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方法論記事

肝細胞癌における全身および局所免疫応答のマスサイトメトリー解析

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DOI:

10.3791/67425

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2025年4月25日

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この記事について

サマリー

このプロトコルは、肝細胞がん(HCC)における全身免疫応答と局所免疫応答の両方を評価するための包括的なマスサイトメトリー(飛行時間型[CyTOF]によるサイトメトリー)分析法の概要を示しています。このアプローチは、HCCの免疫ランドスケープに関する洞察を提供し、腫瘍微小環境と関連する免疫メカニズムをより深く理解することを目的としています。

要約

肝細胞がん(HCC)は、世界で最も一般的で致命的な肝臓がんの1つです。治療の進歩にもかかわらず、HCC患者の予後は、その進行を促進する遺伝的、環境的、および免疫学的要因の複雑な相互作用のために、依然として不良です。HCCの免疫状況を理解することは、特に患者の転帰を改善することが大きな期待が寄せられている免疫療法の分野で、効果的な治療法を開発するために非常に重要です。この研究では、マスサイトメトリー (Time-of-Flight [CyTOF] によるサイトメトリー) 技術を使用して、HCC 患者の全身免疫応答と局所免疫応答の両方を調査します。末梢血と腫瘍のサンプルを分析することにより、この研究は、HCCの進行に関連するユニークな免疫細胞集団とそれらの機能状態を特定することを目的としています。この知見は、HCCの免疫状況を包括的に概観し、潜在的なバイオマーカーと治療標的を強調しています。このアプローチは、HCCの根底にある免疫メカニズムに関する貴重な洞察を提供し、この悪性腫瘍に対するより効果的な免疫療法の開発への道を開きます。

概要

肝細胞がん(HCC)は、最も一般的な原発性肝がんであり、その高い発生率と死亡率により、世界的に重大な健康問題となっています1。世界保健機関(WHO)によると、HCCは世界で5番目に多いがんであり、がん関連死の原因として2番目に多いとされています2。特に、東アジアやサハラ以南のアフリカなど、慢性B型肝炎およびC型肝炎の感染率が高い地域で蔓延しています3。主な危険因子には、ウイルス性肝炎、肝硬変、メタボリックシンドロームなどがあります4。HCCは長期にわたる治療を必要とし、身体的および財政的に大きな負担を強い、効果的な予防、早期発見、革新的な治療戦略の必要性を強調しています5。

免疫系はHCCの発症に重要な役割を果たします。肝臓は免疫活性な臓器であり、肝臓に常在するマクロファージ、ナチュラルキラー(NK)細胞、T細胞などの免疫細胞が豊富に存在し、異常細胞のモニタリングや排除に不可欠です6。しかし、HCCは、免疫抑制分子を発現し、免疫抑制細胞を動員し、腫瘍微小環境を変化させることにより....

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プロトコル

血液およびHCCサンプルの収集、末梢血単核細胞(PBMC)の単離、単一細胞解離、および染色のステップを次の計画に概説します。実験試薬と材料はすべて材料表に記載されています。すべての実験は、浙江大学医学部第一関連病院の倫理委員会の承認を得て実施され、腫瘍サンプルの収集が病理学的診断を妨げないことを確認しました。書面によるインフォームドコンセントは、すべての被験者から得られました。

1. PBMCの分離

  1. HCC患者の静脈から血液サンプルを採取し、抗凝固剤で満たされたチューブを使用して血液が凝固するのを防ぎます。血液サンプルは、平均年齢55歳の50〜60歳の4人の患者(男性2人、女性2人)から採取されました。各患者について、10〜20 mLの末梢血を採取して、患者の不快感を最小限に抑えながら、その後のPBMCの分離に十分な量を確保します。
  2. 特定の量の血液を採取し(例:.、6 mL)、等量の末梢血リンパ球分離液(Ficol-paqueまたはLymphoprep)を15 mLの遠心チューブに加えます。.
    注:総容量は、適切な混合のためのスペースを確保し、オーバーフローを防ぐために、理想的には12 mLを超えないようにする必要があります。15 mL遠心チューブの最大推奨容量は14 mLです。
  3. 遠心分離管を45°に傾け、....

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結果

HCCに関連する免疫学的特徴を解明するために、免疫細胞集団の包括的な分析が行われました。PBMCとHCC組織サンプルのペアをHCC患者4人から採取した。PBMCとHCC組織サンプルの両方について2つの抗体パネルを使用して、免疫細胞集団をシングルセルプロテオミクスレベルで調べるために、マスサイトメトリープロファイリングを行いました。

品質管理後、45,326個の細胞をマスサイトメトリー解析に含めました。PhenoGraphクラスタリングアルゴリズムは、t-SNEと組み合わせて、2次元グラフを生成し、細胞を異なる表現型に分割するために採用されました。主要な免疫細胞サブセットは、CD3(T細胞)、CD4(CD4+ T細胞)、CD8(CD8+ T細胞)、CD56(NK細胞)、CD19(B細胞)、CD14(単球)などの系統マーカーに基づいて同定された<.......

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ディスカッション

この研究では、マスサイトメトリー技術を活用して、HCCの全身免疫応答と局所免疫応答の両方を詳細に分析します。この文脈でのマスサイトメトリーの適用により、単一細胞レベルでの複数のマーカーの同時検出が可能になり、HCCの複雑な免疫状況を理解するために重要な詳細な免疫表現型の特性評価が可能になります。マスサイトメトリーは、高次元のシングルセル解析を容易にすることで、免疫学的研究に革命をもたらしました。この手法では、抗体に結合したレアメタル同位体タグを採用しているため、1回のランで40以上のパラメータを同時に測定することができます。この能力は、腫瘍微小環境(TME)が高度の細胞不均一性と複雑な免疫相互作用を特徴とするHCCの研究において特に有利である18,29。

従来のフローサイトメトリーに対するマスサイトメトリーの大きな利点の1つは、マルチプレックス化機能の向上です。従来のフローサイトメトリーでは、蛍光マ.......

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開示事項

著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

本研究は、National Key Research and Development Program of China(J.S.へのgrant 2019YFA0803000)、The Excellent Youth Foundation of Zhejiang Scientific(J.S.へのgrant R22H1610037)、National Natural Science Foundation of China(J.S.へのgrant 82173078)、The Natural Science Foundation of Zhejiang Province(J.S.へのgrant 2022C03037)の支援を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1×PBSHyCloneSH30256.01
10×PBSHyCloneSH30256.01
100 mm×20 mm tissue-culture-treated culture dishCorning430167
1000 mL pipette tipsRainin30389218
15 mL centrifuge tubeNEST601052
200 mL pipette tipsRainin30389241
40 mm nylon cell strainer/70-mm nylon cell strainerFalcon352340
50 mL centrifuge tubeNEST602052
70 μm syringe fifilterSangon BiotechF613462-9001
Anti-Human CCR2 Antibody (clone: K036C2)BioLegend357224
Anti-Human CCR3 Antibody (clone: 5E8)BioLegend310724
Anti-Human CCR7 Antibody (clone: G043H7)BioLegend353240
Anti-Human CD103 Antibody (clone: Ber-ACT8)BioLegend350202
Anti-Human CD115 Antibody (clone: 9-4D2-1E4)BioLegend347314
Anti-Human CD117 Antibody (clone: 104D2)BioLegend313201
Anti-human CD11b Antibody (clone: 1CRF44) BD562721
Anti-human CD11c Antibody (clone: B-ly6) BD563026
Anti-Human CD123 Antibody (clone: 6H6)BioLegend306002
Anti-Human CD127 Antibody (clone: A019D5)BioLegend351337
Anti-Human CD13 Antibody (clone: WM19)BioLegend301701
Anti-Human CD138 Antibody (clone: MI15)BioLegend356535
Anti-human CD14 Antibody (clone: HCD14)BioLegend325604
Anti-Human CD141 Antibody (clone: M80)BioLegend344102
Anti-Human CD15 Antibody (clone: QA19A61)BioLegend376302
Anti-human CD16 Antibody (clone: B7311) BD561313
Anti-Human CD161 Antibody (clone: HP-3G10)BioLegend339902
Anti-Human CD163 Antibody (clone: GHI/61)BioLegend333603
Anti-Human CD169 Antibody (clone: 7-239)BioLegend346002
Anti-human CD19 Antibody (clone: HIB19)BioLegend302226
Anti-Human CD1c Antibody (clone: L161)BioLegend331501
Anti-Human CD20 Antibody (clone: 2H7)BioLegend302301
Anti-Human CD206 Antibody (clone: 15-2)BioLegend321151
Anti-Human CD24 Antibody (clone: ML5)BioLegend311129
Anti-Human CD25 Antibody (clone: BC96)BioLegend302624
Anti-human CD3 Antibody (clone: UCHT1) BD555916
Anti-Human CD31 Antibody (clone: W18200D)BioLegend375902
Anti-Human CD32 Antibody (clone: FUN-2)BioLegend303232
Anti-Human CD326 Antibody (clone: CO17-1A)BioLegend369812
Anti-Human CD33 Antibody (clone: WM53)BioLegend303402
Anti-human CD4 Antibody (clone: L200) BD563094
Anti-Human CD45 Antibody (clone: HI30) BD563716
Anti-Human CD45RO Antibody (clone: UCHL1)BioLegend304220
Anti-human CD56 Antibody (clone: 5.1H11)BioLegend362510
Anti-Human CD64 Antibody (clone: S18012C)BioLegend399502
Anti-Human CD66b Antibody (clone: 6/40c)BioLegend392917
Anti-human CD68 Antibody (clone: Y1/82A)BioLegend333808
Anti-Human CD69 Antibody (clone: FN50)BioLegend310902
Anti-Human CD7 Antibody (clone: 4H9/CD7)BioLegend395602
Anti-human CD8 Antibody (clone: RPA-T8) BD557750
Anti-Human CD80 Antibody (clone: W17149D)BioLegend375402
Anti-Human CD86 Antibody (clone: BU63)BioLegend374202
Anti-Human FOXP3 Antibody (clone: 206D)BioLegend320101
Anti-Human HLA_ABC Antibody (clone: W6/32)BioLegend311426
Anti-human HLA-DR Antibody (clone: L243)BioLegend307650
Anti-Human IgD Antibody (clone: IA6-2)BioLegend348211
Anti-Human Ki67 Antibody (clone: Ki-67)BioLegend350501
Anti-Human PD_L2 Antibody (clone: MH22B2)BD567783
Anti-Human PD1 Antibody (clone: EH12.2H7)BioLegend329951
Anti-Human PDL1 Antibody (clone: MIH2)BioLegend393602
Anti-human TCR-γδ Antibody (clone: B1) BD74

参考文献

  1. Zhang, C. H., Cheng, Y., Zhang, S., Fan, J., Gao, Q. Changing epidemiology of hepatocellular carcinoma in Asia. Liver Int. 42 (9), 2029-2041 (2022).
  2. Renne, S. L., et al. Hepatocellular carcinoma: A clinical and pathological overview. Pathologica. 113 (3), 203-2....

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