48時間27インキュベートしたときにPC含有細胞の割合が最も高いNIH3T3マウス線維芽細胞およびヒトRPE1...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは、競合する金銭的利益がないことを宣言します。

謝辞

この研究は、インド政府のバイオテクノロジー省(DBT)によるSMへのRamalingaswamiフェローシップと、インド政府の科学工学研究委員会(SERB)からSMへの研究助成金(CRG / 2020 / 004042)によってサポートされています。PHのフェローシップは、インド政府の大学助成委員会(UGC)が後援しています。著者らは、プレジデンシー大学健康科学研究所RNABio研究室のChandrama Mukherjee博士とAvik Mukherjee氏に、それぞれqPCR機器へのアクセスと機器のトレーニングに心から感謝します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DMSO、滅菌フィルターSigmaD2650
ロバ、抗マウス IgG (H+L) Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA21202
ロバ、抗ウサギ IgG (H+L) Alexa Fluor 568ThermoFisher ScientificA10042
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco、ThermoFisher Scientific41965039
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)Gibco、ThermoFisher Scientific14190144
Fetal Bovine serum (FBS)HimediaRM1112
蛍光顕微鏡、60倍対物Zeiss Axio observer colibri 5
hTERT-RPE1 cellsATCCCRL-4000
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad Laboratories1708891
Mouse, monoclonal anti-acetylated tubulin antibodyMilipore Sigma-AldrichT7451最終希釈 1:1000
Penicillin-Streptomycin, 100XGibco, ThermoFisher Scientific15140122
定量 PCR マシン、CFX 96Bio-Rad Laboratories
Rabbit、ポリクローナル Arl13B 抗体ProteinTech17711-1-AP最終希釈 1:250
ウサギ、ポリクローナル Cep135 抗体ProteinTech24428-1-AP最終希釈 1:500
SlowFade gold 退色防止剤ThermoFisher ScientificS36940
スムスナイズアゴニスト(SAG) AbmoleM4865ストック溶液: DMSO、5 mM
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725271
TRIzol ReagentInvitrogen15596026
TrypLEGibco、ThermoFisher Scientific12605028
レンズCarl

参考文献

  1. Nigg, E. A., Raff, J. W. Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease. Cell. 139 (4), 663-678 (2009).
  2. Halder, P., Khatun, S., Majumder, S. Freeing the brake: Proliferation needs primary cilium to disassemble. J Biosci. 45, 117(2020).
  3. Eguether, T., Cordelieres, F. P., Pazour, G. J. Intraflagellar transport is deeply integrated in hedgehog signaling. Mol Biol Cell. 29 (10), 1178-1189 (2018).
  4. Ishikawa, H., Marshall, W. F. Intraflagellar transport and ciliary dynamics. Cold Spring Harb Perspect Biol. 9 (3), a021998(2017).
  5. Hildebrandt, F., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N Engl J Med. 364 (16), 1533-1543 (2011).
  6. Reiter, J. F., Leroux, M. R. Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (9), 533-547 (2017).
  7. Hilgendorf, K. I., Myers, B. R., Reiter, J. F. Emerging mechanistic understanding of cilia function in cellular signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (7), 555-573 (2024).
  8. Bansal, R., et al. Hedgehog pathway activation alters ciliary signaling in primary hypothalamic cultures. Front Cell Neurosci. 13, 266(2019).
  9. Gigante, E. D., Caspary, T. Signaling in the primary cilium through the lens of the hedgehog pathway. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 9 (6), e377(2020).
  10. Anvarian, Z., Mykytyn, K., Mukhopadhyay, S., Pedersen, L. B., Christensen, S. T. Cellular signalling by primary cilia in development, organ function and disease. Nat Rev Nephrol. 15 (4), 199-219 (2019).
  11. Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian hedgehog signaling. Cold Spring Harb Perspect Biol. 9 (5), a028175(2017).
  12. Brown, J. M., Witman, G. B. Cilia and diseases. Bioscience. 64 (12), 1126-1137 (2014).
  13. Hanaki, K., et al. Alstrom syndrome: A review focusing on its diverse clinical manifestations and their etiology as a ciliopathy. Yonago Acta Med. 67 (2), 93-99 (2024).
  14. Merrill, A. E., et al. Ciliary abnormalities due to defects in the retrograde transport protein dync2h1 in short-rib polydactyly syndrome. Am J Hum Genet. 84 (4), 542-549 (2009).
  15. Dagoneau, N., et al. Dync2h1 mutations cause asphyxiating thoracic dystrophy and short rib-polydactyly syndrome, type iii. Am J Hum Genet. 84 (5), 706-711 (2009).
  16. Majumder, S., Fisk, H. A. Vdac3 and mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12 (5), 849-858 (2013).
  17. Briscoe, J., Therond, P. P. The mechanisms of hedgehog signalling and its roles in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (7), 416-429 (2013).
  18. Placzek, M., Briscoe, J. Sonic hedgehog in vertebrate neural tube development. Int J Dev Biol. 62 (1-2-3), 225-234 (2018).
  19. Wong, S. Y., et al. Primary cilia can both mediate and suppress hedgehog pathway-dependent tumorigenesis. Nat Med. 15 (9), 1055-1061 (2009).
  20. Deshpande, I., et al. Smoothened stimulation by membrane sterols drives hedgehog pathway activity. Nature. 571 (7764), 284-288 (2019).
  21. Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary g-protein-coupled receptor gpr161 negatively regulates the sonic hedgehog pathway via camp signaling. Cell. 152 (1-2), 210-223 (2013).
  22. Niewiadomski, P., et al. Gli protein activity is controlled by multisite phosphorylation in vertebrate hedgehog signaling. Cell Rep. 6 (1), 168-181 (2014).
  23. Kovacs, J. J., et al. Beta-arrestin-mediated localization of smoothened to the primary cilium. Science. 320 (5884), 1777-1781 (2008).
  24. He, M., et al. The kinesin-4 protein kif7 regulates mammalian hedgehog signalling by organizing the cilium tip compartment. Nat Cell Biol. 16 (7), 663-672 (2014).
  25. Wen, X., et al. Kinetics of hedgehog-dependent full-length gli3 accumulation in primary cilia and subsequent degradation. Mol Cell Biol. 30 (8), 1910-1922 (2010).
  26. Griffiths, S. C., et al. Hedgehog-interacting protein is a multimodal antagonist of hedgehog signalling. Nat Commun. 12 (1), 7171(2021).
  27. Gomez, A. E., Christman, A. K., Van De Weghe, J. C., Finn, M., Doherty, D. Systematic analysis of cilia characteristics and hedgehog signaling in five immortal cell lines. PLoS One. 17 (12), e0266433(2022).
  28. Schmidt, S., et al. Primary cilia and shh signaling impairments in human and mouse models of parkinson's disease. Nat Commun. 13 (1), 4819(2022).
  29. Dutta, A., et al. Increase in primary cilia number and length upon vdac1 depletion contributes to attenuated proliferation of cancer cells. Exp Cell Res. 429 (2), 113671(2023).
  30. De, K., et al. Hyperphosphorylation of cdh1 in glioblastoma cancer stem cells attenuates apc/c(cdh1) activity and pharmacologic inhibition of apc/c(cdh1/cdc20) compromises viability. Mol Cancer Res. 17 (7), 1519-1530 (2019).
  31. Yang, S., Zheng, X. The immunofluorescence-based detection of hedgehog pathway components in primary cilia of cultured cells. Methods Mol Biol. 2374, 89-94 (2022).
  32. Wang, W., et al. The mir-669a-5p/g3bp/hdac6/akap12 axis regulates primary cilia length. Adv Sci (Weinh). 11 (6), e2305068(2024).
  33. Alanazi, A., et al. Identifying the roles of mir-17 in ciliogenesis and cell cycle. Front Cell Dev Biol. 12, 1397931(2024).
  34. Bustin, S. A., et al. The miqe guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time pcr experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

RPE1 Smoothened RNA
繊毛形成の細胞モデルにおけるソニックヘッジホッグシグナル伝達を測定するための定量的PCRベースアッセイ
お問い合わせ
図書館への推薦

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。