方法論記事

肝細胞癌における全身および局所免疫応答のマスサイトメトリー解析

DOI：

10.3791/67425

⸱

2025年4月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery, The First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、肝細胞がん(HCC)における全身免疫応答と局所免疫応答の両方を評価するための包括的なマスサイトメトリー(飛行時間型[CyTOF]によるサイトメトリー)分析法の概要を示しています。このアプローチは、HCCの免疫ランドスケープに関する洞察を提供し、腫瘍微小環境と関連する免疫メカニズムをより深く理解することを目的としています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肝細胞がん(HCC)は、世界で最も一般的で致命的な肝臓がんの1つです。治療の進歩にもかかわらず、HCC患者の予後は、その進行を促進する遺伝的、環境的、および免疫学的要因の複雑な相互作用のために、依然として不良です。HCCの免疫状況を理解することは、特に患者の転帰を改善することが大きな期待が寄せられている免疫療法の分野で、効果的な治療法を開発するために非常に重要です。この研究では、マスサイトメトリー (Time-of-Flight [CyTOF] によるサイトメトリー) 技術を使用して、HCC 患者の全身免疫応答と局所免疫応答の両方を調査します。末梢血と腫瘍のサンプルを分析することにより、この研究は、HCCの進行に関連するユニークな免疫細胞集団とそれらの機能状態を特定することを目的としています。この知見は、HCCの免疫状況を包括的に概観し、潜在的なバイオマーカーと治療標的を強調しています。このアプローチは、HCCの根底にある免疫メカニズムに関する貴重な洞察を提供し、この悪性腫瘍に対するより効果的な免疫療法の開発への道を開きます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肝細胞がん(HCC)は、最も一般的な原発性肝がんであり、その高い発生率と死亡率により、世界的に重大な健康問題となっています1。世界保健機関(WHO)によると、HCCは世界で5番目に多いがんであり、がん関連死の原因として2番目に多いとされています2。特に、東アジアやサハラ以南のアフリカなど、慢性B型肝炎およびC型肝炎の感染率が高い地域で蔓延しています3。主な危険因子には、ウイルス性肝炎、肝硬変、メタボリックシンドロームなどがあります4。HCCは長期にわたる治療を必要とし、身体的および財政的に大きな負担を強い、効果的な予防、早期発見、革新的な治療戦略の必要性を強調しています5。

免疫系はHCCの発症に重要な役割を果たします。肝臓は免疫活性な臓器であり、肝臓に常在するマクロファージ、ナチュラルキラー(NK)細胞、T細胞などの免疫細胞が豊富に存在し、異常細胞のモニタリングや排除に不可欠です6。しかし、HCCは、免疫抑制分子を発現し、免疫抑制細胞を動員し、腫瘍微小環境を変化させることにより、免疫監視を回避することができる7,8。この免疫回避は、腫瘍の成長と転移を促進するだけでなく、免疫療法への反応にも影響を与えます9,10。

腫瘍微小環境における全身性および局所的な免疫応答は、がんの進行と治療結果に影響を与える重要な要因です。全身性免疫応答には、末梢T細胞、NK細胞、全身の腫瘍細胞を標的とすることができる単球など、離れた腫瘍細胞を認識して攻撃できる循環免疫細胞が含まれます。局所免疫応答は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、腫瘍関連マクロファージ(TAM)、制御性T細胞(Treg)など、腫瘍微小環境内の免疫細胞活性に焦点を当てています。TILはしばしば腫瘍細胞に対して細胞傷害性効果を発揮するが、TAMおよびTregは通常、腫瘍増殖を支える免疫抑制環境に寄与する11,12。腫瘍細胞と間質細胞は、腫瘍の微小環境を再形成して免疫抑制を促進し、免疫監視を回避することができます。全身免疫応答と局所免疫応答との間の相互作用は、抗腫瘍免疫の全体的な有効性を決定する11。この相互作用を理解することは、より効果的な免疫療法戦略の開発に役立ちます。

従来のフローサイトメトリーや免疫組織化学は、免疫学研究で広く使用されていますが、複雑な免疫ランドスケープの解析には大きな限界があり、包括的で高次元な解析を行うことができませんでした。フローサイトメトリーは、シングルセルレベルでの表面マーカーと機能マーカーの検出に非常に効果的です。しかし、同時マルチマーカー解析の能力は制限されており、スペクトルのオーバーラップや、使用できる蛍光タグの数に対する現実的な制約によってしばしば制限される13,14。一方、免疫組織化学は、特定のマーカーの組織状況に関する貴重な洞察を提供しますが、分析可能なマーカーの数が限られていることや、頑健で定量的な高次元評価を達成することの本質的な困難さによって同様に妨げられています15。

複雑な免疫環境を効果的に特徴付けるには、マスサイトメトリー(Time-of-Flight(CyTOF)によるサイトメトリー)のような高次元の技術が不可欠です。マスサイトメトリーは、質量分析を用いて単一細胞内の複数のタンパク質マーカーを解析する先進技術です。これにより、従来のフローサイトメトリー16で見られたスペクトルの重複の問題なしに、個々の細胞のマルチパラメトリック解析が可能になります。金属タグ付き抗体を用いることで、数十のマーカーを同時に測定することができ、細胞の表現型や機能を包括的かつ偏りなく観察することができます17。例えば、Gadallaらは、末梢血単核細胞(PBMC)および腫瘍組織の解析のために40以上のパラメータを有するCyTOFパネルを開発し、高次元の免疫表現型決定におけるその利点を実証した18。従来のフローサイトメトリーでは、検出可能なパラメータの数が限られていたため、ユニークな表現型を示すこれらの希少な細胞集団を同定することができませんでした。対照的に、マスサイトメトリーでは、これらの細胞の機能状態を包括的に評価することができ、より詳細で堅牢な特性評価が可能になりました。Behbehaniらは、骨髄異形成症候群(MDS)患者の骨髄サンプルを解析するためにマスサイトメトリーを利用し、まれな異常な造血前駆細胞を同定し、特徴付けることに成功しました18。40を超える表面マーカーおよび細胞内マーカーを同時に検出するマスサイトメトリーの能力は、これらの低頻度の細胞サブセットの検出を有意に強化した19。これらの能力は、従来の限界を克服し、免疫ランドスケープに関するより深い洞察を提供し、免疫学と治療法開発の進歩を促進します。細胞の表現型と機能をシングルセルレベルで包括的にプロファイリングする能力は、免疫学的プロセスの理解を大きく前進させ、標的療法の開発に役立ちます。

マスサイトメトリーは、複数のタンパク質マーカーを同時に検出することにより、HCCの全身および局所免疫細胞集団に関する包括的な洞察を提供します。この技術により、腫瘍微小環境中のエフェクターT細胞、制御性T細胞(Treg)、消耗T細胞など、さまざまな種類のT細胞を区別し、腫瘍の進行におけるそれらの特異的な役割を解明することができます。マスサイトメトリーを利用することで、研究者はHCCの予後に関連する免疫マーカーを特定できます20。例えば、Programmed Cell Death Protein 1(PD-1)の発現が高いT細胞サブセットは、免疫チェックポイント阻害剤に対する患者の反応の予測因子として役立つことができる21。さらに、特定の免疫抑制分子を同定することで新たな治療標的の発見を促進し、個別化治療戦略の基盤を提供します。このテクノロジーは、複数のマーカーを検出する能力と単一細胞の分解能により、新規治療標的の発見や併用免疫療法の設計に特に有利です。この先進的なアプローチは、免疫の状況を詳細に理解し、カスタマイズされた治療介入の開発を可能にすることで、HCC患者の治療転帰を改善する大きな可能性を秘めています。

この研究は、質量サイトメトリーを利用して、HCC患者の全身および局所免疫細胞プロファイルを分析することを目的としています。その目的は、免疫細胞集団を特徴付け、これらの特性を臨床転帰や治療反応と相関させ、HCCの予後に関連する特定の免疫マーカーと細胞サブセットを特定することです。本研究では、治療応答における様々な免疫細胞の役割を解明することで、個別化治療戦略の基盤を提供することを目指しています。この知見は、既存の免疫療法を最適化し、新しい治療法を開発するための貴重な洞察を提供し、最終的にはHCC患者の全生存期間と生活の質を向上させることを目指すと期待されています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

血液およびHCCサンプルの収集、末梢血単核細胞(PBMC)の単離、単一細胞解離、および染色のステップを次の計画に概説します。実験試薬と材料はすべて材料表に記載されています。すべての実験は、浙江大学医学部第一関連病院の倫理委員会の承認を得て実施され、腫瘍サンプルの収集が病理学的診断を妨げないことを確認しました。書面によるインフォームドコンセントは、すべての被験者から得られました。

1. PBMCの分離

  1. HCC患者の静脈から血液サンプルを採取し、抗凝固剤で満たされたチューブを使用して血液が凝固するのを防ぎます。血液サンプルは、平均年齢55歳の50〜60歳の4人の患者(男性2人、女性2人)から採取されました。各患者について、10〜20 mLの末梢血を採取して、患者の不快感を最小限に抑えながら、その後のPBMCの分離に十分な量を確保します。
  2. 特定の量の血液を採取し(例:.、6 mL)、等量の末梢血リンパ球分離液(Ficol-paqueまたはLymphoprep)を15 mLの遠心チューブに加えます。.
    注:総容量は、適切な混合のためのスペースを確保し、オーバーフローを防ぐために、理想的には12 mLを超えないようにする必要があります。15 mL遠心チューブの最大推奨容量は14 mLです。
  3. 遠心分離管を45°に傾け、チューブの壁に沿ってゆっくりと血液を追加し、2つの層が混ざらないように末梢血リンパ球分離液の上に血液をゆっくりと置きます。
    注:ピペットを使用して、チューブの壁に沿ってゆっくりと血液を追加できます。
  4. 遠心分離機のチューブを遠心分離機に入れ、加速を8に、減速を3に設定します。450 x g、4°Cで30分間遠心分離します。遠心分離後、試験管内に上から下に、血漿層、PBMCs層(白色膜層)、Ficol-Paque層、赤血球と顆粒球層の4つの層が形成されます。
  5. ピペットを使用して、PBMCs層を新しい滅菌遠心分離チューブに慎重に集めます。PBSの3倍の容量を加え、500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。遠心分離後、チューブの底部にペレットが形成されます。
  6. ピペットを使用して上清を捨て、2% Fetal Bovine Serum-Phosphate Buffered Saline(FBS-PBS)を1 mL加えて細胞を再懸濁し、次に3 mLの赤血球(RBC)溶解バッファーを加えます。500 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。
  7. チューブの底に赤血球がなく、赤血球が完全に溶解されていることを示します。細胞を2% FBS-PBSに再懸濁し、その後の実験を直接進めるか、細胞凍結保存液を添加して-80°Cで2〜3ヶ月間保存してください。
    注:一般的なガイドラインとして、再懸濁には、1 x 106細胞あたり0.5 mLの2%FBS-PBSを使用してください。細胞数は、トリパンブルー染色後に血球計算盤または自動セルカウンターを使用して決定し、生細胞と死細胞を区別します。この比率は、その後の処置で最適な細胞回収率と生存率を確保するのに役立ちます。

2. 腫瘍組織細胞の単離

注:腫瘍組織細胞の単離方法は、Songら22から採用されました。

  1. HCCを切除した後、病理医の指導のもと、滅菌メスを使用して腫瘍組織の一部を切除します。ティッシュブロックのサイズは約1cm3 である必要があります。表面の汚れは、あらかじめ冷やした1x PBSで洗い流します。10% FBSを含む約5 mLのRPMI 1640培地を含む15 mLの遠心チューブに組織を浸します。チューブを氷の上に置き、さらなる処理のために実験室に戻します。
  2. 血痕を徹底的に洗い流し、鉗子を使用して脂肪結合組織を手動で除去し、予冷した2%FBS-PBSで組織を完全に洗浄します。消化液を入れた組織培養皿に組織を移します。腫瘍組織を鉗子で固定し、メスで1mm3より小さく切開します。組織消化液を50 mLの遠心チューブに移し、総容量が約15 mLになるまで組織消化液を追加します。
  3. 組織消化混合物が入った遠心チューブをシェーカーに入れます。それを傾けるか平らにし、150rpmおよび37°Cで1時間消化するために固定します。70 μmフィルターで分解溶液をろ過します。
    1. この手順では、1 mLのシリンジプランジャーを使用して組織片を粉砕します。フィルターを2%FBS-1640溶液ですすいでください。ろ液を取り出し、15mLの遠心分離チューブに移します。
  4. 濾液を500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を捨てます。ペレットを約10mLの36%Percoll溶液に慎重に再懸濁します。その後、再度500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
  5. 1 mLのRBC溶解バッファーをピペットで穏やかに吸引し、細胞懸濁液を再懸濁します。懸濁液を新しい15 mL遠心チューブに移し、RBC溶解バッファーを添加して総容量10 mLにします。混合物を室温で10分間放置します。
    注:新しい遠心分離チューブを使用して、チューブ壁の不純物が細胞懸濁液に再侵入するのを防ぎ、細胞収量の低下リスクを低減します。
  6. 細胞懸濁液を500 x g で5分間、4°Cで遠心分離し、その後、細胞を適量の2% FBS-PBSに再懸濁します。一般的なガイドラインとして、再懸濁には1 x 106細胞あたり0.5 mLの2% FBS-PBSを使用してください。
    注:細胞数は、トリパンブルー染色後に血球計算盤または自動セルカウンターを使用して、生細胞と死細胞を区別することによって決定されます。再懸濁量は、その後の実験に必要な細胞量によって異なります。この比率は、その後の処置で最適な細胞回収率と生存率を確保するのに役立ちます。

3. シスプラチン染色

  1. ステップ1.7で得られたPBMCおよびステップ2.6で単離された腫瘍細胞から、それぞれ3 x 106 細胞を採取します。細胞回収後、Ca2+およびMg2+を含まないPBS1 mLに再懸濁します。シスプラチンを最終濃度0.5 μMまで添加し、よく混合し、室温で2分間インキュベートします。
    注:シスプラチン染色は、膜の完全性に基づいて死細胞と生細胞を区別するために行われます。膜が損なわれた死細胞はシスプラチンを取り込んで陽性のシグナルを示しますが、生細胞は染色されないままです23。セルの数は少なくとも 1 x 106 である必要があります。
  2. チューブを500 x g で室温で5分間遠心分離し、上清を廃棄した後、ステップ3.1で調製した細胞懸濁液を含む各チューブに1 mLの細胞染色バッファーを加えて反応を停止します。500 x g で室温で5分間遠心分離し、上清を廃棄し、遠心分離後に細胞ペレットがチューブの壁に沿って直線的に分布していないことを確認します。

4. Fc受容体の遮断

  1. 各サンプルについて50 μLのブロックミックスを事前に調製します:48 μLの細胞染色バッファーを組み合わせ、次に2 μLのFcブロッキング溶液(細胞染色バッファー:Fcブロッキング溶液= 9:1)を加えます。
  2. ステップ3.2の細胞を上記の混合物に懸濁し、室温で10分間放置します。

5. 膜タンパク質抗体のインキュベーション

  1. ステップ4.2で得られた各細胞サンプルについて、各抗体を1.1 μLユニット加えて膜タンパク質抗体ミックスを調製します。次に、細胞染色バッファーを添加して、最終容量55 μLにします。この時点で、総容量は約100μLです。
    注:この混合物には、CD163、CCR3、CD141、CD117、およびCD45などの主要な膜タンパク質を標的とする抗体が含まれています24,25。これらの抗体は、膜タンパク質マーカーの同定における特異性を考慮して選択され、市販の供給源から入手しました(クローン番号、メーカー、カタログ番号などの詳細については、材料の表を参照)。
  2. 調製した抗体ミックスを各チューブサンプルに50 μL加え、総容量を100 μLにし、サンプルを静かに渦巻かせ、室温で15分間インキュベートします。
  3. 各サンプルに2 mLの細胞染色バッファーを加え、500 x g で室温で5分間遠心分離し、上清を捨てます。この手順を2回繰り返します。
  4. 上清を捨て、残りの液体を細胞ペレットで短時間ボルテックスして細胞を再懸濁し、完全に分散させます。

6. 核タンパク質染色

  1. 細胞が完全に再懸濁されたら、ステップ5.4の各サンプルに500μLの混合溶液(固定:固定/透過化= 3:1)を加えます。サンプルを穏やかに混合し、室温で30分間インキュベートします。
  2. 透過化バッファー(10倍)を脱イオン水で希釈します。インキュベーション後、室温で500 gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。1000 μLの1x透過化バッファーを各チューブに加えて、細胞を洗浄します。室温で1,000 x g で5分間遠心分離し、上清を捨てます。
  3. 抗体を1x透過化バッファーに再懸濁します。上清を捨て、各細胞チューブに50 μLの抗体混合物を加えます。細胞を静かにピペットで動かして混合し、室温で30〜45分間インキュベートします。
  4. 1x 透過化バッファー 1000 μL を各チューブに加え、室温で 1,000 x g で 5 分間遠心分離し、上清を捨てます。
  5. 各チューブに1000 μLの細胞染色バッファーを加えて細胞を再懸濁し、室温で1,000 x g で5分間遠心分離し、上清を捨てます。

7. 細胞固定

  1. PBS中の1.6%ホルムアルデヒド溶液を調製し、サンプルあたり1 mLが必要です。
  2. ステップ6.5の各サンプルに1.6%ホルムアルデヒド溶液1 mLを加え、ボルテックスして十分に混合し、室温で10分間インキュベートします。
    注:ホルムアルデヒドは一般的に細胞固定に使用されますが、4%パラホルムアルデヒド(PFA)やメタノールなどの代替試薬も使用できます。固定剤の選択は、実験の特定の要件と観察される細胞の特徴に基づいて行う必要があります。
  3. 室温で800 x g で5分間遠心分離し、上清を捨てます。

8. 核インターカレーション染色

  1. 細胞インターカレーション溶液の調製:Cell-IDインターカレーター-イリジウム(Ir)をFixおよび透過化バッファーで希釈し、最終濃度125 nMにします。サンプルごとに1 mLの溶液を調製します。
  2. 調製した細胞インターカレーション溶液1 mLをステップ7.3の各固定サンプルに加えます。穏やかに混ぜて、すぐに渦巻きにします。これにより、細胞凝集体の形成を最小限に抑えることができます。
  3. 室温で1時間または4°Cで一晩インキュベートします。500 gで室温で5分間遠心分離し、上清を捨てます。

9. 細胞懸濁液の調製

  1. ステップ8.3から1000 μLの細胞染色バッファーをチューブに加え、800 x g で5分間遠心分離します。上清を捨てます。この手順を2回繰り返します。
  2. 450 μLから900 μLの脱イオン水を加えて、細胞を再懸濁します。トリパンブルー染色後、血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。カウント後、マスサイトメトリーを用いたデータ収集と解析を進めます。

10. マスサイトメトリーとデータ解析

  1. CyTOFシステムを使用して質量サイトメトリーデータを取得し、フローサイトメトリースタンダード(FCS)ファイルとして保存します。適切な機器の校正と品質管理を確保し、製造元の指示に従ってバックグラウンドノイズとバッチ効果を低減します。
  2. 関連するソフトウェアを使用して、FCSファイル内のCD45+ 細胞集団を前処理します。セルサイズ(前方散乱光、FSC)と粒度(側方散乱光、SSC)に基づいて破片を除去します。FSC-A/FSC-H または SSC-A/SSC-H プロットのシーケンシャルゲーティングにより、ダブレットを除外します。シスプラチン排除などの生存率染色を使用して死細胞を排除します。CD45+ の集団をゲートして免疫細胞に焦点を当て、ゲートされた集団をさらなる分析のためにエクスポートします。
  3. 補因子 5 でデータを変換し、クラスタリング ソフトウェアを使用してメイン クラスターを特定します。SPADE(Spanning-tree Progression Analysis of Density-normalized Events)アルゴリズムに基づいてクラスタリングを行い、類似したマーカー発現プロファイルを持つ細胞をクラスタ26にグループ化する。階層的確率的近傍埋め込み(HSNE)を使用して、次元の削減と個別のクラスターの識別を行います26。
  4. 教師なしクラスタリングのために、R ソフトウェアの cytofkit パッケージを使用して、主要なクラスターの再クラスタリングを実行します。デフォルトのパラメータを使用して、PhenoGraphでサブクラスタを特定します。
  5. 次元削減のために Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) を適用します。ウィルコクソン検定を使用して、0.05 の P 値を統計的に有意<と見なして統計分析を実行します。ggplot2 を使用して結果を可視化します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HCCに関連する免疫学的特徴を解明するために、免疫細胞集団の包括的な分析が行われました。PBMCとHCC組織サンプルのペアをHCC患者4人から採取した。PBMCとHCC組織サンプルの両方について2つの抗体パネルを使用して、免疫細胞集団をシングルセルプロテオミクスレベルで調べるために、マスサイトメトリープロファイリングを行いました。

品質管理後、45,326個の細胞をマスサイトメトリー解析に含めました。PhenoGraphクラスタリングアルゴリズムは、t-SNEと組み合わせて、2次元グラフを生成し、細胞を異なる表現型に分割するために採用されました。主要な免疫細胞サブセットは、CD3(T細胞)、CD4(CD4+ T細胞)、CD8(CD8+ T細胞)、CD56(NK細胞)、CD19(B細胞)、CD14(単球)などの系統マーカーに基づいて同定された<...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究では、マスサイトメトリー技術を活用して、HCCの全身免疫応答と局所免疫応答の両方を詳細に分析します。この文脈でのマスサイトメトリーの適用により、単一細胞レベルでの複数のマーカーの同時検出が可能になり、HCCの複雑な免疫状況を理解するために重要な詳細な免疫表現型の特性評価が可能になります。マスサイトメトリーは、高次元のシングルセル解析を容易にすることで、免疫学的研究に革命をもたらしました。この手法では、抗体に結合したレアメタル同位体タグを採用しているため、1回のランで40以上のパラメータを同時に測定することができます。この能力は、腫瘍微小環境(TME)が高度の細胞不均一性と複雑な免疫相互作用を特徴とするHCCの研究において特に有利である18,29。

従来のフローサイトメトリーに対するマスサイトメトリーの大きな利点の1つは、マルチプレックス化機能の向上です。従来のフローサイトメトリーでは、蛍光マ...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究は、National Key Research and Development Program of China(J.S.へのgrant 2019YFA0803000)、The Excellent Youth Foundation of Zhejiang Scientific(J.S.へのgrant R22H1610037)、National Natural Science Foundation of China(J.S.へのgrant 82173078)、The Natural Science Foundation of Zhejiang Province(J.S.へのgrant 2022C03037)の支援を受けて行われました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1×PBSHyCloneSH30256.01
10×PBSHyCloneSH30256.01
100 mm×20 mm tissue-culture-treated culture dishCorning430167
1000 mL pipette tipsRainin30389218
15 mL centrifuge tubeNEST601052
200 mL pipette tipsRainin30389241
40 mm nylon cell strainer/70-mm nylon cell strainerFalcon352340
50 mL centrifuge tubeNEST602052
70 μm syringe fifilterSangon BiotechF613462-9001
Anti-Human CCR2 Antibody (clone: K036C2)BioLegend357224
Anti-Human CCR3 Antibody (clone: 5E8)BioLegend310724
Anti-Human CCR7 Antibody (clone: G043H7)BioLegend353240
Anti-Human CD103 Antibody (clone: Ber-ACT8)BioLegend350202
Anti-Human CD115 Antibody (clone: 9-4D2-1E4)BioLegend347314
Anti-Human CD117 Antibody (clone: 104D2)BioLegend313201
Anti-human CD11b Antibody (clone: 1CRF44) BD562721
Anti-human CD11c Antibody (clone: B-ly6) BD563026
Anti-Human CD123 Antibody (clone: 6H6)BioLegend306002
Anti-Human CD127 Antibody (clone: A019D5)BioLegend351337
Anti-Human CD13 Antibody (clone: WM19)BioLegend301701
Anti-Human CD138 Antibody (clone: MI15)BioLegend356535
Anti-human CD14 Antibody (clone: HCD14)BioLegend325604
Anti-Human CD141 Antibody (clone: M80)BioLegend344102
Anti-Human CD15 Antibody (clone: QA19A61)BioLegend376302
Anti-human CD16 Antibody (clone: B7311) BD561313
Anti-Human CD161 Antibody (clone: HP-3G10)BioLegend339902
Anti-Human CD163 Antibody (clone: GHI/61)BioLegend333603
Anti-Human CD169 Antibody (clone: 7-239)BioLegend346002
Anti-human CD19 Antibody (clone: HIB19)BioLegend302226
Anti-Human CD1c Antibody (clone: L161)BioLegend331501
Anti-Human CD20 Antibody (clone: 2H7)BioLegend302301
Anti-Human CD206 Antibody (clone: 15-2)BioLegend321151
Anti-Human CD24 Antibody (clone: ML5)BioLegend311129
Anti-Human CD25 Antibody (clone: BC96)BioLegend302624
Anti-human CD3 Antibody (clone: UCHT1) BD555916
Anti-Human CD31 Antibody (clone: W18200D)BioLegend375902
Anti-Human CD32 Antibody (clone: FUN-2)BioLegend303232
Anti-Human CD326 Antibody (clone: CO17-1A)BioLegend369812
Anti-Human CD33 Antibody (clone: WM53)BioLegend303402
Anti-human CD4 Antibody (clone: L200) BD563094
Anti-Human CD45 Antibody (clone: HI30) BD563716
Anti-Human CD45RO Antibody (clone: UCHL1)BioLegend304220
Anti-human CD56 Antibody (clone: 5.1H11)BioLegend362510
Anti-Human CD64 Antibody (clone: S18012C)BioLegend399502
Anti-Human CD66b Antibody (clone: 6/40c)BioLegend392917
Anti-human CD68 Antibody (clone: Y1/82A)BioLegend333808
Anti-Human CD69 Antibody (clone: FN50)BioLegend310902
Anti-Human CD7 Antibody (clone: 4H9/CD7)BioLegend395602
Anti-human CD8 Antibody (clone: RPA-T8) BD557750
Anti-Human CD80 Antibody (clone: W17149D)BioLegend375402
Anti-Human CD86 Antibody (clone: BU63)BioLegend374202
Anti-Human FOXP3 Antibody (clone: 206D)BioLegend320101
Anti-Human HLA_ABC Antibody (clone: W6/32)BioLegend311426
Anti-human HLA-DR Antibody (clone: L243)BioLegend307650
Anti-Human IgD Antibody (clone: IA6-2)BioLegend348211
Anti-Human Ki67 Antibody (clone: Ki-67)BioLegend350501
Anti-Human PD_L2 Antibody (clone: MH22B2)BD567783
Anti-Human PD1 Antibody (clone: EH12.2H7)BioLegend329951
Anti-Human PDL1 Antibody (clone: MIH2)BioLegend393602
Anti-human TCR-γδ Antibody (clone: B1) BD74

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, C. H., Cheng, Y., Zhang, S., Fan, J., Gao, Q. Changing epidemiology of hepatocellular carcinoma in Asia. Liver Int. 42 (9), 2029-2041 (2022).
  2. Renne, S. L., et al. Hepatocellular carcinoma: A clinical and pathological overview. Pathologica. 113 (3), 203-217 (2021).
  3. Sayiner, M., Golabi, P., Younossi, Z. M. Disease burden of hepatocellular carcinoma: A global perspective. Dig Dis Sci. 64 (4), 910-917 (2019).
  4. Zhang, X., et al. Risk factors and prevention of viral hepatitis-related hepatocellular carcinoma. Front Oncol. 11, 686962(2021).
  5. Zou, H., et al. Economic burden and quality of life of hepatocellular carcinoma in greater China: A systematic review. Front Public Health. 10, 801981(2022).
  6. Li, Y., You, Z., Tang, R., Ma, X. Tissue-resident memory t cells in chronic liver diseases: Phenotype, development and function. Front Immunol. 13, 967055(2022).
  7. Shen, K. Y., Zhu, Y., Xie, S. Z., Qin, L. X. Immunosuppressive tumor microenvironment and immunotherapy of hepatocellular carcinoma: Current status and prospectives. J Hematol Oncol. 17 (1), 25(2024).
  8. Oura, K., Morishita, A., Tani, J., Masaki, T. Tumor immune microenvironment and immunosuppressive therapy in hepatocellular carcinoma: A review. Int J Mol Sci. 22 (11), 5801(2021).
  9. Chen, Y., et al. Effect of infiltrating immune cells in tumor microenvironment on metastasis of hepatocellular carcinoma. Cell Oncol. 46 (6), 1595-1604 (2023).
  10. Du, Q., An, Q., Zhang, J., Liu, C., Hu, Q. Unravelling immune microenvironment features underlying tumor progression in the single-cell era. Cancer Cell Int. 24 (1), 143(2024).
  11. Xu, L., et al. Reshaping the systemic tumor immune environment (stie) and tumor immune microenvironment (time) to enhance immunotherapy efficacy in solid tumors. J Hematol Oncol. 15 (1), 87(2022).
  12. Mao, X., et al. Crosstalk between cancer-associated fibroblasts and immune cells in the tumor microenvironment: New findings and future perspectives. Mol Cancer. 20 (1), 131(2021).
  13. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: Visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
  14. Sahaf, B., Rahman, A., Maecker, H. T., Bendall, S. C. Biomarkers for immunotherapy of cancer: Methods and protocols. , Springer. New York, New York, NY. (2020).
  15. Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PLoS One. 8 (6), e68519(2013).
  16. Wu, K., et al. Redefining tumor-associated macrophage subpopulations and functions in the tumor microenvironment. Front Immunol. 11, 1731(2020).
  17. Elaldi, R., et al. High dimensional imaging mass cytometry panel to visualize the tumor immune microenvironment contexture. Front Immunol. 12, 666233(2021).
  18. Gadalla, R., et al. Validation of cytof against flow cytometry for immunological studies and monitoring of human cancer clinical trials. Front Oncol. 9, 415(2019).
  19. Ijsselsteijn, M. E., Van Der Breggen, R., Farina Sarasqueta, A., Koning, F., De Miranda, N. A 40-marker panel for high dimensional characterization of cancer immune microenvironments by imaging mass cytometry. Front Immunol. 10, 2534(2019).
  20. Zhang, Q., et al. Mass cytometry-based peripheral blood analysis as a novel tool for early detection of solid tumours: A multicentre study. Gut. 72 (5), 996-1006 (2023).
  21. Zheng, B., et al. Trajectory and functional analysis of pd-1(high) cd4(+)cd8(+) t cells in hepatocellular carcinoma by single-cell cytometry and transcriptome sequencing. Adv Sci. 7 (13), 2000224(2020).
  22. Song, J., et al. Protocol for isolating single cells from human pancreatic cancer tissues and analyzing major immune cell populations using flow cytometry. STAR Protoc. 4 (4), 102679(2023).
  23. Simoni, Y., Chng, M. H. Y., Li, S., Fehlings, M., Newell, E. W. Mass cytometry: A powerful tool for dissecting the immune landscape. Curr Opin Immunol. 51, 187-196 (2018).
  24. Comi, M., et al. Coexpression of cd163 and cd141 identifies human circulating il-10-producing dendritic cells (dc-10). Cell Mol Immunol. 17 (1), 95-107 (2020).
  25. Fan, L., et al. High-dimensional single-cell analysis delineates peripheral immune signature of coronary atherosclerosis in human blood. Theranostics. 12 (15), 6809-6825 (2022).
  26. Sheng, J., et al. Human endogenous retrovirus activation contributes to biliary atresia pathogenesis through re-education of resident macrophages. Biorxiv. , (2022).
  27. Terekhova, M., et al. Single-cell atlas of healthy human blood unveils age-related loss of nkg2c(+)gzmb(-)cd8(+) memory t cells and accumulation of type 2 memory t cells. Immunity. 56 (12), 2836-2854.e9 (2023).
  28. Sathaliyawala, T., et al. Distribution and compartmentalization of human circulating and tissue-resident memory t cell subsets. Immunity. 38 (1), 187-197 (2013).
  29. Lee, S., Vu, H. M., Lee, J. H., Lim, H., Kim, M. S. Advances in mass spectrometry-based single cell analysis. Biology. 12 (3), 395(2023).
  30. Iyer, A., Hamers, A. A. J., Pillai, A. B. Cytof for the masses. Front Immunol. 13, 815828(2022).
  31. Yuan, X., Wang, J., Huang, Y., Shangguan, D., Zhang, P. Single-cell profiling to explore immunological heterogeneity of tumor microenvironment in breast cancer. Front Immunol. 12, 643692(2021).
  32. Serban, G. M., Mănescu, I. B., Manu, D. R., Dobreanu, M. Optimization of a density gradient centrifugation protocol for isolation of peripheral blood mononuclear cells. Acta Marisiensis - Seria Medica. 64 (2), 83-90 (2018).
  33. Shcherbakova, A., et al. Factors affecting cell viability during the enzymatic dissociation of human endocrine tumor tissues. Biology (Basel). 13 (9), 665(2024).
  34. Devine, R. D., Alkhalaileh, H. S., Lyberger, J. M., Behbehani, G. K. Alternative methods of viability determination in single cell mass cytometry. Cytometry A. 99 (10), 1042-1053 (2021).
  35. Gonzalez, V. D., Huang, Y. W., Fantl, W. J. Mass cytometry for the characterization of individual cell types in ovarian solid tumors. Methods Mol Biol. 2424, 59-94 (2022).
  36. Zabransky, D. J., et al. Profiling of syngeneic mouse hcc tumor models as a framework to understand anti-pd-1 sensitive tumor microenvironments. Hepatology. 77 (5), 1566-1579 (2023).
  37. Levine, L. S., et al. Single-cell analysis by mass cytometry reveals metabolic states of early-activated cd8(+) t cells during the primary immune response. Immunity. 54 (4), 829-844.e5 (2021).
  38. Lv, B., et al. Immunotherapy: Reshape the tumor immune microenvironment. Front Immunol. 13, 844142(2022).
  39. Zhou, Z., et al. Deciphering the tumor immune microenvironment from a multidimensional omics perspective: Insight into next-generation car-t cell immunotherapy and beyond. Mol Cancer. 23 (1), 131(2024).
  40. Hsieh, W. C., et al. Spatial multi-omics analyses of the tumor immune microenvironment. J Biomed Sci. 29 (1), 96(2022).
  41. Wang, Z., et al. Gdf15 induces immunosuppression via cd48 on regulatory t cells in hepatocellular carcinoma. J Immunother Cancer. 9 (9), e002787(2021).
  42. Krams, S. M., Schaffert, S., Lau, A. H., Martinez, O. M. Applying mass cytometry to the analysis of lymphoid populations in transplantation. Am J Transplant. 17 (8), 1992-1999 (2017).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

Immune ProfilingCyTOF AnalysisPeripheral BloodTumor Immune ResponseSingle Cell AnalysisImmune Cell SubsetsBiomarker DiscoverySPADE Clustering

関連記事