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方法論記事

伝統的な漢方薬Flos sophorae immaturusからのフラボノイドルチンの抽出と特性化

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DOI：

10.3791/67417

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2025年10月31日

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1School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine

この記事について

サマリー

伝統的な中国医学 (TCM) は自然療法の選択肢の豊富な宝庫であり、世界中の多様な健康ニーズに対処する上で重要な役割を果たしています。この研究は、 Flos sophorae immaturusの重要な有効成分であるルチンの抽出、分離、および物理化学的特性に関する包括的な実験的調査を提示します。

要約

伝統的な中国医学 (TCM) は長い間、自然療法ソリューションの豊富な宝庫として機能し、世界中の多様な医療ニーズに対応する上で極めて重要な役割を果たしてきました。中医学で使用されるさまざまなハーブの中でも、 Sophora flavescens はその幅広い薬効成分で知られています。その応用は何世紀にもわたって遡り、特に心血管疾患の治療における治療効果により、現代医学で高く評価され続けています。生理活性フラボノイド化合物であるルチンは、植物界全体に広く分布しており、最も高い濃度は Flos sophorae immaturus に見られます。ルチンは、異常な毛細血管透過性と脆弱性を低下させ、心血管および脳血管の保護剤として作用することが報告されています。この研究は、 Flos sophorae immaturusに由来するルチンの物理化学的特性の抽出、分離、および特性評価のための詳細な実験プロトコルを提示します。さらに、アルカリ抽出および酸沈殿法を使用してTCMからフラボノイドを抽出するためのプロトコルが紹介され、説明されています。

概要

Sophora japonica L. のドライフラのつぼみである Flos sophorae immaturus (FSI) は、何世紀にもわたって伝統的な中国医学 (TCM) の基礎となってきました。その主な有効成分には、ルチン、イソケルシトリン、ソフォラエ フロース、その他のフラボノイドとサポニンが含まれます。これらの成分は、熱を取り除き解毒し、血液を冷やして止血し、血圧を下げるなど、さまざまな薬理効果を総合的に与えます。臨床現場では、FSI は主に、毛細血管透過性1 の保護、心血管系機能の維持2、血液の冷却、出血の停止、肝臓の火の調節3 の能力で評価されています。その治療特性は、乾燥重量の最大20%〜30%を構成する生理活性フラボノイドである高濃度のルチン(ケルセチン-3-ルチノシド)に起因します4。

ルチンは植物に広く分布するフラボノイドです。その化学名はQue-3-O-ルチン(C27H30O16)です(図1)。室温では、ルチンは淡黄色から黄緑色の結晶性粉末として現れます。融点は結晶形状と純度によって異なり、通常は 125 °C から 195 °C の範囲です。 ルチンは顕著な極性特性を示します:冷水にわずかに溶け、エタノールやメタノールなどの極性有機溶媒に非常に溶け、エーテルやクロロホルムなどの非極性溶媒にはほとんど溶けません。さらに、その溶解度はpHに敏感であり、ナトリウム塩またはカリウム塩を形成するフェノールヒドロキシル基の解離により、アルカリ条件下で大幅に増加します。これらの物理的特性は、その分子構造のポリヒドロキシル基および配糖体基と密接に関連しており5、その抽出プロセスと医療、食品、およびその他の産業への応用に直接影響します6。ルチンは植物に遍在していますが、FSIに最も豊富に含まれており、毛細血管の安定化7、抗炎症、抗酸化8、抗菌9、代謝調節効果10などの複数の薬理活性を示します。

その臨床的可能性にもかかわらず11、ルチンの水溶性と安定性が低いため、抽出と製剤化に課題が生じます5。これらの制限に対処するために、フェノールヒドロキシル基の pH 依存性挙動を活用したアルカリ抽出酸沈殿 (AEAP) 法が効果的な代替手段として登場しました。

ルチンの物理的特性に基づいて、AEAP法は、アルカリ性溶液へのルチンの溶解性を利用し、その後酸性条件下での結晶化を利用して、FSIからルチンを単離するための標準化された技術になりました12。AEAPは、フェノールヒドロキシル基のpH切り替え可能なイオン化を利用して収率を向上させ、FSIからの高純度ルチン抽出を実現します。アルカリ性条件(pH >10)では、フェノール-OH基が脱プロトン化して親水性-O- イオンを形成し、酸化分解を最小限に抑えながら植物組織からの完全な可溶化を可能にします。pH 2-3への酸性化は、このイオン化を逆転させ、極性不純物の共沈を最小限に抑えてターゲットフェノール類を沈殿させます。ルチンは、pH依存性の溶解度を持つポリフェノールとして、アルカリ性溶液(水酸化ナトリウムなど)に容易に溶解しますが、ヒドロキシル基のプロトン化により酸性条件下で沈殿します。AEAP は、有毒な溶媒を回避することでグリーン化学の原則に沿って、費用対効果が高く、スケーラブルで環境に優しい代替品を提供します13。これは、pH駆動の分離技術を支持する天然物化学の広範な傾向を反映しています14。クルクミン (ターメリック由来) とベルベリン ( 黄連由来) を単離するために同等の方法が採用され、選択的抽出のために特定の pH 値での溶解度の変化を利用します。AEAP法は、基本的な実験装置(pHメーター、遠心分離機など)のみを必要とするFSIのようなフラボノイドが豊富な供給源からの高収率のルチン製造に最適です。ルチン含有量が少ない植物マトリックスや複雑な干渉化合物の場合、抽出効率を高めるために、将来的には酵素加水分解前処理が検討される可能性があります。

結論として、AEAP はルチン抽出のための便利なアプローチであり、有効性、安全性、拡張性のバランスが取れています。TCM の近代化におけるその役割は、伝統的な慣行と現代の製薬基準を橋渡しする可能性を浮き彫りにしています。

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プロトコル

ルチンは複数のフェノールヒドロキシル基を含むフラボノイドで、高温のアルカリ性溶液に溶け、その後酸性化と沈殿が続きます。アルカリ抽出-酸沈殿法で抽出できます。この研究で使用された試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1. 実験準備

  1. 次の材料を入手します:Flos sophorae immaturus(20 g)、ホウ砂(0.8 g)、いくつかのビーカー、石灰粉末(1.5 g)、濃塩酸、温度計、およびpHテストストリップ。この画像の拡大版については、 図 2 を参照してください。

2.ルチンの抽出

注:ホウ砂と水の比率は、0.8 gのホウ砂と200 mLの水に使用してください。ライムミルクの比率は、1.5 gのライムパウダーと10 mLの水を使用します。pHを迅速かつ正確に調整します。必要に応じて失われた水を補充します。

  1. アルカリ抽出
    注:6cmの丸いろ紙を使用してろ過します。
    1. 500 mLのビーカーに250 mLの水と0.8 gのホウ砂を加えます。沸騰するまで加熱し、20 gの Flos sophorae immaturusを加えます。2〜3分間沸騰させ続けます。
    2. 沸騰後、かき混ぜながらライムミルクでpHを8〜9に調整します。20分間加熱を続けます。熱いうちにガーゼでろ過し、黄褐色の濾液を得る。
  2. 酸沈殿抽出
    1. 濃塩酸を使用して抽出物をpH 2〜3に調整し、沈殿させます。透明な黄褐色の溶液から濁った溶液に変化し、容器の底にオレンジがかった黄色の凝集沈殿物が徐々に形成されることは、効果的なルチン分離を示しています。
    2. 6時間放置した後、沈殿物を大気圧吸引ろ過にかけます。粗ルチンを得るために収集して乾燥させます。
      注:使用するブリネル漏斗サイズ(直径150 mm)に従ってフィルターフィルムをカットします。
    3. 大気圧吸引ろ過中に沈殿物を中性になるまで水で洗浄します。

3. ルチンの精製

  1. 粗計量後、熱水を用いて溶解度比1:200でルチンを再結晶化する。水溶液を30分間沸騰させ、熱いうちにろ過します。ルチン溶液の最終容量が210mLであることを確認します。
  2. 残留物をろ過します。濾液をそのまま放置してから、再度ろ過し、60〜70°Cのオーブンで真空下で乾燥させて、精製されたルチンを得る(図3)。
    注:使用するブリネル漏斗サイズ(直径150 mm)に従ってフィルターフィルムをカットします。

4. ルチンの物理化学的同定

  1. 塩酸塩‐マグネシウム塩反応―フラボノイド親核の同定
    1. サンプル1〜2mLをメタノールに溶解し、50mgのマグネシウム粉末を加えます。
    2. 濃塩酸を数滴加えます。軽く振ってください。溶液が赤に変わるはずです(図4)。
  2. モリッシュ反応 - 糖化合物の同定
    1. αナフトールの10%エタノール溶液を加えて振とう。試験管を傾け、内壁に沿って濃硫酸を慎重に滴下します。
    2. 界面に茶色のリングが形成されているのを観察します(図5)。
  3. ジルコニア-クエン酸反応のグリーン化
    1. サンプルのエタノール溶液に1〜2 mLの10%αナフトール溶液を加えます。よく振ってください。濃縮H2SO4 を振らずにチューブの壁に沿って10滴ゆっくりと加えます。
    2. 2%クエン酸メタノール溶液を加えます。溶液の色が明るくなるはずです(図6)。
  4. 薄層識別
    1. 精製ルチンとルチン標準の両方を使用してください。
    2. 現像剤としてクロロホルム:メタノール:ギ酸(15:5:1)を使用し、発色剤としてAlCl3 の1%エタノール溶液を使用します。365 nmのUVランプの下で蛍光を観察します。

5.ルチンのTLC検査

注:ルチンの純度を評価するために、薄層クロマトグラフィー(TLC)法を採用しました。固定相としてシリカゲルプレートを使用しました。

  1. 精製されたルチンサンプルとルチン標準物(メタノール中1 mg/mL)をプレート上にスポットします。酢酸エチル:ギ酸:水(8:1:1、v/v/v)からなる移動相でプレートを現像します。
  2. 乾燥後、254 nmのUV光下でプレートを視覚化します。
  3. サンプルスポットの保持係数(Rf)を計算し、標準と比較してください。
    注:同一のRf値(これらの条件下で約0.35〜0.50)を持つ単一のスポットは高純度を示し、追加のスポットは不純物の存在を示唆しています。

6. HPLCによるルチン純度の測定

注:ルチンの純度は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって定量的に分析されました。分析条件は次のとおりです。クロマトグラフィーカラム-(250 mm × 4.6 mm、5 μm);移動相-アセトニトリル(A)および0.2%酢酸水溶液(B)。線形グラジエント溶出プログラム:0-15分、20%-30%A;15-30分、30%-60%A.流量-1mL/分。注入量-10 μL。検出波長-355 nm。カラム温度-40°C。

  1. ルチンサンプル粉末0.1gを正確に計量し、10mLの遠心分離管に移します。60%エタノール溶液5.0mLを加え、よく振とうします。
  2. 恒温ウォーターバスまたはカラムオーブンを30°Cに設定し、サンプルを30分間超音波処理します。
  3. サンプルを室温で55,900 × g で10分間遠心分離します。上清をHPLC分析の試験溶液として使用します。

7. LC-MSによるルチンの定量

注:単離された化合物は、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)によって同定されました。LC 条件は HPLC 法と一致しました。質量分析は、キャピラリー電圧3.5kVの負イオンモードでエレクトロスプレーイオン化(ESI)を使用して実行されました。脱溶媒和温度-350°C;マススキャン範囲-M/Z 100-1000。

  1. 精製したルチンサンプル10 mgを秤量し、2 mLの微量遠心チューブに移します。サンプルが完全に溶解するまで、ピペットを使用して0.6mLの重水素化DMSOを加えます。同じ手順を使用してルチン標準溶液を調製します。
  2. 陽子核磁気共鳴(1H NMR)分光法を使用して、処理されたサンプルと標準物質を分析します。
  3. 互換性のあるソフトウェアを使用してスペクトルデータを処理します15.
  4. スペクトルデータをNISTやPubChemなどの文献やデータベース参照と比較して検証します。

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結果

ルチンの物理化学的同定実験では、マグネシウム粉末と少量の濃塩酸を添加した後、溶液が赤くなり、その後振とうと、フラボノイド親核の存在が示されました。モリッシュ反応では、界面に紫色のリングが形成され、陽性の結果と分子構造に糖部分が存在することを示しています。メタノールに2%クロロ酸化試薬を添加すると、サンプル溶液は明るい黄色に変わり、3-OHまたは5-OH基を含むフラボン構造の存在を示唆しました。その後、メタノールに2%クエン酸を添加すると、溶液の色が明るくなり、5-OHのみが存在することが示されました。

ルチンサンプルとルチン標準を比較したTLC実験では、標準は特定のスポット位置と特徴的な着色を示しました16。クロマトグラムを比較したところ、サンプル中のスポットの数と位置が標準物質のスポットとほぼ一致し、アルカリ抽出および酸沈殿法17によって抽出されたルチンの純度が高いことが示されました。

TLC、HPLC、LC-M...

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ディスカッション

ルチンの抽出は、主にアルカリ抽出酸沈殿法(AEAP) 6 に基づいており、装置要件が簡単で、操作が容易で、効率が高く、低コストであるという利点があります。この技術は、マイクロ波支援抽出 (MAE)7 および超音波支援抽出 (UAE)8 によって補完されることが多く、試薬の消費量を削減し、抽出時間を短縮し、全体的な収量を向上させます。

研究によると、pH は沈殿した固体中の固体抽出速度とケルセチン含有量の両方に大きな影響を与えることが実証されています。したがって、ルチン収率を最大化するには、アルカリ溶液の濃度と抽出時間を正確に制御することが不可欠です。過剰なアルカリは不要な化合物を溶解し、それによって抽出物の純度を損なう可能性があります18。同様に、沈殿中に使用される酸の種類と濃度も結果に重要な役割を果たします。適切な酸性度はル...

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開示事項

この論文の著者は、この研究を実施し、この記事を執筆する過程で発生した可能性のあるすべての利益相反を開示したことをここに宣言します。私たちは、この研究で提示された結果や結論の解釈に偏りを与える可能性のある経済的、個人的、または職業上の関係がないことを確認します。具体的には、本報告された調査結果から恩恵を受ける可能性のある製薬会社、研究機関、その他の団体とは一切関係ありません。最後に、私たちの調査結果と結論は、この論文で提示されたデータと分析のみに基づいており、いかなる外的要因の影響も受けていないことを確認します。私たちは、すべての研究活動において、最高水準の学術的誠実さと倫理的行動に引き続き取り組んでいます。

謝辞

実験プラットフォームを提供してくださった北京中医薬大学製薬化学研究所に深く感謝申し上げます。彼らのサポートとリソースは、私たちの研究と実験の実施において非常に貴重です。私たちは、科学の卓越性に対する彼らの献身と、若い研究者の育成への取り組みに深く感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1-ナフトールマックリンC16245764
酢酸マックリンC12662811
アセトニ トリルマックリンC16129374
塩化アルミニウムマックリンC16485922
クエン酸マックリンC16429480
DMSO福辰(天津)化学試薬有限公司20230306
エタノール福辰(天津)化学試薬有限公司20250102
エチルアセテート福辰(天津)化学試薬有限公司20240318
Flos sophorae immaturus北京通連堂10092026329782
蟻酸福辰(天津)化学試薬有限公司20150402
‌MestReNovaメストレラボ研究/
メタノール イノケムC16365684
シリカゲル 60F254スティーマ20210222
エクスカリバーサーモフィッシャー・サイエンティフィック/
ジルコニル塩化オクタハイドレートマックリンC15350627

参考文献

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