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方法論記事

カルシウムイオンチャネルの活性化を研究するためのシングルセルカルシウムイメージング

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DOI:

10.3791/67412

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2024年12月13日

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1School of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine, 2School of Pharmaceutical Sciences, Tsinghua University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この記事では、Fura-2/AM色素を用いたシングルセルCa2+イメージングを使用して、細胞内のカルシウムイオン(Ca2+)濃度をリアルタイムで定量的にモニタリングする方法を紹介します。この技術により、効率的な色素ローディングと、蛍光強度比によるCa2+レベルの正確な計算が可能になり、研究アプリケーションのためのシンプルで迅速なアプローチが可能になります。

要約

シングルセルCa2+ イメージングは、温度、電圧、天然化合物、化学物質などのさまざまな刺激によって活性化されるCa2+ チャネルの研究に不可欠です。これは主に顕微鏡イメージング技術と関連するCa2+ インジケーターFura-2/AM(AMはアセトキシメチルエステルの略語)に依存しています。細胞内では、Fura-2/AMはエステラーゼによって加水分解されてFura-2になり、遊離細胞質Ca2+と可逆的に結合することができます。結合すると、最大励起波長は380nmから340nm(Ca2+で飽和した場合)にシフトします。放出される蛍光強度は、結合したCa2+の濃度に定量的に関連しています。340/380比を測定することにより、細胞質中のCa2+ 濃度を決定することができ、異なるサンプル間での蛍光プローブのローディング効率の変動によって引き起こされるエラーを排除することができます。この技術により、複数の細胞におけるCa2+ の変化をリアルタイム、定量的、かつ同時にモニタリングすることができます。結果は .XLSX」形式により、高速で直感的な変更曲線が生成されるため、検出効率が大幅に向上します。この記事では、さまざまな実験的観点から、内因性または過剰発現チャネルタンパク質を持つ細胞でCa2+ シグナルを検出するためのこの技術の使用をリストしています。その間、細胞を活性化するためのさまざまな方法も示され、比較されました。その目的は、シングルセルCa2+ イメージングの使用方法と応用について、読者により明確に理解していただくことです。

概要

Ca2+ は、細胞シグナル伝達において重要な役割を果たし、筋収縮1、神経伝導2、分泌3、遺伝子発現4などのさまざまな細胞機能を調節し、それによって複数の生理学的プロセスに影響を与えます。Ca2+ 濃度が異常になると、不整脈5、凝固障害6、ホルモンバランスの乱れ7などの疾患を引き起こす可能性があります。したがって、細胞内Ca2+ 濃度変化のメカニズムを研究することは最も重要です。

細胞内のCa2+濃度の調節には、高Ca2+選択的カルシウム放出活性化カルシウム(CRAC)チャネル8やTRPファミリー9の非選択的カチオンチャネルなど、さまざまなイオンチャネルが関与しています。これらのイオンチャネルは、伝統的な漢方薬11に見られる温度10、化合物、有効成分などの刺激によって活性化され、さまざまなCa2+関連の生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしている。

細胞内Ca2+ 濃度変化の効果的なモニタリングは、特にカルシウムシグナル伝達調節が多くの治療アプローチで中心的な役割を果たす伝統的な中国医学の分野で、Ca2+関連イオンチャネルの研究に不可欠です。現在、細胞内Ca2+ を測定するための主要な方法は、電気的測定と光学的測定の2つのタイプに分類できます。電気測定アプローチでは、パッチクランプ技術を使用して、Ca2+ 流入による細胞膜電位の変化を評価します12。

光学測定では、蛍光プローブはCa2+に特異的に結合するため、研究者は細胞の蛍光強度の変化を追跡することができます。一般的な光学的方法には、蛍光タンパク質ベースおよび蛍光色素ベースの技術が含まれます。蛍光タンパク質ベースの方法では、研究者はCameleon13やGCaMP14などのCa2+感受性蛍光タンパク質を細胞内で過剰発現させ、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーを使用して蛍光シグナルの変化をモニターし、細胞質のCa2+濃度の変化を観察できます。さらに、研究者はマウスでこれらのタンパク質を過剰発現させ、2光子蛍光顕微鏡を使用して細胞内Ca2+濃度のin vivoまたは組織レベルのリアルタイムモニタリングを行い、高い分解能と深部組織への浸透を提供することができます10。

蛍光色素ベースの分析法では、一般的に使用されるCa2+ プローブには、Fluo-3/AM、Fluo-4/AM、およびFura-2/AM10が含まれます。研究者は、これらの蛍光プローブを含む溶液で細胞をインキュベートし、細胞膜を通過して細胞内エステラーゼによって切断され、細胞内に留まる活性化合物(Fluo-3、Fluo-4、Fura-2など)を形成します。これらのプローブは、遊離リガンド型では最小限の蛍光を示しますが、細胞内Ca2+に結合すると強い蛍光を発するため、細胞質のCa2+ 濃度の変化を示します。他の蛍光タンパク質や色素と比較して、Fura-2は通常、340 nmおよび380 nmの波長で励起されます。細胞内遊離Ca2+に結合すると、Fura-2は吸収シフトを起こし、励起波長のピークを380 nmから340 nmに移動しますが、510 nm付近の発光ピークは変化しません。蛍光強度と結合したCa2+ 濃度との間には定量的な関係があり、これら2つの励起波長での蛍光強度比を測定することで、細胞内Ca2+ 濃度を計算できます。比率測定により、光退色、蛍光プローブの漏れ、負荷の不均一、セルの厚さの違いの影響が軽減され、信頼性と再現性の高い結果が得られます(図1)。

シングルセルCa2+ イメージングシステムは、主に顕微鏡技術とCa2+ インジケーターFura-2/AMを使用して細胞内Ca2+ 濃度を検出します。これらのシステムは、蛍光顕微鏡、Ca2+ イメージング光源、蛍光イメージングソフトウェアで構成されており、複数の細胞の細胞質におけるCa2+ の変化を同時にリアルタイムかつ定量的にモニタリングすることができます(視野あたり最大50細胞)。結果は、その後の分析のために「.xlsx」形式で保存されます。このシステムは、迅速な解析速度(1つの視野内の細胞群の解析に約1分)を提供し、直感的な変化曲線を生成することで、検出効率を大幅に向上させます。シングルセルCa2+ イメージングは、Ca2+関連チャネルの研究に不可欠な技術的アプローチであり、イオンチャネル関連の生物医学研究において大きな価値があります。シングルセルカルシウムイメージング技術への応用は、伝統的な漢方薬のメカニズムに関する研究を大きく前進させることが期待されます。

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プロトコル

実験方法は、清華大学と北京中医薬大学のIACUCガイドラインによって承認され、それに従っています。このプロトコルは、いくつかの新生児マウス(生後3日以内、性別無作為化同腹仔、C57BL/6マウス)の皮膚から単離された初代ケラチノサイトを含む、さまざまな細胞タイプにシングルセルCa2+ イメージング法を導入します。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 資料表に記載されています。

1. 細胞調製

手記： 初代細胞、内在性標的遺伝子を持つ細胞株、または過剰発現プラスミドをトランスフェクトした細胞株はすべて、シングルセルCa2+ イメージングに適しています。この研究で使用されたプラスミドは、清華大学のXiao Bailong教授の研究室から入手しました。これらのプラスミドは、GFP蛍光タンパク質とヒトSTIM1、DsRed蛍光タンパク質とヒトOrai1、mRuby蛍光タンパク質とウサギTRPV1、および赤色蛍光タンパク質mCherryの配列をファージプラスミドベクター10に組み込むことによって構築した。

  1. 直径8mmの滅菌スライドガラスを24ウェルプレートに調製します。各ウェルに500 μLのポリ-D-リジン(PDL)バッファー(DPBSで50 μg/mL)を添加します。
  2. スライドを37°Cで1時間インキュベートしてコーティングし、コーティング液をピペットで廃棄します。
  3. スライドをDPBSで一度洗い、後で使用するために取っておきます。
  4. 初代細胞と細胞株をそれらの特異的な培養方法に従って別々に培養する10。
  5. 調製した24ウェルプレートに、ウェルあたり約1.5×105 細胞の密度で細胞を播種します。細胞がカバーガラスに付着したら、Ca2+ イメージングに使用します。
  6. プラスミドを過剰発現する細胞については、Lipofectamine 2000(またはLipofectamine 3000)トランスフェクション試薬を使用して、標的プラスミド(1 μg/well)を1:1の比率でトランスフェクションし、細胞培養インキュベーターで約24時間インキュベートします。
    手記： より大きな発現タンパク質では、より長いインキュベーション時間が必要になる場合があります。

2. Fura-2/AM作業溶液の調製

  1. 50 μgのFura-2/AM粉末が入ったチューブに50 μLのジメチルスルホキシド(DMSO)を加え、よく混合して1 μg/μLのFura-2/AM原液を調製します。
  2. Fura-2/AMストック溶液とPluronic F-127を、1.3 mM Ca2+を含むHank's bufferに混合します。
    手記： ワーキング溶液中のFura-2/AMおよびPluronic F-127の最終濃度は2.5 μg/mLです。ハンク緩衝液は、1x HBSS緩衝液に10 mM HEPESを添加して調製します。
  3. アルミホイルを使用して、Fura-2 / AM作業溶液を光から保護します。

3. シングルセルCa2+ イメージングのための細胞前処理

  1. 細胞を含むスライドガラスを、ハンクのバッファーを含む新しい24ウェルプレートに移して洗浄します。
  2. ピペットを使用してバッファーを廃棄し、500 μLのFura-2/AMワーキングバッファーを各ウェルに加えます。
  3. 室温で暗所で30分間インキュベートし、プローブをローディングします。
  4. Fura-2/AMワーキングバッファーを取り外し、細胞をハンクバッファーで3回洗浄して、余分なFura-2/AMを除去します。これで、セルを使用する準備が整いました。

4. Ca2+ イメージングシステムの起動

注:この研究では、蛍光顕微鏡をCa2+ イメージングに使用します。

  1. DG4ライト(キセノンランプ)、カメラ、白色光源、顕微鏡ステージコントローラー、顕微鏡、コンピューター、蛍光イメージングソフトウェアのコンポーネントを順番に起動します。
    手記： 温度によるイオンチャネルの活性化を検出する場合は、灌流システム、加熱システム、温度コントローラー、および液体循環加熱/冷却装置のコンポーネントもオンにします。

5. 細胞Ca2+ 応答手順

  1. 蛍光イメージングソフトウェアを開きます( 材料の表を参照)。
    1. [プロトコル] を選択し、[ファイル] を選択し、[プロトコルのロード] を選択します。プロトコルを選択し、[OK]をクリックします。
    2. 実験を構成します (メニュー リスト)。
    3. [新しい実験] を選択します。
  2. 灌流チャンバーを顕微鏡に取り付けます。
    手記： ラフフォーカスノブを使用してチャンバーを取り付けたり取り外したりするときは、対物レンズの損傷を防ぐために、常に対物レンズを完全に下げてください。
  3. Fura-2/AM処理した細胞スライドを取り出し、ハンクバッファーの入ったチャンバーに入れます。
  4. 灌流システムを起動します。
  5. 20x DIC対物レンズを選択し、白色光の下でピントを調整します。
  6. タスクバーの [Cfg Exp ]をクリックします。
    1. イメージングに必要な蛍光色素を選択します。
    2. 画面上の取得頻度と表示設定を決定します(取得:340、380、GFPを確認してください。取得間隔: 1 秒。保存間隔:1秒)。
  7. 焦点
    1. 実験のコントロールパネルで、[ フォーカス ]ボタンをクリックします。
    2. 必要に応じて集録時間(通常は100ms)とゲインを調整し、「この波のために保存します」。
      手記： UV光の場合は、露光時間の代わりにゲインを使用してください。
    3. ピント合わせに必要な波長(380度など)を選択し、[ フォーカスの開始]をクリックします。
    4. 双眼鏡からコンピューターへの表示を切り替えます。
    5. 双眼鏡でかすかな緑がかった色が見えるようにします。
    6. 細胞に焦点を合わせ、最初にラフフォーカスを使用して対物レンズを近づけ、次にファインフォーカスを使用します。
      手記： 顕微鏡がステージに近づきすぎるとビープ音が鳴ります。これが発生した場合は、対物レンズを下げ、ステージ上のプレートを再調整して、再度焦点を合わせます。焦点を合わせる時間を最小限に抑え、レーザーによる細胞損傷を軽減します。
    7. フォーカシングプロセス中に細胞の蛍光強度を確認してください。
    8. 露光時間とゲインを変更して、細胞の蛍光強度を調整します。
      手記： 340 と 380 の露光時間とゲインは一貫している必要があります。
    9. 良好な焦点が合ったら、顕微鏡のボタンを押して、ビューをコンピューターに切り替えます。
    10. 必要に応じてピントを合わせ直して、コンピューター上で最も鮮明な画像を取得し、[ フォーカスの停止]をクリックします。
  8. GFP陽性細胞を見つけるための代替手順
    1. 最初に340/380手順を使用して、細胞に適切に焦点を合わせます。
    2. FITCを選択し、[ フォーカスの開始]をクリックします。
    3. ステージコントローラーを使用して、GFP陽性細胞を見つけます。
    4. ビューをコンピューターに切り替えてから、[ フォーカスの停止]をクリックします。
  9. 地域選択
    1. メニューバーの 「地域 」ボタンをクリックします。
    2. 選択した照明タイプ(340/380/FITC/TRITC)を選択します。FITCフィルターとTRITCフィルターは、GFPおよびmCherry/DsRed/mRubyにそれぞれ選択され、標的プラスミドを過剰発現する細胞に使用されます。それ以外の場合は、「Fura-2」を選択します。
      手記： 明らかに丸みを帯びた細胞や露出過多の蛍光タンパク質を持つ細胞など、状態が悪い細胞や死んだ細胞は選択しないでください。
    3. [画像の取得]をクリックし、[OK]をクリックします。
    4. 新しいウィンドウが表示されます。 楕円形 ツールをクリックし、セルをクリックしてセルを選択します。
    5. 標的タンパク質(FITCまたはTRITC)が持つ蛍光下で目的の細胞を選択します。380 nmの条件下で標的タンパク質を発現しないコントロール細胞を選択します。
    6. 領域を元に戻すには、円を右クリックして [領域の削除] を選択します。
    7. 背景サンプルを最後の領域として選択し、その ID 番号を記録します。
    8. [保存]をクリックし、[完了]をクリックします。
  10. 背景の減算
    1. メニューボタン 「参照」をクリックします。
    2. 背景領域の番号を示します。
      手記： 背景が最後に選択された領域であった場合、非常に大きな数値を入力すると、最後に選択された領域に自動的に切り替わります。
    3. [参照の削除]チェックボックスをオンにして、[OK]をクリックします。
  11. ログ データ
    1. 実験コントロールパネルの 「Log Data 」ボタンをクリックします。
      手記： 画像は、後で実験を再生したい場合にのみ保存されます。通常は、データボックスにチェックを入れるだけで十分です。
    2. 優先するデータファイルの種類を求めるプロンプトが表示されることを確認します。選択。xlsx 形式を推奨します。
    3. 「.xlsx」タイプのワークシートが開きます。ワークシートを最小化すると、画面スペースを占有するのを防ぐことができます。
  12. データ集録
    1. コントロールパネルの タイムラプス セクションで、データ集録間隔を 1秒に設定します。
      手記： これは、実際のニーズに応じて調整できます。
    2. 実験コントロールパネルの Zero Clock をクリックし、 Acquire をクリックして実験を開始します。ベースラインは、選択した各セル領域を示すグラフ上に表示されます。
    3. 実験要件に従って、細胞に対して一連の処理を行います。
    4. 細胞の温度応答を観察するには、温度コントローラーを使用して灌流システム内のバッファーを適切な温度に加熱します。
    5. 薬物が細胞に及ぼす影響を観察するには、薬物含有バッファーを灌流または手動で追加し、細胞の変化を記録します。
    6. データ取得が完了したら、[ 一時停止]をクリックします。
      手記： データ取得は一時停止でき、実験中はいつでもクロックをリセットできます。
    7. データを保存して分析します。
  13. 「File and Close Experiment」をクリックして実験を終了し、ダイアログボックスで「No」を選択してプロトコルを保存します。
  14. メニューの [新規 ] をクリックして新しいテストを開き、プロセスを繰り返します。
  15. シャットダウン
    1. ソフトウェアを閉じて、コンピューターからデータを転送します。
    2. 起動手順を逆にします。
    3. サインアップシートに時間を記録し、混乱を片付けます。
  16. データ分析
    1. 細胞内Ca2+ 濃度をFura-2 340/380比で表すか、対応するCa2+ 濃度に変換します。

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結果

温度応答検出
初代ケラチノサイト
初代ケラチノサイトを新生仔マウスから単離し、確立されたプロトコル10に従って調製した。これらの細胞は、スライドガラスを含む24ウェルプレートに播種されました。Fura-2プローブを装填した後、 図2Aに示すように、顕微鏡下で380nmの波長で焦点を調整し、細胞形態を鮮明に可視化しました。プロセス中にプローブが正常にロードされなかった場合、細胞は見えません。チャンバー内の細胞外バッファーは、灌流システムを通じて連続的に交換され、細胞にとって最適な条件が確保されました。温度制御システムは灌流システムに接続され、細胞外バッファーの温度変化を制御することで細胞の熱応答を検出することができました。このプロセスでは、細胞外バッファーを徐々に加熱し、次に徐々に冷却します。

シングルセルCa2+ イメージングシステムを利用して、さまざまな実験条件下での細胞内Ca...

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ディスカッション

シングルセルCa2+イメージングシステムの用途は広範であり、ケラチノサイト、幹細胞16、肝細胞、心臓細胞17、足細胞18、免疫細胞、標的タンパク質を過剰発現する細胞株10,19など、さまざまな細胞タイプにおけるCa2+シグナルの研究が可能です。この技術は、細胞のCa2+濃度の変化と絶対値を測定し、Ca2+関連のイオンチャネルの調査に重要な役割を果たしているため、イオンチャネル研究室で不可欠な装置の1つとなっています。

研究が進むにつれて、Ca2+ シグナル関連イオンチャネルの重要性は、伝統的な漢方薬の研究者の間でますます認識されるようになっています。...

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開示事項

著者は、開示することは何もないと宣言します。

謝辞

清華大学のBailong Xiao氏が、シングルセルCa2+ イメージングシステムと温度制御オペレーティングシステムを共有し、このプロジェクトでのサポートと支援に感謝します。本研究は、中国国家自然科学基金会(32000705)、中国中国医学協会(CACM-(2021–QNRC2–B11))、中央大学基礎研究基金(2020–JYB–XJSJJ–026)、(2024-JYB-KYPT-06)の資金提供を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
カメラニコン
カプサイシンシグマ211275
CL-100 温度調節器ワーナーインスツルメンツ
シクロピアゾン酸 (CPA)シグマC1530
DG-4 ライトサッター インスツルメント カンパニー
ジメチルスルホキシド (DMSO) Amresco231
DPBSThermofisher14190144
蛍光イメージングソフトウェア(MetaFluor、有料ソフトウェア) 分子デバイス
蛍光顕微鏡Nikon
Fura-2/AMInvitrogenF1201
HBSS bufferGibco14175103
HEPES SigmaH3375
リポフェクタミン 3000InvitrogenL3000008
Pluronic F-127 BeyotimeST501
poly-D-リジン BeyotimeST508
SC-20 液体循環加熱・冷却装置 ハーバード・イステッド・デバイス
白色光源ニコン

参考文献

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