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方法論記事

肺腺癌に関連する原発性シェーグレン症候群:潜在的な一般的な病原性メカニズムの調査と実験的検証

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DOI:

10.3791/67421

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2024年9月20日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 2Oncology Department, Wangjing Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, 3The Second Department of Healthcare, China-Japan Friendship Hospital, 4Rheumatology Department, Shangqiu Hospital of Traditional Chinese Medicine

この記事について

サマリー

この原稿では、バイオインフォマティクス分析と実験的検証を通じて、原発性シェーグレン症候群と肺腺がんを結びつける可能性のある一般的な病原性メカニズムを調査するための運用手順と予防措置について説明します。

要約

この研究は、バイオインフォマティクス分析と実験的検証を通じて、原発性シェーグレン症候群(pSS)と肺腺癌(LUAD)を結びつける可能性のある一般的な病原性メカニズムを調査することを目的としています。pSSおよびLUADに関連する遺伝子は、Gene Expression Omnibus(GEO)データベースおよびGenecardデータベースから取得されました。続いて、pSSおよびLUADに関連する差次的に発現する遺伝子(DEG)をpSS-LUAD-DEGとしてスクリーニングした。京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)とGene Ontology(GO)のエンリッチメント解析を行い、pSS-LUAD-DEGの重要な生物学的機能を解明しました。コアターゲットは、タンパク質間相互作用(PPI)ネットワークを構築することによって特定され、レシーバー操作特性(ROC)曲線分析を通じてハブ遺伝子診断の精度をさらに評価しました。本研究では、NOD/LtjマウスをpSS動物モデルとして、粒子状物質2.5(PM2.5)で刺激して炎症反応を起こさせた。定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、およびウェスタンブロッティングを使用して、関連する分子生物学実験の検証を行いました。KEGGとGOの濃縮分析を通じて明らかになった結果は、炎症がpSSとLUADの結合に重要な役割を果たしていることを示しています。IL6、CCNA2、JAK2、IL1B、ASPM、CCNB2、NUSAP1、CEP55がpSS-LUADの主要なターゲットとして決定されました。BALB/cマウスおよびNOD/Ltjマウスは、PM2.5による21日間の刺激後に肺組織における炎症性サイトカインIL-6およびIL-1βの発現が亢進し、JAK2/STAT3シグナル伝達経路を活性化し、腫瘍関連遺伝子CCNA2、CCNB2、およびCEP55の発現をアップレギュレートし、NOD/LtjマウスはBALB/cマウスよりも顕著な変化を示しました。このプロトコルは、肺の炎症性微小環境によって誘発される発がんが、pSS 患者における LUAD の高い発生率の主な理由である可能性があることを示しています。さらに、ブロッキング関連のメカニズムは、pSS 患者における LUAD の発生を防ぐのに役立つ可能性があります。

概要

原発性シェーグレン症候群(pSS)は、外分泌腺のリンパ球浸潤を特徴とする自己免疫疾患で、ドライアイ(眼球乾燥症)と口渇(口内乾燥症)の臨床症状を引き起こします1,2。pSSは通常、高グロブリン血症3、間質性肺疾患4、腎尿細管性アシドーシス5、神経学的損傷6、および血小板減少症7などの関与の腺外症状を伴い、これらは主要な予後不良因子を構成します。近年、一連の研究により、pSSは一般に、血液悪性腫瘍や固形腫瘍などのがんの有病率の増加を伴うことが示されています8,9,10。肺がんは、最も一般的なpSS関連がんの1つであり、特に肺腺がん(LUAD)11です。

全体として、さらなる調査により、LUAD を伴う pSS には、いくつかの根本的な共通の病因がある可能性があることが示唆されました。私たちの現在の知識によると、2つの疾患の共通のメカニズムを説明する特別な研究はまだありません。近年、バイオインフォマティクス解析により、種間で共有される可能性のある疾患メカニズムを明らかにする可能性がもたらされました12,13,14。そのメカニズムをさらに解明するために、バイオインフォマティクス解析を用いてpSSとLUAD間の共通標的やシグナル伝達経路を解析し、その後、動物モデルを確立して実験的検証を行っています。これらのメカニズムを明らかにすることは、pSS患者におけるLUADの臨床的予防のための証拠基盤を提供するのに役立つかもしれません。

この研究では、GEOデータベースとGenecardデータベースを使用して、pSSとLUADに関連する遺伝子を取得しました。その後、pSSおよびLUADに関連するDEGをpSS-LUAD-DEGとしてスクリーニングしました。KEGGとGOの濃縮解析を行い、pSS-LUAD-DEGの重要な生物学的機能を解明しました。PPIネットワークの構築を使用してコアターゲットを特定し、ROC曲線解析を通じてハブ遺伝子診断の精度をさらに評価しました。NOD/LtjマウスをpSS動物モデルとして用い、粒子状物質2.5(PM2.5)で刺激して炎症反応を起こさせた。QPCR、ELISA、およびウェスタンブロッティングを実施して、試験を実験的に検証しました。全体として、ここでの結果は、肺の炎症性微小環境によって誘発される発がんが、pSS 患者における LUAD の高い発生率の重要な理由である可能性があることを示しています。また、pSS患者におけるLUADの発生は、ブロッキング関連のメカニズムによって予防される可能性があることも示唆しています。

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プロトコル

実験動物は、中国の国家基準である「実験動物環境および住居施設の要件」(GB14925-2010)に沿った動物の飼育環境に適合した中日友好病院の動物施設に収容されました。すべての動物の世話の手順と実験は、ARRIVEガイドラインに準拠し、3Rの原則(削減、交換、改良)に基づいており、中国の国家動物福祉法のガイドラインに準拠していました。BALB/cマウスはSPF(Beijing)Biotechnology Co., Ltd.から、NOD/LtjマウスはHuafukang(Beijing)Biotechnology Co., Ltd.から購入しました。

1. バイオインフォマティクス解析

  1. データセットの準備
    1. Gene Expression Omnibus(GEO)データベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)15を開き、原発性シェーグレン症候群と肺腺がんをキーワードに遺伝子発現プロファイルを検索する。次に、GEO DataSets Databaseの結果をクリックし、Top OrganismsのHomo sapiensを選択します。目的のデータセットとそれに対応するプラットフォーム情報を選択してダウンロードします。
    2. Genecardデータベース(https://www.genecards.org/)16を開き、primary Sjögren症候群 と 肺腺癌 をキーワードとして、pSSとLUADの遺伝子を取得する。疾患遺伝子のスプレッドシートをダウンロードしてください。
  2. pSS と LUAD 間の共有 DEG の識別
    1. Rソフトウェア(https://cran.r-project.org/)をダウンロードして開きます17。GEOquery Rパッケージ、stringr Rパッケージ、ggplot2 Rパッケージ、reshape2 Rパッケージ、limma RパッケージをRソフトウェアにインストールします。
    2. Rソフトウェアを使用して、異なるGEOデータセット(GSE84844、GSE51092、GSE32863、GSE75037)で差次的に発現する遺伝子(DEG)を特定して視覚化し、これらのデータセット間で遺伝子発現を比較および分析します。調整されたP値が0.05<、倍率変化(FC)が1.2または0.83>の遺伝子をDEGと考え<。
    3. Genecardデータベースから、pSSおよびLUADに関連する発現レベルが20以上の遺伝子を選択します。
    4. pSS に関連付けられた DEG と LUAD に関連付けられた DEG を、GEO データベースと Genecard データベースの両方からマージします。
    5. VennDiagram パッケージを R にインストールして読み込み、pSS と LUAD に関連付けられた DEG (pSS-LUAD-DEG) を取得して視覚化します。
  3. 京都遺伝子・ゲノム大百科事典(KEGG)パスウェイエンリッチメント解析
    1. Metascape (https://metascape.org/)18の登場です。「Select File」をクリックし、pSS-LUAD-DEGsの.xlsx形式のファイルをアップロードします。[種として入力] で [H. sapiens] を選択します。同様に、Analysis as SpeciesでH. sapiensを選択します。
    2. [カスタム分析] をクリックします。「エンリッチメント」をクリックし、「KEGG Pathway」を選択します。「エンリッチメント分析」をクリックし、エンリッチメント分析が完了したら「分析レポート・ページ」をクリックします。
    3. 「All in One Zip File」をクリックして、結果をダウンロードします。ダウンロードEnrichment_GOフォルダ内の_FINAL_GO.csvファイルにアクセスして、結果を表示します。
    4. ggplot2パッケージを使用して、RでKEGG視覚化プログラムを実行します。
  4. Gene Ontology(GO)エンリッチメント解析
    1. clusterProfiler と enrichplot パッケージを R にインストールして読み込みます。
    2. pSS-LUAD-DEGのテキスト形式リストをRにインポートします。
    3. clusterProfiler パッケージと enrichplot パッケージを実行して、GO エンリッチメント分析と結果の視覚化を行います。0.05 <調整された P 値での分析の統計的有意性を定義します。
  5. タンパク質間相互作用(PPI)ネットワークの構築とモジュール解析
    1. Retrieval of Interacting Genes (STRING) データベース (http://string-db.org/)19 を入力します。[参照 ] をクリックし、pSS-LUAD-DEG のファイルをアップロードします。「 Homo sapiens in Organisms」を選択し、「 Search」をクリックします。
    2. 「続行」をクリックします。結果が利用可能になったら、[設定]をクリックします。[基本設定] > [最小必要インタラクション スコア] で、[高信頼度 (0.700)] を選択します。[詳細設定] で [ネットワーク内の切断されたノードを非表示にする] にチェックを入れ、[更新] をクリックします。
    3. タイトルバーの 「エクスポート 」をクリックして、PPI関係のテキストをTSV形式でダウンロードします。
    4. Cytoscape 3.7.1ソフトウェア(https://cytoscape.org/)20をダウンロードしてオンにします。 [ファイル] > [ファイルからネットワークをインポート ] をクリックして>PPI ネットワークを構築するための TSV 形式ファイルをインポートします。
    5. [ネットワーク アナライザ] ツールを使用して、ネットワーク内のトポロジ パラメータを解析します。ノードのサイズと色を最適化するには、左側のコントロールパネルのスタイルバーを使用します。
    6. メニュー バーで、[ツール] > [ネットワークの分析] を選択します。 [テーブル ] パネルで [次数 ] をクリックして、コンポーネントを次数で降順に並べ替えます。上位20の上位20個の遺伝子をハブ遺伝子として取ります。
    7. igraph と ggplot2 パッケージを R にインストールして読み込み、ハブ遺伝子を度数ごとに視覚化します。
  6. ハブ遺伝子の同定と検証
    1. RにpROCパッケージをインストールしてロードします。
    2. ハブ遺伝子のテキスト形式のリストを R にインポートします。
    3. ハブ遺伝子の受信者動作特性(ROC)曲線をプロットし、ROC曲線下面積(AUC)値を計算します。
      注: DEG のフィルタリングに関する R コードについては、 補足コーディング ファイル 1 を参照してください。

2. 実験的検証

注:このプロトコルで使用される材料、試薬、および機器の詳細については、 材料の表 を参照してください。

  1. 動物の調理法
    1. 9週齢の雌BALB/cマウス12匹と9週齢の雌NOD/Ltjマウス12匹を1週間適応的に給餌します。
    2. 乱数表を使用して、12匹の9週齢の雌BALB/cマウスをブランクコントロールグループとPM2.5グループに均等に割り当てます。同様に、9週齢の雌NOD/Ltjマウス12匹をpSS群とpSS-PM2.5群に均等に分けます。
  2. 粒子状物質2.5(PM2.5)懸濁液の調製
    注:PM2.5は、マウスモデル21において炎症関連LUADの発生と進行を誘導する可能性があります。BALB/cマウスおよびNOD/Ltjマウスは、PM2.5によって炎症関連の変化を発現するように誘導された。Piaoら22によって記載された方法によれば、PM2.5懸濁液の濃度は1mg / mLで調製されました。
    1. PM2.5石英繊維膜の秤量し、2cm×2cmに切り、適量の脱イオン水を入れたビーカーに浸します。
    2. ビーカーを密封し、毎回37°Cのウォーターバスソニケーターで30分間超音波処理します。粒子が完全に溶解するまで、このプロセスを3回繰り返します。
    3. ビーカー内の液体を16層の滅菌医療用ガーゼでろ過し、ガーゼから残留水分を絞り出します。
    4. 濾液を平らな皿に置き、-20°Cの冷凍庫で氷の塊に凍結します。次に、凍結乾燥装置(-52°C、0.1 mbar、48時間)を使用して、ろ液の氷塊を乾燥させ、粉末粒子を収集します。
    5. 粉末状の粒子を生理食塩水に十分に溶解し、濃度1 mg/mLのPM2.5懸濁液を調製します。PM2.5懸濁液をガラス瓶に注ぎ、高圧滅菌器に入れ、高圧と高温(121°C、15psiで15分)を適用して滅菌します。
    6. 超音波攪拌(200W、10秒の攪拌、10秒の休止、3サイクル)を行う。処理後は、後で使用するために4°Cの冷蔵庫に保管してください。
  3. PM2.5マウスモデル設立
    注:PM2.5グループとpSS-PM2.5グループは、PM2.5懸濁液を3日に1回、28日間、各用量で0.1mLの気管点滴で投与されました。ブランク対照群とpSS群には、3日に1回、28日間、各用量0.1mLの気管点滴による生理食塩水を投与しました。
    1. ケタミン(100 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)の混合物をマウスに注入します。つま先をつまむことに対する反応の欠如をチェックし、完全な筋肉の弛緩を確保することにより、麻酔の手術面を確認します。反射神経、呼吸、および全体的な反応を継続的に監視して、すべてのステップが完了するまで手順全体で適切な麻酔が維持されるようにします。
    2. 腹部を上に向けて、頭を上げ、尾を45°の角度で下げて、マウスを小動物の拘束具に置きます。細い糸を使用してマウスの上切歯をループし、上に引っ張り、糸を動物ホルダーのネジに固定して、マウスの口腔が完全に露出するようにします。
    3. コールドライトランプを開き、マウスの首の皮膚に光を当てます。鉗子を使用してマウスの舌を引き出し、声門を完全に露出させます。マウスの口腔内では、マウスの気道開口部の位置を示す光の繰り返しの開閉スポットを観察します。
    4. マウスの気管に18Gの静脈留置針を挿入し、針の芯を引き出し、静脈留置針の外側の端に綿糸を配置し、マウスの胸の動きに合わせて綿糸が動くのを観察しながら成功を確認します。
    5. 最初に1mLシリンジを使用して0.2mLの空気を吸引し、次に0.1mLのPM2.5懸濁液を吸引し、続いてさらに0.2mLの空気を吸引します。混合物を18Gの静脈留置針を通して気管に注入します。.
    6. 18Gの静脈留置針を引き出します。動物ホルダーを直立させて時計回りと反時計回りに30回回転させ、PM2.5懸濁液をマウスの肺に均等に分散させます。次に、マウスの首をまっすぐに伸ばし、窒息を防ぐために横に置きます。
  4. 標本の収集
    注:実験の29日目 に検体を採取し、その後の分子生物学分析に使用してください。
    1. 安楽死システムの接続を確認し、コントローラーの電源をオンにします。二酸化炭素(CO2)シリンダーバルブを開きます。
      注:動物を中に入れる前に、安楽死チャンバーを事前に充填しないでください。
    2. マウスをチャンバーに入れ、毎分チャンバー容積の30%〜70%でCO2 を注入します。マウスをCO2 に5分間さらし、マウスが動かず、呼吸しておらず、瞳孔が拡張していることを確認します。CO2 シリンダーバルブをオフにし、さらに5分間観察して死亡を確認します。
    3. 安楽死させたマウスを清潔な解剖ボードの上に仰臥位に置きます。気管、心臓、肺を露出させます。
    4. はさみと鉗子を使用して、腹側胸部と首の領域を覆っている皮膚と筋肉を取り除きます。はさみと鉗子を使用して、胸腔の両側の肋骨の端に沿って切開を行い、心臓と肺を含む胸腔を露出させます。次に、鎖骨を切開して、左右の肺葉を徹底的に調べるのに十分な幅の開口部を作ります。
    5. 胸骨と肋骨から顎まで伸びる首の筋肉を切除します。肋骨の前縁の下にハサミを挿入し、両側に切開をして気管を覆っている骨の部分を取り除きます。
    6. 鉗子で顎の近くの気管をつかみ、鉗子の上に置かれたはさみを使用して完全な横切開を行います。
    7. 鉗子で気管をそっと引き上げ、胸部組織全体が体から取り除かれるまで、はさみで腹側組織の接続を切断します。
    8. 肺を作業台に平らに置きます。肺組織表面の残留物を生理食塩水ですすぎ、濾紙で濾過して乾かし、凍結チューブに分注し、-80°Cで保存します。
  5. 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)
    1. 液体窒素を含む乳鉢を使用して肺組織を粉末に粉砕します。
    2. 精密天秤を用いて20 mgの粉砕組織を秤量し、遠心チューブ内で750 μLのBuffer RLと混合し、ボルテックスミキサーを用いて十分に混合し、室温(RT)で3分間静置します。その後、14,000 x g でRTで5分間遠心分離し、上清を回収します。
    3. ゲノムDNA(gDNA)フィルターミニカラムを2 mLコレクションチューブに入れます。上清をgDNAフィルターミニカラムに移し、14,000 x g でRTで2分間遠心分離します。
    4. gDNAフィルターミニカラムを廃棄します。濾液に等量の70%エタノールを加え、ピペッティングで5回上下させて混合します。
    5. RNAミニカラムを2 mLのコレクションチューブに入れます。混合物750 μLをRNAミニカラムに移し、12,000 x g で室温で1分間遠心分離します。
    6. ろ液を廃棄し、RNAミニカラムを2 mLコレクションチューブに戻します。500 μL の Buffer RW1 を RNA ミニカラムに加え、12,000 x g で RT で 1 分間遠心分離します。
    7. ろ液を廃棄し、RNAミニカラムを2 mLコレクションチューブに戻します。500 μL の Buffer RW2 を RNA mini カラムに加えます。12,000 x g でRTで1分間遠心分離し、この手順をもう一度繰り返します。
    8. ろ液を廃棄し、RNAミニカラムを2 mLコレクションチューブに戻します。12,000 x g でRTで2分間遠心分離します。
    9. RNAミニカラムを1.5 mLの遠心分離チューブに移し、カラムメンブレンの中央に100 μLのRNaseフリー水を加え、室温で2分間インキュベートします。次に、12,000 x g でRTで1分間遠心分離し、RNAミニカラムを廃棄し、RNA溶液を-80°Cで保存します。
    10. 2 μL の RNA 溶液を NanoDrop 分光光度計で装置マニュアルに従って測定し、その濃度と品質を測定します。
      注:この研究では、RNA品質管理のために260/280および260/230の比率を選択しました。
    11. 1 μg のトータル RNA、4 μL の MgCl2 (25 mM)、2 μL の逆転写 10x バッファー、2 μL の dNTP 混合物 (10 mM)、0.5 μL の組換えリボヌクレアーゼ阻害剤、15 ユニットの逆転写酵素、0.5 μg の oligo(dT)15 プライマー、以下の成分をマイクロ遠心チューブに順次添加して RNA 溶液を調製します。 Nuclease-Free Waterを20 μLに加え、内容物を穏やかに混合して、チューブの底にすべての液体を集めます。
      注:カクテル溶液は、より一貫性のあるcDNA合成とRNA定量を確保するために調製する必要があります。
    12. 20 μL の RNA 溶液を 42 °C で 15 分間インキュベートし、95 °C で 5 分間変性した後、4 °C まで冷却した後、-20 °C で保存することにより、cDNA に逆転写します。
    13. 6.4 μLの蒸留水、10 μLのSYBR GreenリアルタイムPCRマスターミックス、得られた2 μLのcDNA溶液、0.8 μLのフォワードプライマー(10 μM)、0.8 μLのリバースプライマー(10 μM)(表1)を組み合わせ、十分に混合して反応システムを調製します。
    14. PCR装置で反応を実行し、標的遺伝子と参照遺伝子のサイクル閾値(CT)を取得します。
      1. 各PCRサイクルの開始時に、初期変性を95°Cで60秒間設定します。
      2. PCRサイクル中に、95°Cで15秒間変性を行い、60°Cで15秒間アニーリングを行い、72°Cで45秒間伸長し、伸長ステップ中にデータを収集します。合計40回のPCRサイクルを実施します。
      3. PCRサイクル終了後、PCR装置を用いて融解曲線解析を自動的に行います。
        注:融解曲線がダブルピークまたは不規則なピーク形状を示している場合は、実験に問題がある可能性があります。
    15. 2-ΔΔCT法を使用して各標的遺伝子の相対発現レベルを決定し、その後、さらに統計解析を行います。2-ΔΔCT法の式の次のリストを使用します。
      ΔCT(試験)= CT(目標、試験)-CT(参照、試験)
      ΔCT(キャリブレータ)= CT(ターゲット、キャリブレータ)-CT(参照、キャリブレータ)
      ΔΔCT = ΔCT (テスト) -ΔCT (キャリブレーター)
      2-ΔΔCT = 遺伝子発現の倍率変化

遺伝子名シーケンス(5 'から3 ')
マウスCCNA2フォワードCCCAGAAGTAGCAGAGTTTGTG
マウスCCNA2リバースTTGTCCCGTGACTGTGTAGAG
マウス ASPM フォワードCTTATTCAGGCTATGTGGAGGA
マウスASPMリバースCCAGGCTTGAATCTTGCAG
マウス CCNB2 フォワードTTGAAATTTGAGTTGGGTCGAC
マウスCCNB2リバースCTGTTCAACATCAACCTCCC (英語)
マウス NUSAP1 を前方にCTCCCTCAAGTACAGTGACC
マウス NUSAP1 リバースTTTAACAACTTGGTTGCCCTC
マウスCEP55フォワードCCGCCAGAATATGCAGCATCAAC
マウスCEP55リバースAGTGGGAATGGCTGCTCTGTGA

表1:定量的リアルタイムPCRのプライムシーケンス。

  1. 酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)
    注:ELISAキットの指示に従って、ELISAキットをRTに平衡化し、洗浄バッファーを調製し、標準試料を希釈します。90 μLの濃縮ビオチン化抗体を8910 μLのビオチン化抗体希釈バッファーで希釈し、ビオチン化抗体のワーキングソリューション(1:100)を事前に調製します。同様に、90 μLの濃縮酵素コンジュゲートを8910 μLの酵素コンジュゲート希釈バッファーで希釈して、酵素コンジュゲート作動溶液(1:100)を事前に調製します。
    1. 液体窒素を含む乳鉢を使用して肺組織を粉末に粉砕します。
    2. 精密天秤を用いて肺組織50mgを秤量し、粉砕チューブでPBS1mLと混合し、氷上で十分に粉砕します。
    3. 混合物を4°C、3000 x g で5分間遠心分離し、上清を試料として回収します。
    4. 100 μLの異なる濃度の試料/標準試料をELISAプレートの各ウェルに入れ、反応ウェルを接着シールフィルムで覆い、37°Cのインキュベーターで90分間インキュベートします。
    5. 自動プレートウォッシャーを使用してELISAプレートを4回洗浄し、注入と吸引の間に30秒の間隔を空けて、毎回350μLの洗浄バッファーを注入します。
    6. 1ウェルあたり100 μLのビオチン化抗体ワーキング溶液を添加し、ウェルを接着シールフィルムで密封し、37°Cのインキュベーターで60分間インキュベートします。その後、前述の手順に従ってELISAプレートを4回洗浄します。
    7. 1ウェルあたり100 μLの酵素コンジュゲートワーキング溶液を添加し、ウェルを接着シールフィルムで密封し、37°Cのインキュベーターで30分間インキュベートします。その後、前述の手順に従ってELISAプレートを4回洗浄します。
    8. ウェルあたり100 μLの発色剤を添加し、光から保護し、37°Cのインキュベーターで10〜20分間インキュベートします。次に、ウェルあたり100μLの停止溶液を加え、十分に混合し、すぐに450nm(OD450)の値で光学密度を測定します。
      注:8チャンネルピペットを使用して、ビオチン化抗体の作動溶液、酵素標識の作動溶液、および停止溶液を添加するため、添加を迅速に完了し、潜在的なエラーを回避できます。
    9. CurveExpertソフトウェア(http:// curveexpert.webhop.net/)を使用して標準曲線を生成し、各サンプルウェル中の対象物質の濃度を計算します。
  2. ウェスタンブロッティング
    1. RIPA溶解バッファー、フェニルメタンスルホニルフッ化物(PMSF)、およびホスファターゼ阻害剤を100:1:1の比率で混合して、放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)溶液を調製し、氷上に置きます。
    2. 液体窒素を含む乳鉢を使用して肺組織を粉末に粉砕します。
    3. 精密天びんを用いて20 mgの肺組織を正確に秤量し、250 μLのRIPA混合溶液に加えます。
    4. 混合物を氷上で20分間インキュベートした後、12,000 x g で4°Cで15分間遠心分離し、上清をサンプルとして回収します。
    5. BCAキットの試薬Aと試薬Bを50:1の比率で混合して、BCAワーキング溶液を調製します。
      1. 標準試料を希釈して、0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL の濃度で希釈した標準溶液を調製します。各標準溶液とサンプルを20 μLを96ウェルプレートの別々のウェルに加え、37°Cで30分間インキュベートします。
      2. マイクロプレートリーダーを使用して490nmでの吸光度を測定します。標準溶液の濃度と吸光度を使用して標準曲線を適合し、サンプル濃度23を計算します。RIPA混合溶液を使用して、サンプル濃度を同じレベルに調整します。
    6. タンパク質上清を5倍ローディングバッファーと4:1の比率で遠心チューブ内で混合します。金属浴で5分間煮沸し、12,000 x g で4°Cで15分間遠心分離し、上清を回収します。
    7. ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を用いてタンパク質分離を行い、タンパク質をポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレン上に電気的に転写します。5% スキムミルクで PVDF メンブレンを RT で 1 時間ブロックします。
    8. PVDFメンブレンを一次抗体(希釈1:1000)と4°Cで12時間インキュベートした後、TBSTで3回10分間洗浄した後、二次抗体(1:5000を希釈)と室温で2時間インキュベートします。
    9. 全自動電気化学発光イムノアッセイシステムを使用してターゲットバンドを検出し、内蔵ソフトウェアを使用して定量分析を行います。
  3. 統計分析
    1. 統計分析には適切なソフトウェアを利用します。
    2. 実験データを平均±標準偏差として表示します。
    3. 一元配置分散分析(ANOVA)を使用して有意性を決定します。
    4. 0.05を統計的に有意であると考えます。

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結果

23348個の遺伝子in GSE84884(pSS)から合計3290個のDEGが同定され、そのうち2659個のアップレギュレーション遺伝子と631個のダウンレギュレーション遺伝子が含まれていました(図1A)。GSE51092(pSS)については、11409の遺伝子から合計3290のDEGが同定され、そのうち667のアップレギュレーション遺伝子と587のダウンレギュレーション遺伝子が含まれていました(図1B)。GeneCardsデータベースでは、卵巣pSS関連のDEGを102例取得し、スクリーニング基準の相関スコアは≥20であった。GEO と GeneCards から取得した pSS 関連 DEG の統合と重複排除により、453 個の DEG (PSS-DEG) が得られました。25440個の遺伝子in GSE32863(LUAD)から合計7154個のDEGが同定され、これには3934個のアップレギュレーション遺伝子と3220個のダウンレギュレーション遺伝子が含まれていました(図...

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ディスカッション

pSSは主に外分泌腺の浸潤を特徴とする疾患と考えられているが、腺外への損傷は無視できない24。肺はpSSの標的臓器であり、肺の関与はpSSの一般的な腺外症状であり、典型的には気管支粘膜および肺間質のリンパ球浸潤を伴う25。研究によると、pSS 患者の少なくとも 20% が間質性肺疾患 (ILD) を経験しています26,27。ILDは肺がんの重大な危険因子であり、pSS28における肺がんの発生率の増加は、ある程度説明できる。同時に、pSS-ILD患者は腫瘍マーカーの有意な増加を示しており、pSSと肺悪性腫瘍との関連がさらに強調されている29,30。本研究では、pSSとLUADの関連メカニズムを探るた...

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開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

本研究は、National High Level Hospital Clinical Research Funding(2023-NHLHCRF-BQ-01)および中日友好病院Youth Project(No.2020-1-QN-8)の支援を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3色染色済みタンパク質マーカーEpizymeWJ103ウェスタンブロット
抗体希釈バッファーEpizymePS119ウェスタンブロット
BCAタンパク質定量キットEpizymeZJ101ウェスタンブロット
Cytoscape 3.7.1 ソフトウェアNational Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health (NIH)Version 3.7.1.生物学的ネットワーク解析と可視化のためのオープンソースソフトウェア
ECL Luminous FluidEpizymeSQ203Western Blot
Electrophoresis BufferEpizymePS105SWestern Blot
GraphPad Prism 10.0GraphPadVersion 10.0Data analysis
HRP-conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014)abclonalAS014Western Blot
JAK2 AntibodyCell Signaling Technology3230Tウエスタンブロット
マウスIL-1&β;ELISAキット北京 4A Biotech Co., LtdCME0015ELISA
Mouse IL-6 ELISA KitBeijing 4A バイオテック株式会社CME0006ELISA
ホスファターゼ阻害剤カクテル (100回)EpizymeGRF102Western Blot
Phospho-JAK2 (Tyr1007/1008) 抗体細胞シグナル伝達技術3776SWestern Blot
Phospho-STAT3 (Tyr705) 抗体細胞シグナル伝達技術9145SWestern Blot
Protease Inhibitor Cocktail (100回;)EpizymeGRF101ウェスタンブロット
タンパク質フリー迅速ブロッキングバッファー (5回;)EpizymePS108ウェスタンブロット
PVDF メンブレンミリポアIPVH00010ウェスタンブロット
RFoundation for Statistical Computing該当なしデータ解析、可視化、機械学習アプリケーションに使用される統計解析ソフトウェアおよびプログラミング言語
ラジオ免疫沈降アッセイEpizymePC101ウェスタンブロット
逆転写システムPromegaA3500PCR
SDS-PAGEEpizymeLK303Western Blot
SDS-PAGE Protein Loading Buffer (5回;)EpizymeLT103ウェスタンブロット
STAT3 抗体細胞シグナル技術9139Sウェスタンブロット
SYBR グリーンリアルタイム PCR マスターミックス東洋紡QPK-201PCR
TBST (10回;)EpizymePS103ウェスタンブロット
ウェスタンブロット転写バッファー (10回;)EpizymePS109スタンブロット
&β;-アクチン抗体アブクローンAC026ウェスタンブロット
ウェ

参考文献

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