方法論記事

パッチクランプ法による新たに分離された脳底動脈平滑筋細胞における内向き整流K + 電流の記録

DOI：

10.3791/67414

⸱

2025年2月7日

 ,  , 
1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Research Center, Fenyang College, Shanxi Medical University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、ラット脳底動脈から平滑筋細胞を分離し、全細胞パッチクランプ技術を使用してこれらの細胞の内部整流カリウムチャネル電流を記録するための迅速かつ効率的な方法を説明しています。これは、脳底動脈とイオンチャネルを研究する研究者に新しいアプローチを提供します。

要約

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脳血管疾患は高齢者に多くみられる疾患で、その発生率は着実に増加しています。脳底動脈は、橋、小脳、後脳領域、および内耳に供給する重要な脳血管です。カリウム(K +)チャネル活性は、細胞膜電位を調節することにより、血管緊張を決定する上で重要な役割を果たします。内側に整流するK + (Kir)チャネルの活性化は、他のK + チャネルと同様に、細胞膜の過分極と血管拡張を引き起こします。この研究では、脳底動脈から新たに分離された平滑筋細胞を使用して、全細胞パッチクランプ技術 を介して Kir電流を記録しました。Kirチャネル阻害剤である100 μmol/L BaCl2と、ニトロ血管拡張薬である10 μmol/Lのニトロプルシドナトリウム(SNP)がKirチャネル電流に及ぼす影響を調査しました。その結果、BaCl2 は脳底動脈平滑筋細胞のKirチャネル電流を阻害し、SNPはこれらの電流を増強することが示されました。このプロトコルは、新たに単離された動脈平滑筋細胞を調製し、パッチクランプ技術を使用してKirチャネル電流を記録するための包括的なガイドを提供し、この方法を習得しようとしている研究者に貴重なリソースを提供します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脳血管疾患は、高齢者に蔓延する疾患です。生活水準の向上、平均寿命の延伸、高齢化の進展に伴い、脳血管疾患の罹患率は着実に増加しています1。脳底動脈は、両側椎骨動脈の融合によって形成された不対血管であり、頭蓋骨内の橋の下を走り、2つの後大脳動脈に分かれています。橋、小脳、脳の後部領域、および内耳に供給されます。脳底動脈への血液供給が不十分な場合、一時的なめまいを引き起こす可能性があり、多くの場合、吐き気や嘔吐を伴います。患者はまた、耳鳴り、難聴、およびその他の関連する問題などの症状を経験するかもしれません。これらの症状は、頸椎症、脳アテローム性動脈硬化症、異常な血圧などの状態と頻繁に関連しています。脳血管疾患は、特に中高年に多くみられ、これらの基礎疾患と関連していることが多い2,3,4。

抵抗性動脈は、心血管機能と身体の恒常性の維持に重要な役割を果たします。血管抵抗の主要な部位として、それらは血圧と心拍出量を調節し、組織や臓器の代謝的および生理学的要求を満たすのに十分な血流を確保します5。抵抗性動脈として分類される脳底動脈は、主に脳幹への血流を調節します6。抵抗性動脈の壁を形成する平滑筋細胞は、定常状態の収縮または血管張力の調節を通じて血管抵抗の主要なメディエーターです。これらの細胞は、K+チャネル、Ca2+チャネル、Cl-チャネルなど、血管緊張の調節に重要な多数のイオンチャネルを保有しています5,7。

K+チャネルは、膜電位を確立し、動脈平滑筋細胞の収縮緊張を調節する上で重要である8。動脈平滑筋には、電位依存性K+(Kᴠ)、Ca2+依存性K+(KCa)、ATP依存性K+(KATP)、および内向き整流器K+(Kir)チャネル9,10,11の4種類のK+チャネルがあります。Kir チャネルは 7 つのサブタイプに分類され、Kir2.x は従来の Kir チャネルです。これらの中で、Kir2.xサブファミリーは血管系に最も関連性があります。Kir電流は、負の電圧では内側への整流を示し、セルへのK+の正味の流入を示しますが、正の電圧では、正味のK +電流の流れは最小限またはまったくありません5。心血管系では、Kirチャネルは膜電位を安定させるために不可欠です。それらの活性化は、細胞膜の過分極と血管拡張を誘発します12,13,14。

新たに単離された平滑筋細胞に対するパッチクランプ実験は、冠動脈、大脳動脈、腎臓動脈、腸間膜動脈15,16を含む様々な動脈で行われている。細胞の単離に同じタイプのコラゲナーゼを使用する方法もありますが、正確な手順は異なります。血管平滑筋細胞を分離する方法を包括的に要約した研究はほとんどありません。したがって、この研究では、ラット脳底動脈からの一次血管平滑筋細胞の新たな単離と、全細胞パッチクランプ技術を使用したこれらの細胞のKirチャネル電流の記録に焦点を当てており、関連分野の研究者に詳細で完全なプロトコルを提供します。

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プロトコル

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この動物実験は、成都中医薬大学実験動物福祉倫理委員会によって承認されました(記録第2024035号)。この研究では、体重260〜300 g、8〜10週齢の雄のSprague-Dawley(SD)ラットを使用しました。動物には水と餌(SPF実験動物飼料)が自由に与えられました。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 資料表に記載されています。

1.ラット脳底動脈解離

  1. 溶液調製
    1. 表1の説明に従って溶液を準備します。
  2. 2%イソフルランを吸入してラットに麻酔をかけます。.つま先をつまんで深い麻酔を確認します。必要に応じて、追加の麻酔薬を投与します。すぐに頭蓋骨を開き、携帯型手術台に脳を露出させます。
  3. 脳を、4°Cで95%O2 および5%CO2 で飽和したPSSを含むシャーレに迅速に移します。 溶液のpHが7.40であることを確認してください。
  4. 脳をペトリ皿で腹側を上向きに置き、針で固定します。.光学顕微鏡下で、脳底動脈を特定し、オートクレーブ滅菌したピンセットとハサミを使用して周囲の組織を慎重に除去します( 図1Aを参照)。
  5. 直径25μmの長さ2cmのワイヤーを孤立した脳底動脈に挿入します。ワイヤーで内壁をそっとこすり、血管内皮を効果的に取り除きます。
    注:ラットの脳底動脈は、脳の基部にある脳幹の基底溝内に位置し、左右の椎骨動脈の合流点によって形成されます2。分離プロセス中は、損傷を引き起こす可能性のある過度の伸張や圧迫を避けるために、動脈を慎重に取り扱ってください。

2. 平滑筋細胞の分離

  1. 試験管1、2、および3で、それぞれ1 mLの細胞分離溶液、1 mLの酵素加水分解物I、および1 mLの酵素加水分解物IIを37°Cに予熱します( 図1Bを参照)。
  2. 孤立した脳底動脈を試験管2に移します。95% O2 と 5% CO2 の混合物をチューブに連続的に注入し、酵素処理を 30 分間維持します ( 図 1C を参照)。
  3. 試験管2から試験管3に脳底動脈を移します。95% O2 および 5% CO2 をチューブに注入し続け、酵素処理を 5 分間維持します ( 図 1D を参照)。
  4. 試験管1から試験管3に37°C細胞分離溶液1 mLを加えます。酵素処理を3分間維持しながら、95%O2 および5%CO2 を注入し続けます。脳底動脈の準備を三分して細胞を放出します( 図1Eを参照)。
  5. 試験管3に4°Cの分離溶液を加えて、酵素プロセスを終了します( 図1Fを参照)。混合物を59 × g で6分間遠心分離します。ピペットを使用して上清を捨て、再度4°Cの分離溶液を加え( 図1Gを参照)、遠心分離を2回繰り返して残留酵素を除去します。
  6. ピペットを使用して上清を取り除き、細胞懸濁液1 mLを4°Cで最大6〜8時間保存します。
  7. 細胞懸濁液100μLを取り出し、浴中に置きます( 図1Hを参照)。1 mLの細胞外液を浴に加え、細胞が底部に付着するまで40分間静置します( 図2を参照)。
    注:処理群の細胞(BaCl2 またはニトロプルシドナトリウムなど)については、付着期間中に室温(22〜26°C)で40分間、それぞれの物質と事前にインキュベートします。

3. 全細胞パッチクランプによるKir電流の記録

  1. マイクロピペットの製作
    1. マイクロピペットプーラーの電源を入れます( 材料の表を参照)。
    2. ガラス管(外径1.5mm、内径1.10mm、長さ10cm)をプーラーに入れます。 プログラム1を選択し、 Enterキーを押して、 プログラム1にアクセスします。コントロールパネルの[ ランプ ]をクリックしてランプテストを実行し、ガラス管の熱値を測定します。
      注意: 次のパラメータでプログラム1を編集します:熱:ランプ、引っ張る:0、速度:25、遅延:1、圧力:500、モード:遅延、安全熱を有効にします。ランプテストは、フィラメントまたはガラスピペットのタイプを変更するときに実行する必要があります。マイクロピペットの先端径は~1〜2μm、コーンの長さは約5mmである必要があります。チップ径が小さく、コーンが長いほど、ピペット抵抗が高くなります。
    3. 新しいガラス管を挿入し、 プログラム1を選択します。 Enter をクリックして、マイクロピペットを作製します。
  2. Kir電流の記録
    1. ハードウェアデバイス(デジタル-アナログコンバーター、信号増幅器、マイクロマニピュレーター、顕微鏡、カメラ、コンピューター)を順番にオンにします。
    2. ソフトウェアをカメラ、信号増幅器、データ集録ソフトウェアの順序で起動します。
      注意: 顕微鏡にカメラが装備されていない場合は、機器ソフトウェアのみをアクティブ化する必要があります。ハードウェアの初期化後にソフトウェアが開いていることを確認し、適切な機能を有効にします。
    3. データ・アクイジション・ソフトウェアで、「 ファイル」>「データ・ファイル名の設定 」を選択して、データ・ストレージ・パスを設定します。
    4. Kir電流を記録するためのプロトコルを次のように編集します。
      1. 波形インターフェース: エポック A & D: タイプ = ステップ;第1レベル = −60mV;デルタ・レベル = 0 mV;最初の期間 = 100 ミリ秒。デルタ期間 = 0 ミリ秒 エポック B: タイプ = ステップ;第1レベル = −160mV;デルタ・レベル = 0 mV;最初の期間 = 1 ミリ秒。デルタ期間 = 0 ミリ秒 エポック C: タイプ = ランプ;最初のレベル = 40 mV;デルタ・レベル = 20 mV;最初の期間 = 500 ミリ秒。デルタ期間 = 0 ミリ秒
      2. モード/レート インターフェイス: 試行遅延 = 0 秒。ラン = 1;スイープ = 1;スイープ時間 = 0.8 秒
      3. 出力インターフェース:チャネル#0;保持レベル = −60mV。プロトコルを保存し、"Kir protocol" という名前を付けます。
        注:プロトコルのセットアップは、特定の現在の録音に合わせて調整されており、保存後に再利用できます。出力インターフェースが機器の配線(チャンネル#0など)と一致していることを確認してください。
    5. データ集録ソフトウェアのツールメニューでメンブレンテスト機能を有効にします。
    6. 測定するセルを顕微鏡のカメラビューの中央に配置します。
    7. 基準線の先端を浴液に浸します。マイクロピペット(ステップ3.1で作製)の20%を細胞内溶液で満たし、記録電極ホルダーに固定します。
      1. シリンジを使用して正圧を加え、ピペットチップを浴溶液に移動し、信号増幅器ソフトウェアでピペットオフセットを調整して、電流ベースラインを0 pAに設定します ( 図3Aを参照)。
        注意: Ag/AgCl リファレンス ワイヤを使用してください。ピペット抵抗は4〜6MΩである必要があります。
    8. ピペットを細胞膜にそっと押し付けます。シール抵抗(Rt)が少なくとも1MΩに増加するのを観察します(図3B)。正圧を取り除き、負圧を適用して、Rt≥1GΩの高抵抗を確立します(図3C)。
      1. 保持電圧を-60mVに設定し、Cp FastとCp Slowを使用して電極容量を補償します(図3D)。
        注:Rtが1GΩを超える場合は、次の手順に進みます。それ以外の場合は、セルまたはピペットを交換し、手順3.2.6〜3.2.8を繰り返します。
    9. 短時間の負圧を加えて細胞膜を破裂させ、細胞全体の構成を形成します(図3E)。信号増幅器ソフトウェアで Whole Cell を選択し、膜容量補償のためにAutoをクリックし(図3F)、Kirプロトコルをロードしてデータ記録を開始します。処理した細胞について、手順3.2.6〜3.2.9を繰り返します。
      注:直列抵抗(Ra)が>30MΩの場合は、新しいセルを選択します。Ra > 30MΩ > 10MΩ の場合は、直列抵抗補償を適用してから集録してください。このプロトコルには、Ra < 10MΩが必要です。
  3. データの分析
    1. データ解析ソフトウェアを開き、記録したデータをロードします。カーソルを使用して電流トレースを解析し、I-V曲線プロット用のデータをエクスポートします。
    2. 「 Edit (編集)」>「Create Stimulus Waveform Signal (刺激波形信号を作成 )」を選択し、確認して、刺激波形信号を作成します。
    3. 「Edit > Transfer Traces」を選択し、完全なトレース領域と信号(A0 #0)を指定し、データをコピーしてさらに解析することで、Kirプロトコルトレースをエクスポートします。
    4. 代表的な Kir 電流トレースをエクスポートするには 、[Edit > Transfer Traces] を選択し、完全なトレース領域と信号 (IN 0) を指定し、データをコピーして電流トレース プロットを生成します。
      注:電流密度(pA / pF)を使用して電流データを正規化し、さまざまなサイズのセル間で正確に比較します。実験中に膜の静電容量(Cm)が記録されていることを確認します17。

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結果

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動脈平滑筋細胞の単離
手順の最初のセクションでは、ラットの脳脳底動脈から平滑筋細胞を分離するプロセスについて詳しく説明します。このプロセスを 図 1 に示します。この手順には、動脈から平滑筋細胞を放出するための酵素消化と細胞分離ステップが含まれます。

単離された平滑筋細胞の代表的な画像
2番目のセクションでは、単離された平滑筋細胞の代表的な図を示します。 図2 には、紡錘形平滑筋細胞の明視野像が含まれており、その特徴的な形状から平滑筋細胞としての同一性が確認されています。

全細胞パッチクランプ技術
3番目のセクションでは、新たに分離された平滑筋細胞のKir電流を記録するために使用される全細胞パッチクランプ技術のフローチャートを概説します。 図 3

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ディスカッション

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新たに単離された細胞を用いた全細胞記録は1980年代初頭にさかのぼり18、1990年代にはげっ歯類の脳底平滑筋細胞からのチャネル電流の記録が広く行われるようになった19。技術の進歩に伴い、研究者はこれらの技術を通じて達成された結果にますます注目しています。しかし、技術的な方法の更新と要約に向けられる注意は徐々に減少しています。この論文では、血管平滑筋細胞の新鮮な分離と、その後のこれらの細胞を使用してKir電流を記録するための詳細な方法を紹介し、研究者が標準的な方法論的プロセスを理解するのを支援することを目的としています。

血管平滑筋は、動脈の緊張を調節する上で重要な役割を果たします。血管平滑筋細胞を分離するための多数の方法が報告されており20,21,22,23,24,25、そのほとんどが酵素加水分解を伴う。

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開示事項

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著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、成都中国伝統医薬大学の「Xinglin Scholars and Discipline Talents Research Promotion Plan」(33002324)およびLuliang市の高レベルの科学技術人材を紹介するための主要な研究開発プロジェクト(2022RC28)の特別人材プログラムの支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ウシ血清アルブミンSigma, USAB2064
Barium chlorideMacklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaB861682
CaCl2Sangon Biotech Co., Ltd., ShanghaiA501330
カメラ浜松, 日本C11440
カメラソフトImage J, USAマイクロマネージャー2.0.0-gammal
コラゲナーゼ Fシグマ (米国C7926
コラゲナーゼ Hシグマ (米国C8051
コンピュータレノボ (中国)~
データ収集ソフトウェアMolecular Devices(米国Clampex 10.4
データ解析ソフトウェアAxon(米国clampfit 10.4
D-グルコース)Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA610219
デジタル-アナログコンバーターMolecular Devices, USAAxon digidata 1550B
DithiothreitolSigma, USAD0632
描画ソフト米国カリフォルニア州サンディエゴGraphPad 
EGTASangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China A600077
ガラス管DL Naturegene Life Sciences.USAB150-86-10
HEPESXiya Reagent Co., Ltd., Shandong, ChinaS3872
KClSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100395
KH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100781
MgCl2·6H2O三重バイオテック株式会社上海、中国 A100288
マイクロマニピュレーターサッター 米国MP285A
マイクロピペットプーラーサッター 米国P1000
顕微鏡オリンパス 日本IX73
Na2-ATPSigma 米国A26209
Na2HPO4Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA610404
NaClSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100241
NaH2PO4sub>Sangon Biotech Co., Ltd., ShanghaiA600878
NaHCO3Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100865
NaOHSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100173
PapainSigma, USAP4762
Potassium-D-gluconateSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA507810
Signal amplifierMolecular Devices, USAAxon MutiClamp 700B
Signal amplifier softwareMolecular Devices, USAMultiClamp Commander software
Sodium nitroprussideSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA600867
統計解析ソフトウェア米国カリフォルニア州サンディエゴGraphPad 
, China ) ) ) , China

参考文献

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