マウスにおける自己免疫性筋特異的キナーゼ(MuSK)重症筋無力症の誘導に対する能動免疫

サマリー

この記事では、自己免疫性筋特異的キナーゼ(MuSK)重症筋無力症の実験的マウスモデルの包括的なプロトコルを提示し、疾患の病態生理学と潜在的な治療戦略を調査することを目的としています。

要約

重症筋無力症(MG)は、神経筋接合部に影響を与える自己免疫疾患です。ほとんどのMG患者はアセチルコリン受容体(AChR)に対する自己抗体を産生しますが、一部の患者では筋特異的キナーゼ(MuSK)を標的とする自己抗体を示します。MuSK MGは、重度の筋力低下、治療抵抗性の臨床症状、および筋無力症の危機を特徴とし、しばしば人工呼吸器を必要とします。その結果、患者はしばしば免疫抑制剤の長期使用を必要とし、これは長期的な副作用と関連しています。MuSK-MGの重症度と希少性を考えると、新しい治療法を進歩させ、その根底にある病態生理学的メカニズムをより深く理解するためには、実験動物モデルの開発が重要です。実験的自己免疫性重症筋無力症 (EAMG) は、MuSK-MG の動物モデルとして機能し、ヒト MG の臨床的および免疫学的特徴を効果的に、しかし部分的に模倣しています。自己免疫動物モデルの誘導は、能動的または受動的な免疫によって達成できます。本明細書で提示された実験プロトコルでは、完全フロイントアジュバントで乳化したヒトMuSKの精製細胞外ドメインを熱死結核菌で皮下投与することにより、能動免疫が採用された。4カ所で免疫化を行い、28日目にMuSKの追加接種を行いました。結核菌を配合したこのアジュバントは、TLR4を通じて免疫系を活性化し、投与された抗原の食作用を促進します。この記事では、MuSK-EAMGの開発と特性評価について、開始から結論まで包括的に詳しく説明します。

概要

重症筋無力症(MG)は、T細胞依存性の抗体媒介性メカニズムを介して発症する自己免疫疾患です。これは主に、患者の80%〜85%で神経筋接合部(NMJ)のシナプス後膜上のニコチン性アセチルコリン受容体(AChR)に対する抗体によって引き起こされ、患者の約5%で筋特異的キナーゼ(MuSK)に対する抗体によって引き起こされます。MGは自己免疫疾患のプロトタイプとなり、シナプス後機能を理解するためのモデル^{となりました1}。自己免疫疾患の動物モデルは、(1)動物が自然に自己免疫疾患を発症する自然発生モデルと、(2)自己免疫疾患を人工的に模倣して複製する誘導モデルの2つの主要なカテゴリに分類できます。重症筋無力症(MG)に関する研究では、能動免疫と受動免疫の両方がこの疾患を誘発できることが示されており、抗体媒介性疾患の理解に大きく貢献しています²。

パッシブトランスファーは、自己抗体介在性疾患の急性影響を評価するための非常に効果的な方法であり、MGにおける患者由来抗体の研究に広く使用されています。このアプローチは、疾患の根底にある免疫学的要因の理解を深める上で有益です。例えば、受動的移行研究では、抗MuSK IgG4がAChRクラスターの減少に及ぼす病原性の影響が示されています³。しかし、ヒトとげっ歯類のIgGおよび免疫系との機能的な違いや、リンパ組織で起こる抗MuSK自己免疫の初期活性化メカニズムを模倣するための受動的導入モデルの不十分さなど、受動的導入モデルにはいくつかの制限があります。

一方、免疫研究の潜在的な制限は、異なるマウス系統間の免疫遺伝学的多様性である⁴。例えば、C57BL/6(B6)マウスはAChRによる能動免疫に感受性があるのに対し、AKR/Jマウスは耐性があります。したがって、EAMG動物モデルを作成する際には、疾患を正確に反映するために、動物種、免疫方法、およびプロトコルの内容を正しく選択することが重要です⁵。

さらに、標的抗原をタンパク質全体として使用すると、抗体価が高くなることがよくあります。しかし、すべての抗体がマウス抗原と交差反応したり、病気の原因となるエピトープを産生したりするわけではありません。したがって、能動免疫モデルは必ずしもヒトの病理を正確に反映しているわけではありません。それにもかかわらず、適切な臨床的および生理学的表現型を成功裏に作成すると、これらのモデルは実験的治療法をテストするための長期的なプラットフォームを提供します。

臨床試験では、MuSK-MGの疾患メカニズムと治療要件が異なることが示されており、このMGサブタイプ^4,5,6の特異的な病原性の特徴をさらに特定する必要性が強調されています。これまでの能動的免疫に基づくMuSK EAMG試験では、Th2型免疫と抗マウスIgG1がMuSK自己免疫に大きく関与していることが示され、ヒトMuSK MG^に対する多くの潜在的な治療法(テリフルノミド、間葉系幹細胞、FCRLB shRNAなど)が同定されました^7,8,9。これは、新しい治療標的の試験とMuSK MGの病態生理学の調査におけるMuSK EAMGモデルの重要性を実証しました。

この記事では、動物モデルの誘導、疾患の進行のモニタリング、およびEAMG誘導の検証の手順について詳しく述べています。臨床評価には、オブザーバーによる体重、姿勢、握力、および臨床スコアのモニタリングが含まれていました。2回目の免疫投与から28日後にマウスを安楽死させ、血液、後肢筋、脾臓、腋窩リンパ節、鼠径リンパ節など様々な組織を採取し、疾患の定着を確認しました。抗MuSK抗体は、ELISA法を用いて血清中で定量しました。さらに、神経筋接合部の沈着物を視覚化するために、筋肉組織に対して免疫蛍光染色を行いました。MuSK EAMG感受性が異なるマウス群における臨床応答と免疫応答を実証および比較するために、KCNS3 shRNAで処理したマウスは炎症誘発性作用を示し(未発表)、FCRLB shRNAは抗炎症作用を示した⁹、これは以前の研究で決定された通りである。

プロトコル

このプロトコルは、イスタンブール大学動物実験地域倫理委員会(HADYEK)によって承認され、決定番号は2020/29でした。私たちの以前の研究^7,8,9では、EAMGモデルは、MuSKタンパク質による能動免疫により、8〜10週齢のBALB / cまたはB6マウスに誘導されました。この記事では、MuSK免疫BALB/Cマウス(グループあたり4〜8匹のマウス)を使用したさまざまな実験から得られた例示的なデータを示します。試薬および使用した機器は、材料表に記載されています。

1. 免疫用ヒトMuSKの作製と調製

1. ヒトMuSK細胞外ドメインアミノ酸24-495(NCBI Reference Sequence:NP_005583.1)をpPIC9ベクターにクローニングします。
2. 酵母 Pichia pastoris(GS115株)系で分泌発現します。
3. 成長培地にメタノール(2.5% v/v)を添加することにより発現を誘導します。
4. 精製目的でC端子6xHISタグを追加します。
5. タンパク質を分泌されたグリコシル化タンパク質として発現させ、天然条件下で精製します。50 mMリン酸緩衝液pH 8.0、300 mM NaClに対して培地を透析します。
6. Ni²⁺/ニトリロトリアセテートアガロース(Ni-NTA)を使用したニッケルイオンアフィニティークロマトグラフィーに進みます。精製したタンパク質は、10%グリセロールを添加した後、-80°Cで保存し、少なくとも2年間安定です¹⁰。
   注:Ni-NTA精製後の発現量は、約0.4 mg/Lの培養で推定されます。SDS-PAGEで分析したサンプルには、他のタンパク質不純物は検出されませんでした。
7. 免疫する前に、ゲル電気泳動により、MuSKタンパク質の単離された細胞外ドメインの純度を確認します(補足図1)。
8. 各マウスのMuSKを45 μg/100 μL PBSの濃度で調製します。
9. PBS(100 μL)および結核菌H37Ra(10 mg / 10 mL)を含む完全フロイントアジュバント(CFA-100 μL)を使用して、MuSKを1:1の比率でホモジナイズ(乳化)します(エマルジョンの総容量はマウスあたり200 μL)。

2.麻酔と予防接種の手順

1. 免疫する前に、プロポフォールをPBSで希釈します(1:5の比率)。
2. マウスあたり50 mg / kgで腹腔内投与します。.
   注:イソフルランは、吸入 による 麻酔にも使用できます(施設で承認されたプロトコルに従います)。初期濃度は通常、酸素流量1〜2 L / minで3%〜5%に設定され、維持濃度は通常1%〜3%で酸素流量は0.5〜1 L / minです。
3. 最初の免疫:CFAで合計45μg/200μL調製したMuSKを肩と内側の後肢に皮下注射します(各部分で約11.25μg/50μL)。
4. 2回目の免疫:CFAで合計45μg/200μL調製したMuSKを肩と腰に皮下注射します(各パーツで約11.25μg/50μL)。
   注:モデルを確立するために、28日間隔で2回注入を行います。筋肉内投与は筋肉痛と関連しており、臨床的弱点の評価を妨げる可能性があります。.EAMGは筋肉疾患であるため、筋肉内注射の利用は、痛みに関連する非重症筋無力症の脱力を誘発し、したがって交絡因子として作用する可能性があります。CFAのみ(MuSKなし)で免疫した対照群が推奨されます。

3. クリニカルスコアリング

1. マウスの重症筋無力症の症状が運動と疲労の後により顕著になるため、マウスがグリッドをつかんで疲労を誘発しようとするときに、ケージの上部グリッドを横切ってマウスを40回そっと引きずって運動させます。
2. 運動後は、マウスの活動、体重、筋力の変化を注意深く観察してください。これらの観察結果に基づいて適切なスコアを割り当て、評価基準を導きます。
   注:スコア0:マウスは活動的なままで、環境を探索し続けます。スコア1:運動後に猫背の姿勢が観察されますが、マウスは通常の活動と社交性に戻ります。毛皮のグルーミングは一般的に維持されています。スコア2:運動前でも猫背の姿勢が見られ、運動後により顕著になります。セルフグルーミングと活動の減少が見られます。スコア3:運動の前後に劇的な猫背の姿勢が観察されます。運動、社交性、筋力が大幅に減少し、2〜3日ごとに1〜2グラムの体重減少が見られます。脱水症状が起こり、マウスが水や餌にたどり着きにくくなります。脱水症状は、つままれた後、皮膚がすぐに戻らなかったり、糞便が変わったりすることで識別されます。痛みを感じているマウスは、目を細めたり、猫背の姿勢をとったりするのが特徴です。激しい痛みの兆候を示し、20%を超える体重減少を示すマウスが犠牲になります。スコア4:ネズミはケージの中で死んでいるのが発見されました。死亡したマウスはすぐに取り除き、ケージを交換する必要があります⁵。
3. マウスは、2回目の免疫投与から約10日後に症状が急速に進行したため、毎日マウスの様子を観察してください。最初の 28 日間は毎週、その後は週に 2 回、臨床スコアリングと測定を実施します。
4. 重量測定を行います。
   注:体重測定は、疾患の進行を追跡するための重要なパラメータを提供します。マウスの代謝率が高いため、体重は大きく異なる可能性があります。一貫性を保つためには、すべての測定に同じスケールを使用し、これらの測定を同じ時刻に実施することが重要です。
5. 筋力測定を行います。グリッドワイヤー付きの水平ダイナモメーターを使用して、筋力を測定します。
   1. マウスをケージの上で40回静かに引きずり、疲労を誘発することにより、臨床スコアリングのためにマウスを運動させます。
   2. すぐに各マウスをダイナモメーターのグリッドに置き、テールをそっと引っ張って、すべての足がグリッドをしっかりとつかんでいることを確認します。マウスが4本の足すべてでグリッドをつかむ測定のみを検討してください。
      注:各測定中に同じ量の力を加えるようにしてください、そして信頼性を維持し、ばらつきを減らすために同じ研究者がすべての測定を行うことをお勧めします。疲労感はMGの弱点の特徴であるため、握力を測定せずに一連の握力テストを実施する必要があります。その後、各マウスについて7つの測定が行われ、最大値と最小値は破棄されました。残りの 5 つの測定値の平均は、信頼性の高い結果を確保するために計算されます。

4. 組織サンプル調製

注:2回目の予防接種の28日後に、施設で承認されたプロトコルに従ってマウスを犠牲にします。犠牲にしたマウスから血液、筋肉、脾臓、リンパ節を採取することは、さらなる研究に役立ちます。

1. 心臓採血
   注:心臓の血液を採取するには、倫理委員会によって承認された適切な麻酔薬(プロポフォールなど)を使用してマウスに麻酔をかけます。心臓穿刺は麻酔が必要で、動物は直後に安楽死させなければならないという終末期の処置です。
   1. ラットに深く麻酔をかけた後、ラットを仰向けに置き、腹部を開き、心臓を最も低い肋骨の約1 cm上、わずかに右に配置します。
   2. 25-35 Gの針を使用して、合併症を避けるために、注射器を動かさずに左心室から45度の角度で慎重に血液を採取します¹¹。
   3. 血液サンプルを乾燥チューブに移して血清を分離するか、EDTAチューブに移してRNAを分離します(計画されている場合)。
   4. 遠心分離により血清を分離し、使用するまで血清サンプルを-20°Cに保ちます。
2. 筋肉サンプルの保存と調製
   1. 前脛骨筋11,12,13を収集します。氷冷したPBSですすいでください。
   2. クライオチューブにサンプルを入れ、すぐに-20°Cの液体窒素冷却イソペンタンに浸し、-80°Cの冷凍庫で保存します。
      注:実験でより正確な結果を得るために、サンプルは急速冷凍する必要があります。
   3. 組織を切片マウントに垂直に置きます。コルクが使えます。免疫蛍光染色用のサンプルをOCT(Optimal Cutting Temperature compound)に埋め込みます。
   4. 組織を液体窒素冷却イソペンタンに浮かべます。クライオスタットで切片化するまで、-80°Cの冷凍庫で保管してください。

5. 免疫蛍光標識 による 神経筋接合部の評価

1. クライオスタットの切片作成と固定
   1. OCTに包埋した凍結組織を-24°Cでクライオスタットを用いて厚さ7μmに切片化します。
   2. -20°Cに冷却したアセトンで切片を固定します。 PBSで5分間洗浄します。
   3. 0.4%トリトンX(PBS-T)を含むPBSを再度10分間洗浄します。
      注:固定の影響を受けた分子のコンフォメーションを修正するために透過化ステップを実行でき、より正確な結合を確保できます。透過処理には、1% FBS を含む PBS を 10 分間、PBS-T をさらに 10 分間処理することが含まれていました。
   4. 10% FBSを含むPBS-Tで切片を30分間ブロックし、非特異的結合を防ぎます。
2. 免疫蛍光染色
   注:染色には、C3、IgG、アセチルコリン受容体マーカー α-ブンガロトキシンの抗体を使用できます。
   1. 選択した抗体を1% FBSを含むPBS-Tで希釈します。
   2. 暗所で室温で2.5時間インキュベートします。
   3. 1%FBSを含むPBS-Tで切片を洗浄します。
   4. DAPIで対比染色します。
   5. 切片は、4°Cの暗く湿気の多い環境で蛍光顕微鏡で検査するまで保管してください。
   6. イメージングと解析を行います。
      注:各セクションのブンガロトキシン(BTX)陽性神経筋接合部は、蛍光顕微鏡を使用してカウントする必要があります。20倍の倍率で画像を撮影します。分析のために、BTXおよびC3またはIgG陽性の神経筋接合部を顕微鏡下で手動でカウントしました。直列セクション内のBTXラベル付きジャンクションの合計に対するダブルポジティブジャンクションの割合を解析に使用する必要があります。

6. ウェスタンブロット

1. タンパク質の単離と定量
   1. スナップフリーズされた筋肉サンプルを使用します。
   2. プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む溶解緩衝液を調製します。
   3. サンプル重量に等しい0.5 mmの酸化ジルコニウムビーズを、溶解バッファーの2倍の容量で加えます。
   4. ホモジナイザーを使用してサンプルを均質化します。
   5. ライセートを12,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
   6. タンパク質溶解物を含む上清を回収します。
   7. BCAアッセイキットまたはBradford試薬を使用して、タンパク質濃度を定量します。
   8. 溶解バッファーを使用して、タンパク質サンプルを目的の濃度まで調製します。ウェルあたり25 μgのタンパク質は、AChRを示すのに効率的です。
2. SDS-PAGEゲル電気泳動
   1. タンパク質サンプルを4x Laemmli bufferと混合します。
   2. サンプルを95°Cで5分間加熱して脱窒させます。
   3. 同量のタンパク質とタンパク質ラダーをSDS-PAGEゲルのウェルにロードします。
   4. ゲルを200Vで30分間泳がせます(時間は電源によって異なる場合があります)。
3. タンパク質の移動
   1. ニトロセルロースメンブレンによるセミドライ転写の場合は、すべての成分を冷間転写バッファーで濡らします。
   2. 転写サンドイッチを設定します:スポンジ、濾紙、ゲル、メンブレン、濾紙、スポンジ。
      注意: レイヤー間に気泡が存在しないことを確認してください。転送プログラムは、製造元の指示に従って選択する必要があります( 資料の表を参照)。
4. ブロッキングと抗体インキュベーション
   1. 5%脱脂粉乳またはTBST中のBSAでメンブレンを室温で1時間、穏やかに揺さぶりながらブロックします。
   2. メンブレンを2.5%ブロッキングバッファーで希釈した一次抗体(抗AChR)とメンブレンを4°Cで一晩、穏やかに揺さぶってインキュベートします。
   3. TBSTでメンブレンを各10分間3回洗浄します。
   4. 2.5%ブロッキングバッファーで希釈したHRP標識二次抗体(IgG HRP)とメンブレンをインキュベートし、室温で1時間。
   5. TBSTでメンブレンを各10分間3回洗浄します。
5. 検出とイメージング
   1. 製造元の指示に従って、ECL基質をメンブレンに塗布します。
   2. イメージングシステムを使用して化学発光シグナルを捕捉します。
   3. イメージングソフトウェアを使用してバンドを解析します。
      注:分解を防ぐために、タンパク質と試薬は常に氷上に保管してください。ハウスキーピングタンパク質(β-アクチン、α-チューブリン、GAPDHなど)をコントロールとして実行することにより、均等な負荷を確保します。最良の結果を得るために、抗体濃度とインキュベーション時間を最適化します。AChRタンパク質がMuSK免疫マウスで発現が少ないことを示すことは非常に重要です。

7. 自家製抗MuSK IgG ELISA

1. 100 μLの炭酸重炭酸塩緩衝液(プレートコーティング)中に、ウェルあたり0.5 μgの濃度でMuSK抗原を調製します。
2. 100 μLの抗原溶液をイムノアッセイプレートの各ウェルに分注します。
3. プレートを4°Cで一晩インキュベートします。
4. 0.5%Tween 20(洗浄液)を含むPBSでプレートを洗浄します。
5. 5% FBSを含むPBS(ブロッキング溶液)とプレートを4°Cで90分間インキュベートし、非特異的結合部位をブロックします(ブロッキング)。
6. 最適化試験で高レベルのMuSK-IgGが示されたため、血清サンプルをブロッキング溶液で1/50,000に希釈してください。
7. ブロッキング後に洗浄せずに、希釈した血清サンプルをウェルに加えます。
8. プレートを37°Cで90分間インキュベートします。
9. プレートを洗浄液で3回洗います。
10. HRP標識抗マウスIgG二次抗体(ab97023)をブロッキング溶液で1/5000希釈します。
11. 希釈した二次抗体100 μLを各ウェルに加えます。
12. プレートを37°Cで90分間インキュベートします。
13. プレートを洗浄液で3回洗います。
14. 各ウェルに100μLのTMB基質を加え、色の変化を観察します。
15. 2 MH₂SO 4を使用して適切な時間に反応を停止します_。
16. 分光光度計を使用して450nmの光学密度を測定します。
17. 一貫性を保つために、すべてのサンプルを複製して同じプレートで実行します。
    注:標準サンプル希釈液が利用できなかったため、光学濃度値を分析に使用する必要があります。ネガティブコントロールウェル(空白)の色が変わらないはずです。急激な色の変化が予想されるため、ウェル内での反応を直ちに停止するために、停止溶液を近くに置いておく必要があります。

結果

MuSK 実験的自己免疫性重症筋無力症 (EAMG) モデルの評価と検証では、疾患モデルの誘導と特性評価の成功を実証するために、いくつかの主要なパラメーターと実験結果が重要です。以下は、MuSK EAMGモデルの確立を確認する代表的な結果です。

クリニカルスコアリング
マウスは、標準化された臨床スコアリングシステムを使用して、重症筋無力症の臨床症状について監視および採点されます。このスコアリングには、筋力、姿勢、および一般的な体調の評価が含まれます。ベースラインマウスや対照マウスと比較して、経時的な臨床スコアの増加は、実験群における疾患の進行と重症度を裏付けています。臨床スコアデータは、明確で漸進的な増加を示すはずであり、ヒトのMuSK重症筋無力症を模倣するモデルの有効性を強調しています(図1)。

握力と体重の測定
マウスの機能評価には、握力と体重の測定が含まれます。これらのパラメータは、...

ディスカッション

マウスMuSK-EAMGは、筋力低下、球筋力低下による体重減少、循環抗MuSK抗体、および筋肉AChRの減少の点で、臨床的および免疫病原性の両面でヒトMuSK-MGを模倣しています。この MuSK-EAMG モデルのマイルストーンと予想されるタイムラインについては、筋力低下の臨床徴候は、2 回目の免疫後 1 週間以内に現れるはずです。マウスの約5%は、最初の予防接種後に病気の兆候を発症する可能性があります。2回の予防接種後には、>70%のEAMG(少なくともグレード1)の有病率が予想されます。疾患の発生率が低い場合は、3回目の予防接種を投与することができる^7,14,15。MuSKを免疫したマウスをCFAで投与したマウスは、2回の連続免疫でMuSKをCFAおよびIFAで投与したマウスよりも、それぞれわずかに高い抗体反応および臨床反応を示しました¹⁴

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
125I-&α;-ブンガロトキシン	Invitrogen	BTX T1175
2-メチルブタン	シグマ - アルドリッチ	M32631
40 μm セルストレーナー	NEST	258369
96 ウェル マキシソープ プレート	Sigma-Aldrich	M9410
アジュバント 不完全	Becton Dickinson & Co.	263910
AChR alfa1	アロモン	ANC-001
抗マウス IgG HRP	Abcam	ab97023
バレット ブレンダー ストーム	ネクスト アドバンス		ティッシュ ホモジナイザー
C3	Novus	NB200-540G
炭酸水素塩バッファー	メルク	C3041
クライオスタット	ライカ	CM1860
ダイナモメーター Imada DST-50N	室町	MK380Si
蛍光顕微鏡	ライカ	DM4M
ルアーロック付きガラスシリンジ	ISOLAB	094.92.005
IgG	Abcam	ab96871
マイクロプレート光度計、マルチスカン FC	Thermo Scientific	51119000
マウス手術キット	ケント・サイエンティフィック・コーパレーション	INSMOUSEKIT
核菌 H37Ra	ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー	231141
OCT コンパウンド	寒天科学	AGR1180
シリンジ、1 mL	Becton Dickinson & Co.	309625
シリンジ、2 mL	B. Braun	7389
ユニバーサル動物拘束具	Merck	Z756911-1EA
WesternBright Sirius-Western ブロッティング検出キット	Advansta	K-12043-D10	ECL