Eucommia ulmoides Bark Extractを用いた亜鉛系ナノ材料の製剤化とその創傷治癒能

サマリー

ここでは、 Eucommia ulmoides 樹皮から得られるポリイソプレンに富む水性抽出物を用いて酸化亜鉛(ZnO)ナノ粒子を合成するプロトコールを提示する。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)上に合成されたZnOナノ粒子が示す創傷治癒能を、シンプルで費用対効果が高く、効率的な方法であるスクラッチアッセイを用いて評価しました。

要約

Eucommia ulmoidesの樹皮からの水性抽出物は、多くの健康上の利点を持つ生理活性化合物の豊富な供給源として機能します。ここでのプロトコルは、Eucommia ulmoides樹皮媒介ポリイソプレンリッチ水性抽出物を使用して酸化亜鉛(ZnO)ナノ粒子の調製を検討することを目的としています。一方、提案されたプロトコルは、プロセスを容易にすることにより、創傷治癒材料の調製に関連しています。さらに、合成されたナノ粒子(Eu-ZnO-NP)の創傷治癒能を、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)単層上の単純なスクラッチアッセイを使用して評価しました。Eu-ZnO-NPによる24時間の処理後、HUVEC細胞の細胞増殖および遊走を評価した。研究の最後に、異なる濃度のEu-ZnO-NPで処理した傷のある単層では細胞の増殖と遊走が観察されましたが、対照細胞では細胞の遊走と増殖速度の低下が観察されました。選択された濃度のうち、20 μg/mL Eu-ZnOナノマテリアルは、より優れた細胞遊走と増強された創傷治癒能を示しました。

概要

薬用植物や植物由来の化合物は、多くの健康上の利点を示すことが示されています¹。世界保健機関(WHO)は、世界人口の80%がプライマリヘルスケアのために伝統的な薬用植物に依存していると報告しました。中国は、伝統的な中国医学(TCM)の実践でよく知られており、人気があります。漢方薬は、さまざまな病気を治療し、その生物学的可能性に利用されることが報告されています。薬用植物は、生理活性化合物の貯蔵庫として機能し、複数の治療的役割を果たします。薬用植物も傷の治療に利用されています。慢性創傷の治療に適用されるアプローチにはいくつかの種類があります².最近の調査では、薬用植物は、治癒のための好ましい条件を提供し、感染がなく、組織の再生を固定することにより、創傷治癒プロセスに関与していることが明らかになりました³。一方、薬用植物に含まれる生理活性化合物の抗菌性および抗真菌性は、創傷を治癒し、創傷治癒効率を高めるのに役立ちます⁴。

金属系ナノ材料は、その生体適合性と生分解性により注目されています。一般に中国のゴムの木と呼ばれる Eucommia ulmoides は、中国の在来種です。木の葉と樹皮は薬事に使用されます。最も重要なことは、植物種が中国の中央部と西部の省で栽培された^{ことです5}。Pengら⁶は、葉、樹皮、およびスタミネート花が治療の可能性を秘めた食用であることを報告しました。さらに、 E. ulmoidesは 、リグナン、フェニルプロパノイド、イリドイド、フラボノイド、アミノ酸、および微量元素の最良の供給源として機能します。さらに、樹皮は、血圧の制御、脂肪の低下、抗骨剤症や低血糖活動の促進など、さまざまな生物医学的用途に利用されています⁷。したがって、間違いなく、 E.ulmoides 樹皮抽出物は伝統的な中国医学で長い歴史を持っていることが証明されています。以前の報告では、天然ポリマーポリイソプレンが Eucommia ulmoides⁸の樹皮に豊富に含まれていることが示唆されていました。以上の情報に基づき、本研究では、 Eucommia ulmoides 樹皮抽出物を用いたナノマテリアルの作製を目指している。亜鉛と樹皮抽出物の組み合わせは、ナノ材料を調製するための魅力的な選択肢です。全体として、本研究の最終的な目的は、創傷治癒アプリケーションのための新しいハイブリッドナノ材料を作製することでした。

プロトコル

注:抽出物を調製する前に、得られた樹皮材料を脱イオン水を使用して2回洗浄し、日陰の場所で乾燥させました。日陰で乾燥させた樹皮は、密閉容器に保管されました。

1. Eucommia ulmoides樹皮抽出物の調製

1. Eucommia ulmoidesの木から採取した樹皮をハサミで細かく刻みます。
2. 刻んだ樹皮材料を二重蒸留水で2回洗います。
3. 樹皮片を37°C以下で24時間、日陰の状態で乾燥させます。
   1. 研究に使用した樹皮の量に基づいて、乾燥プロセスの時間を調整します。樹皮を完全に乾かしてから、樹皮を細かく刻んでください。直射日光を避けてください。
4. 20 gの陰干し樹皮を220 mLの滅菌二重蒸留水が入った円錐形のフラスコに移し、130°Cで20分間加熱します。
   1. 反応液の色が淡黄色に変わります。溶液の色の変化は10分後に起こります。溶液をさらに10分間加熱します。サンプル量に基づいて二重蒸留水の量を調整します。
5. ポリイソプレンを含む粗抽出物は、さらに使用するために4°Cで保存してください。糸状構造の形成は、抽出物中のポリイソプレンの存在を示しています。

2. E. ulmoides樹皮を介したZnOナノ粒子の生合成

1. 1 Mの硝酸亜鉛二水和物Zn(NO₃)₂ 〜50 mLの脱イオン水を500 mLの円錐形フラスコに加えます。磁気攪拌(60 RPM)を使用して連続的に攪拌します。Zn(NO₃)₂ が完全に溶解するまでに30分かかります。
2. 15 mLのE. ulmoides樹皮抽出物を1 M硝酸亜鉛二水和物(Zn(NO₃)₂)溶液20 mLに滴下します。
3. 蓋をした反応混合物をマグネチックスターラーに置き、スターラーのスイッチを入れ、(60 RPM)で3時間回転させます。
4. 1Nの水酸化ナトリウムNaOH(3 mL)溶液を反応混合物に滴下して、pHを9に調整します。溶液混合物が乳白色に変わり、pHが9以下になるまでNaOHを添加します。溶液は、ZnOナノ粒子が形成されると乳白色になります。
   1. 1 Mの硝酸亜鉛二水和物Zn(NO₃)₂ 溶液の調製量は、実験のニーズによって異なる場合があります。作りたての樹皮エキスを必ず使用してください。pHが10を超えると、ナノ粒子が凝集します。
5. 合成したEu-ZnO-NPを50 mLの遠心チューブに移し、100 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
   注:不純物は、すぐに洗うことで避けることができます。
6. 洗浄したEu-ZnO-NPをガラスプレートに集め、熱風オーブンで45〜50°Cで1時間乾燥させます。
   注:Eu-ZnO-NPが30分以上保持されると、ナノ粒子の物理化学的性質に影響を与える可能性があります

3. TEMによるサイズ確認

1. DDH₂O中に1 mg/mLのナノ粒子を調製し、5 μLのEu-ZnO-NPサンプルを銅グリッドにロードし、完全に乾くまで待ちます。銅グリッドにロードする前にサンプルをボルテックスします。
2. Eu-ZnO-NPsを含む銅グリッドをTEMサンプルホルダーにロードし、50倍および100倍の倍率で画像を取得します。
   注意: この手順では、ピンセットを使用してグリッドをピックアップする必要があります。

4. 細胞毒性評価

1. 96ウェルプレートの各ウェルに1×10⁴ HUVECを播種し、5% CO₂ 37°Cインキュベーターに入れます。
2. さまざまな濃度の0、10、20、30、40、および50μg/mLのEu-ZnO-NPを10μLを90%コンフルエントセルに添加し、24時間インキュベートします。
3. インキュベーション後、細胞を乱さずに古い培地を取り出し、90 μLの新鮮なDMEM培地を含む各ウェルに10 μLのCCK-8溶液を加え、5% CO₂、37°Cのインキュベーターでインキュベートします。
4. 分光光度計を使用して、CCK8溶液で処理した細胞の450nmの吸光度を測定します。
   注:吸光度は、吸光度の変化を避けるために、15分以内にすぐに測定されました。

5. スクラッチアッセイ用HUVEC細胞の作製

1. Dulbeccoの改変イーグル培地を含む12ウェル培養プレートに、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペン連鎖球菌を含む12ウェル培養プレートに適切な量(1×10.5)のHUVECを播種し、5%CO₂ 37°Cインキュベーターでインキュベートします。
   1. スクラッチアッセイを行う前に、倒立顕微鏡を使用してコンフルエンシーを確認してください。
      注:スクラッチアッセイを実施するために、要件に基づいて6ウェルプレートまたは12プレートが使用され、細胞密度は培養プレートによって異なります。70%-80%のコンフルエント細胞の使用は理想的であり、スクラッチアッセイに推奨されます。DMEM培地の量は、研究で使用した培養プレートによって異なる場合があります。例えば、6ウェルプレートには1〜1.5mLの培地が必要であり、12ウェルプレートには0.5〜1.0mLの増殖培地が必要です。
2. 傷幅200μmの代表的な創傷に滅菌済みの200μLピペットチップを使用して、優しく引っかき傷をつけます。
3. 細胞単層に傷を付けるために使用した先端が細胞の表面に接触していることを確認してください。
   注意: 傷がつくたびに、滅菌チップを使用してください。
4. 培地全体を取り出し、1x PBSの1 mLを使用してHUVEC単層を洗浄し、剥離した細胞を除去します。
   注:剥離した単層細胞がそれぞれのウェルから完全に除去されていることを確認してください。傷ができた部分に損傷が発生していないことを確認します。
5. 合成されたEu-ZnO-NPの創傷治癒能を評価するには、0(コントロール)、10、および20μg/mLの濃度のEu-ZnOナノ粒子を10%FBSを含む完全な培地と組み合わせてウェルに加えます。実験プレートを5% CO₂ インキュベーターで37°Cに維持します。
   注:新鮮で完全な培地を追加している間、セル単層を乱さないでください。インキュベーション中に単層細胞が邪魔されないことを確認してください。
6. 倒立顕微鏡を使用して、0時間および24時間で顕微鏡写真を取得します。注釈ツールを使用して、さまざまな時間間隔で創傷の閉鎖を測定します。
   1. 創傷閉鎖率を次の式で計算します:創傷閉鎖 (%) = [ (0 時間での細胞遊走 (μm 単位) - 24 時間での細胞遊走 (μm 単位))/0 時間での細胞遊走 (μm 単位)] x 100 。

結果

本研究では、 Eucommia ulmoides の樹皮を用いてナノ粒子を合成することを目指しています。樹皮材は、日陰の環境で完全に乾燥させました(図1)。樹皮材料は、サンプルを130°Cで20分間加熱することにより、熱水水性粗抽出物を調製するために利用されました。温度と期間のわずかな変化は、植物化合物を混乱させ、水性抽出物の調製に適さなくなる可能性があります。 E. ulmoides の水性粗樹皮抽出物を調製し、ナノ粒子合成に利用しました(図2)。調製した抽出物は、すぐに利用できます。抽出物を長期間保存すると、合成プロセスに影響を与える可能性があります。したがって、ナノ粒子の調製には、新たに調製した抽出物が推奨されます。

粗樹皮抽出物を介したZnO NPの合成の成功は、乳白色の出現とpHの変化によって確認されました(図3)。pHはナノ粒子のサイズと密接に関連しており、pHが9を超えると凝集し、サイズが不均一になります。合成したナノ材料の構造をTEM解析により確認し、 図4に示すように、合成したナノ粒子の粒径は80-90nmを示しました。NaOHは、反応混合物の急激な変化を防ぐために、滴下する必要があります。金属ベースのナノ製剤は、適切で、安価で、毒性が最も低いです。しかし、金属ベースのナノ材料は、その生物学的機能でよく知られています。

HUVECs細胞に対するEu-ZnO-NPsの細胞毒性は、異なる濃度のEu-ZnO-NPsを24時間曝露したCCK-8アッセイによって決定した。その結果、Eu-ZnO-NPsは、高濃度の50 μg/mLでHUVECs細胞に対して細胞毒性に顕著な変化を示さなかったことが示されました(図5)。適切な量の細胞をロードし、滅菌済みの200μLピペットチップを使用して均一なサイズの創傷を作製しました。細胞量が限界を超えると、pHが変化し、増殖速度が遅くなる可能性があります。細胞の移動と創傷閉鎖は、治療の24時間後に治療群で観察されましたが、対照では同様の変化は観察されませんでした。.創傷治癒活性の結果、合成されたEu-ZnO-NPはHUVECs細胞株で創傷治癒特性を示すことが明らかになりました。20 μg/mLのEu-ZnOナノマテリアルを濃度すると、細胞の移動が速くなり、創傷治癒特性が向上します。最も重要なことは、合成されたEu-ZnOナノ粒子が濃度依存的な作用機序を示したことです。さらに、24時間後の処理後、傷のある単層では細胞の増殖と遊走が観察され、対照細胞では細胞の遊走と増殖速度が不十分でした(図6)。創傷閉鎖の割合は、コントロールで16%、続いて10μg/mLで51%、20μg/mLで20μg/mLの治療群で81.5%と観察されました(図7)。

図1: Eucommia ulmoidesの 樹皮片のコレクション。 水性温水抽出物の調製に使用された Eucommia ulmoides の樹皮の写真。抽出する前に、樹皮を徹底的に洗浄して不純物を取り除き、完全に陰干しする必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2: Eucommia ulmoides 樹皮抽出物の調製: ナノ粒子の合成に利用された Eucommia ulmoides 樹皮抽出物の写真。200mLの Eucommia ulmoides 樹皮抽出物は、20gの樹皮片を使用して調製されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3: Eucommia ulmoides 樹皮媒介ZnOナノ粒子の合成。 画像はEu-ZnOナノ粒子の形成を示しており、乳白色の溶液はEu-ZnOナノ粒子の形成を表しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:透過型電子顕微鏡分析: この画像は、 Eucommia ulmoides 樹皮を介したZnOナノ粒子の異なる倍率を示しています(A)100 nmの倍率と(B)50 nmの倍率。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:CCK-8細胞生存率アッセイ。 棒グラフは、0〜50μg/mLの異なる濃度で処理した後の細胞の生存率を表しているのに対し、処理されていない細胞はネガティブコントロールとして機能します。データは平均と標準偏差を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:創傷閉鎖評価のためのスクラッチアッセイ。 細胞を合成したEU-ZnO NP(10 μg/mLおよび20 μg/mL)およびEU-ZnO NPを含まない(対照群)処理し、24時間インキュベートしました。細胞の増殖および遊走は、EU-ZnO NPsで処理された細胞で観察された。 この 図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図7:創傷閉鎖率。 棒グラフは、EU-ZnO NP 処理の有無にかかわらず、0 時間および 24 時間での HUVEC 単層の創傷閉鎖率を表しています。データは平均と標準偏差を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

E. ulmoidesの樹皮、種子、葉は、多くの健康上の利点を示すと考えられています。私たちの結果は、EU-ZnOナノ粒子の合成がシンプルで費用対効果の高いアプローチを使用して達成されたことを示しています。水性抽出物を使用してナノ粒子を合成しました。樹皮材を高温で加熱すると、一部の植物成分が劣化し、抽出効率が低下する可能性があります。水性ハーブ抽出物に存在する植物成分は、金属イオンを還元してナノ粒子を形成することができます。硝酸亜鉛二水和物は、生体適合性および非常に^{安定した特性9}のためのZnOナノ粒子の調製に利用される。ナノマテリアルの合成または設計に最小から高毒性の金属元素を使用することはリスクが高く、生物医学的な主張には使用できません。この合成は、1日(24時間)以内に行うことができます。しかし、無毒の金属や生体適合性材料は安全であると考えられており、創傷治癒効率の評価に利用されています。合成されたナノ粒子の凝集の背後にある主な理由は、植物化学結合です。ナノ粒子の凝集は、ファンデルワールス相互作用の引力と表面間の引力によるものでした^10,11。ナノ粒子の凝集は、物理的および光学的特性に影響を与える可能性があります。ナノ粒子のサイズおよび形状は、焼成およびアニール¹²を用いて変更することができる。脱イオン水中でのナノ材料の再懸濁および超音波処理は、ナノ粒子の凝集を回避するのを助けることができる。水性抽出物中の生理活性化合物または官能基の存在は、還元プロセスに関与している可能性があります。ナノ粒子の収率は、合成プロセスに使用される反応混合物の体積にのみ依存します。ナノ粒子の大規模合成には、凝集や粒子サイズの不均一化など、いくつかの制限があります。

我々の知見と同様に、Aydin Acarら¹³ は、 カレンデュラ・オフィシナリス 花抽出物を介したZnOナノ粒子がL929細胞上で創傷治癒特性を示し、69.1%の創傷閉鎖を示すことを報告しました。さらに、 Crotalaria verrucosa 葉媒介ZnOナノ粒子は、40.45%の創傷閉鎖を有するHeLA細胞株で5μg/mLの濃度で創傷治癒能を示した¹⁴。Zhangら¹⁵は、 Euphorbia fisceriana を用いて合成されたZnOナノ粒子が、10μg/mLおよび15μg/mLの濃度で有意な創傷治癒特性を示したことを報告しました。これらの研究により、合成されたナノ製剤が創傷治癒剤として使用できることが証明されました。これらの研究の結果、合成された化合物は創傷を修復し、治療群の再上皮化を助けることができることが示されました。

止血と細胞移動は、創傷治癒における重要なプロセスと考えられています。HUVECの単層に作られた傷は、人工創を模倣するためにピペットチップを使用して作られました。さらに、同じ幅の傷を作ることは非常に難しく、複雑です。一方、これはより安価な方法です。このアッセイでは、設計されたナノ粒子が、コントロールと比較して10〜20μg/mLの濃度でHUVEC上で優れた創傷治癒特性を示すことが観察されました。さらに、合成されたEu-ZnO-NPは、毒性作用を引き起こすことなく、細胞単層に形成された傷を修復する効力を持っています。これらの in vitro 実験は、動物モデルを用いて合成されたポリマーベースのナノ材料の有効性を特定するために使用できる可能性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
12ウェルプレート	ネスト	703011	細胞培養とアッセイに使用
遠心分離機	SCILOGEX	SC1406	コロイド混合物からナノ粒子を分離するために使用
遠心分離管 – 15 mL	BIOFIL	CFT-312150	合成溶液を遠心分離するには
遠心チューブ – 5 mL	Biosharp	BS-50-CM-S	ナノ粒子を保存するには
CO2 インキュベーター	Thermo scientific	3010	HUVEC細胞を培養するには
ノイズ除去水	ミリポア	該当なし	抜粋の準備のため
DMEM培地	Cytiva	SH30243.01	細胞培養作業に使用
ファンネル	サーモサイエンティフィック	42600060	ろ過中に濾紙を保持するため
ガラスビーカー	ホウケイ酸	1102-50	抽出物の調製に使用されます
熱風オーブン	Genetimes	該当しない	ナノ粒子を乾燥させ、粉末状に収集するために使用されます
マグネチックスターラー	KYLIN-BELL	GL-5250-A	ナノ粒子合成に使用
顕微鏡	ニコン Eclipse	Ts2	顕微鏡撮影に使用
ペトリ皿	NEST	753001	ナノ粒子の採取に使用
ピペット 1 mL	ラボサイエンス	YEA17AD0055580	特定の量の溶液/抽出物を採取/追加するには
ピペットチップ 1 mL	SAINING	3014200-T	特定の量の溶液/抽出物を取る/追加するには
PTFE マグネティックミキサー攪拌器	LAN RAN	該当なし	ナノ材料合成プロセスに使用
水酸化ナトリウム	シグマ・アルリッチ	71690	合成時のpH調整に使用
ステンレスシザー	デリ	6034	樹皮材料の切り刻みに使用
T25組織培養フラスコ	NEST	707001	細胞の維持に使用
天秤	ラドワグ	AS220R2	化学物質の計量に使用
Whatman濾紙No.1	Newstar	GB / T1914-2017	の抽出物をろ過するために使用されます
	Sigma Alrich	13778-30-8	ナノ粒子の前駆体として使用の合成