糖尿病性心筋症マウスモデルにおける電気鍼治療前処理のためのマウス電気鍼固定装置の作製

サマリー

ここでは、糖尿病性心筋症のマウスモデルを確立するためのプロトコルと、治療中にマウスをより穏やかに固定できるマウス電気鍼治療用固定装置をマウスに電気鍼投与します。

要約

糖尿病性心筋症(DCM)は、心不全に進行する可能性のある糖尿病の合併症であり、薬の使用によって制限されます。電気鍼治療は、糖尿病性心筋症を治療するための伝統的な漢方薬の外用方法として効果的な方法です。マウス電気鍼固定装置は、電気鍼治療中にマウスを簡単かつ優しく固定し、マウスの腹部と手足のツボを露出させることができます。この記事では、マウス電気鍼治療固定装置をすべての手順と注意事項とともに作製し、血糖値などの血液生化学的指標の変化を包括的に記録するための包括的な手段を備えた糖尿病性心筋症のマウスモデルを確立する方法について説明します。実験は、対照群、モデル群、前処理群の3つのグループで行われ、各グループに10匹のマウスがいました。前治療群は、Biaoben ツボ電気鍼治療による前治療を隔日で 1 回、合計 7 回のセッションで治療しました。電気鍼治療後、前治療群のマウスは、糖尿病の症状の軽減を伴う血糖値の低下を示しました。

概要

糖尿病性心筋症(DCM)は、特定の病変の心臓構造と心室拡張期および収縮機能の変化を特徴とする糖尿病の一般的な合併症であり、さらに心不全に発展します。糖尿病^{患者における}主要な死因の1つであり^1,2、近年、その有病率の増加が広く注目を集めています³。この疾患の病因には、主にインスリン抵抗性、炎症反応、異常な脂質代謝、酸化ストレス、ミトコンドリア損傷が含まれることがわかっています^4,5。

現在、糖尿病性心筋症の臨床治療は、血糖値をコントロールし、心臓病の症状を緩和するための経口薬が中心ですが、薬物反応、腎機能への影響、長期投薬への依存など、一定の^{制限があります6。}鍼灸は、伝統的な漢方薬の外用方法として、糖尿病性心筋症患者の血糖値、血中脂質、炎症反応に対してより良い調節効果があり、臨床効果は注目に値します⁷。鍼治療は胃腸や腎臓の機能に悪影響を及ぼさず、長期治療は依存症を引き起こしません。Biaobenのツボの理論は、鍼治療の伝統的な理論8でツボを選択し、使用する重要な^{方法です。}病気の症状を改善できるツボをビャオツボと定義し、病気に関連する体の基本的な機能を調節し、病気の根本原因を治療できるツボをベンツボと呼びます。鍼治療と同時に彪ツボとベンツボを刺激することで、病気の治療だけでなく、病気に対する体の抵抗力を高め^、病気の悪化と再発を防ぐという目的を達成することができます9。それは病気の悪化と再発を防ぐことができます。現代の研究では、Biaobenツボによる鍼治療が、糖尿病性心疾患、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性足など、糖尿病とその多くの合併症に効果的であることが証明されています^10,11。Biaobenのツボの理論に沿ったツボ選択スキームは、Biaoツボ¹²として心臓の機能を調節し、炎症反応を改善できるPC6(内関)を選択し、ベンツボ¹³として血糖値と血糖値の状況を改善し、インスリン抵抗性を改善し、酸化ストレスを軽減することができるST36(Zusanli)を選択することです。

ラットまたはマウスモデルが糖尿病性心筋症によって引き起こされる心臓の構造異常と機能変化をよく模倣し、糖尿病性心筋症の生化学的検出指標に必要なサンプルを提供することが実験的に実証されているため、動物モデルは糖尿病性心筋症の研究における重要なツールです^14,15.マウスを誘導するためにストレプトゾトシン溶液と組み合わせた高糖および高脂肪飼料の使用は、4〜5週間で糖尿病モデルの形成につながる可能性があり、モデリング時間を効果的に短縮し、成功率を向上させることができ、飼育環境^16,17に特別な要件はありません。糖尿病性心筋症は、継続的な高血糖によって引き起こされる心臓の構造と機能の損傷によって引き起こされる一種の心筋症です。疾患の経過が長引くと、糖尿病性心疾患モデルは、長期の高血糖18,19,20の下で糖尿病モデルによって自然に開発することができます。鍼治療前治療とは、糖尿病の形成後、明らかな心筋損傷の形成前のマウスの前処理を指します。しかし、実験的な刺激を繰り返すと、マウスはしばしば動きやすくなり、動けなくなることが多く、激しい実験操作技術によりマウスが傷害したり、躁状態やうつ病になる場合がある²¹。したがって、マウスを固定するための適切な方法が必要である。マウスの固定化に一般的に使用される方法には、麻酔とストラップ²²が含まれる。麻酔法はツボをよりよく露出させることができますが、神経伝導に影響を与え、最終的には実験結果に影響を与える可能性があります。ストラップ法は物理的に固定化法であり、麻酔と同じ生理学的効果を生じさせないが、縛られたマウスは、有意な緊張、筋肉緊張の増加、および排便の促進を経験するであろう^22,23。さらに、針は簡単に目的の位置に到達できません。ここでは、電気鍼治療を便利に、安全に、非暴力的に、後遺症なく行うために、マウスが動かないようにするとともに、電気鍼治療中にツボを露出させることができるマウス電気鍼固定装置をご紹介します。

この記事では、マウス電気鍼固定装置の作製と糖尿病性心筋症のマウスモデルの確立について詳しく説明します。Biaobenツボ電気鍼治療前治療による糖尿病性心筋症の治療、マウス固定装置でのその動作の実演、およびBiaobenツボ電気鍼治療前治療の糖尿病性心筋症に対する治療効果の評価を、糖脂質代謝に関連する指標を測定することにより評価した。

プロトコル

すべての動物実験は、動物倫理の3R原則に準拠しており、湖北中医薬大学の動物実験倫理委員会(倫理クリアランス番号HUCMS00309300)によって審査および承認されています。ここでは、湖北省疾病管理予防センターから30匹のSPFグレードのマウスを入手しました(品質証明書NO.42010200009690)。

1. 電気鍼固定装置の製作

1. 電気鍼治療固定装置の組み立てには、透明なアクリル製の中空プラスチックチューブと本体として電気鍼治療器具を入手してください(図1A)。チューブ内でチューブ本体を維持し、両端の開口部にあるクロージャータブを準備します。各端の中央にある中空チューブに溝を開け、手動で回転可能なネジを使用して各端の溝にクロージャータブを固定します。
2. 中空チューブの中央に、長さ約2 cm、幅1 cmの楕円形の穴を3つ、互いに隣接して配置します。両側の穴は、マウスの前肢を引き抜いて前肢の電気鍼治療のための固定に使用され、中央の穴はマウスの胸部と腹部のツボを露出させて胸部と腹部の電気鍼治療に使用できます。
3. 中空チューブの端に、中央の溝の両側に対称的に分布する楕円形の穴を開け、マウスの後肢を引き抜いて後肢の電気鍼治療を行うことができます(図1B)。
4. 中空プラスチックチューブの完全性を確認し、クロージャータブを取り付けます。ネジが溝をスライドさせながらチューブ本体のクロージャータブを動かし、マウスの長さに合わせて固定長さを調整できるようにします。
5. 電気鍼治療器の電源を入れ、動作していることを確認します。各ボタンは、1回押すことで調整できます(図1C)。
6. マウスの電気鍼治療を行うために、中空のプラスチックチューブの隣に配置される電気鍼治療器具を準備します。電気鍼治療器は、電気鍼治療器と数組の通電クリップで構成されています。通電クリップの各ペアは、2つの極の通電を提供できます。
7. クリップを使用して針のハンドルをクリップして針に通電する場合は、クリップを使用して針を固定します。
8. 電気鍼治療器には11個のボタンがあります。上の5つは電気鍼治療の周波数、時間、波形を設定するために使用され、周波数、時間、連続波、疎波と密波、断続波に左から右に使用されます。下の6を使用して、電気鍼治療の電流強度を設定します。これらの各ボタンには、通電クリップを取り付けるためのノッチが下にあります。通電クリップの数は、マウスの数に応じて最大6個まで増減できます。

2. 糖尿病性心筋症のマウスモデルの確立

1. 乱数表法により、30匹のマウスをコントロールグループ、モデルグループ、前処理グループの3つのグループに分け、各グループに10匹のマウスを配置します。モデル群と前治療群の合計20匹のマウスを被験者にして、糖尿病性心筋症のモデルを確立します。Biaobenツボ電気鍼治療で前治療グループを治療します。.
   注:このモデルは長期間にわたって構築され、16週間後に重大な心筋症が発症します。治療時間は36日目から70日目(6週目から10週目)です。この治療法は、糖尿病の発症後、心筋に重大な損傷が生じる前に選択されました。6週間の終わりにマウスの心臓を切除し、重大な糖尿病性心筋症を患っていることがわかりました。したがって、この時点での治療の選択は、前処理のカテゴリーに属します。
2. 対照群のマウスに通常の食事を16週間給餌します。モデル群および前処理群のマウスに高脂肪・高糖質食を16週間与え、糖尿病状態に近い代謝状態を誘導する。高脂肪および高糖の飼料組成は、67.0%の標準的なチャウ、10.0%のラード、2.5%のコレステロール、20.0%のショ糖、および0.5%の胆汁酸塩です。
3. ストレプトゾトシン溶液を腹腔内に注入して、マウス糖尿病性心筋症モデルを確立します。
   1. 29日目にストレプトゾトシンの1%溶液を調製します。クエン酸とクエン酸三ナトリウム(pH = 4.4)を混合して調製した緩衝液にストレプトゾトシンを溶解します。
   2. 29日目の12時間は水だけを提供し、食事は提供しません。次に、以下に説明するように、各マウスに150 mg / kgのストレプトゾトシン溶液を1回腹腔内注射します。.
   3. 右手でマウスの尻尾をつかみ、ケージから取り出します。マウスをケージの表面に置き、テールをそっと引き出します。左手でマウスを固定し、裏返して腹部を露出させます。
   4. すでに引き出したストレプトゾトシン溶液の適切な量で調製した1mLシリンジを使用して、右手を使用してマウス腹腔内にマウスを注射します。.
4. Biaobenツボによる鍼治療を行います。
   1. Biaobenのツボ¹³ の理論に従ってツボを選択してください バイラテラルPC6とST36を含む。前治療群では、36日目に鍼治療を1日おきに1回、計18回、治療期間は計5週間(36日目から70日目まで; 図 2)。
      1. Biaoツボ:Biaoツボとして両側PC6を選択します。PC6は、手首の関節から約3mmの尺骨橈骨縫合糸の間、前肢の内側に位置しています。ベンツボ:ベンツボとして両側ST36を選択します。ST36は、膝関節の後外側、腓骨結節の約2mm下に位置しています。
   2. マウスをつかみ、尻尾をつまんでケージの表面に置きます。アクリル製の中空プラスチックチューブの口を水平面に対して30°の角度に保ち、中央の小さな穴を地面に向け、チューブの口をマウスの頭に合わせます。
   3. マウスの頭をチューブの口に合わせます。マウスの頭をチューブ内でゆっくりと回転させ、自発的な動きとわずかな押し方で行います。マウスの臀部を優しく叩いて、マウスが自律的かつ完全にチューブに押し込まれるようにします。
   4. クロージャータブを調整し、マウスのテールを溝から持ち上げてナットを締め、上端と下端のクロージャータブを使用してマウスの動きを制限します。この時点で、マウスはチューブ本体内を自由に動かすことができなくなります。
   5. ピンセットを使用して、両側の4つの小さな穴のそれぞれからマウスの4本の手足をそっと引き出します。4本の手足を小さな穴から引き抜いたら、チューブ本体の外側にそっと固定します。この時点で、ネズミの4本の手足はもはや移動できませんでした。
   6. 使い捨てのステンレス製針の柄(0.3mm×13mm)を右手の親指と人差し指で持ち、左手でアクリルチューブとその中の動かないマウスを持ちます。
   7. PC6とST36を右手の中指で触れて位置を特定し、針先でマウスの皮膚をそっと刺します。斜めに注入した針を3mm前後に素早く挿入し、右手を素早く外します。
5. 電気鍼治療の前治療を行う
   1. 電気鍼治療器の電源を入れ、断続的な波、1Hzに調整します。各マウスについて、15分間電気鍼治療を行います。
   2. 電気鍼治療器の対応する通電クリップを使用して、針のハンドルを1つのクリップに1つのクリップで保持します。
   3. クリップを1mAに取り付けた状態でボタンの電流を調整します(図3)。
   4. 15分間待って、電気鍼治療の前治療中にマウスの状態を観察します。
   5. 治療終了時にクリップを放し、鍼を取り外してください。クロージャータブを調整し、マウスを電気鍼治療固定装置から解放します。.
   6. マウスの全身を検査し、マウスに怪我や異常がないかを観察します。
6. ストレプトゾトシン溶液の注射の7日間後、36日目から70日目までマウス電気鍼治療具で合計18回の治療を行い、隔日で鍼治療を行います。
7. 112日目(16週目の終わり)に実験を終了します。
   1. 2% ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射により麻酔をし、つま先のつま先つまみ反応により麻酔を確認します。心エコー検査を使用してマウスの心機能を測定します。
      1. 左心室拡張末期直径 (LVEDD)、左心室収縮末期直径 (LVESD)、左心室駆出率 (LVEF)、および左心室フラクショナル短縮 (LVFS) を記録します。
   2. 子宮頸部脱臼によるマウスの安楽死。心臓を取り出し、生理食塩水で洗い流し、4%パラホルムアルデヒドに浸します。

3. ヘマトキシリン-エオシン(HE)染色

1. 脱水、埋め込み、スライス、心臓の脱ワックス、および標準的な手順に従ってHE染色を行います。
2. マウスの心臓組織の病理学的変化を光学顕微鏡で観察します。

4. マウスでの観察

1. 27日目、36日目、49日目に血糖値計を使用して血糖値を測定します。
2. マウスの食事量を観察し、毎日の水分摂取量と排尿量を定量化し、体重の変化を記録します。

5. 統計分析

1. 血糖データを収集し、一元配置分散分析を使用して統計的有意性を特定します。統計的有意性を p < 0.05 として確立します。
2. 実験条件を知らないアシスタントによってデータを定量化します。データを平均±標準偏差として表します。

結果

上記の手順に従い、糖尿病性心筋症のマウスモデルを確立しました。HE染色写真(図4)に見られるように、対照群のマウスは無傷の心筋組織構造を持ち、心筋細胞が規則的に配置されており、明らかな病変はありませんでした。モデル群では、心筋細胞が不規則に配列し、一部の心筋細胞が損傷して崩壊し(黒矢印)、間質に明らかな炎症細胞浸潤が観察されました(黄矢印)。モデル群のマウスは心筋損傷を患っていることが示唆されています。前治療群では、マウスの心筋組織構造が明確であり、心筋細胞が不規則に配置され、少数の心筋細胞が損傷して崩壊し(黒矢印)、他の明らかな病変は観察されませんでした。これに対し、対照群の心筋組織には明らかな病変はなく、モデル群の心筋組織の損傷はより深刻でした。前治療群の心筋組織損傷の程度は、モデル群よりも有意に低かった。これは、前治療が心筋損傷を軽減できることを示唆しています。

心エコー検査の心機能指標(図5)は、対照群と比較して、モデル群の左室拡張期末容積と左室収縮末期容...

ディスカッション

この研究では、高血糖で糖尿病の徴候を示したマウスを、ストレプトゾトシン溶液の腹腔内注射によって得られたが、これは効果的で認知されているモデリング方法である²⁷。PC6はBiaobenのツボ²⁸の理論に従って、ベンポイントとして選択され、ST36はベンポイントとして選択されました。これらのポイントはすべてマウスの手足にあるため、腹部を露出させて手足を固定できるアクリルチューブは、これらのポイントを針で刺すのに適しています。マウスをチューブ本体に導入して固定し、鍼治療後に電気鍼治療のために電気鍼装置の電源を入れました。電気鍼治療で治療された局所筋肉はわずかに震えているように見えますが、これは正常であり、副作用はありません。

鍼灸は、伝統的な中国医学の重要なツールとして、糖脂質代謝を調節し、炎症反応を改善することにより糖尿病性心筋症を治療します^29,30

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アクリル中空プラスチック	河南智科	ZK-GDQ
鍼治療針	Hwato	0.3 mm x 13 mm
C57BL / 6 マウス	北省疾病管理予防
エン酸一水和物	グマ	C1909
鍼治療器具	Hwato	SDZ-V
電子天びん	河南Zhike	ZK-DST
グルコースメーターLifeScan		OneTouch VerioVue
コーステストストリップ	LifeScan	OneTouch Verio
ストレプトゾトシン	グマ	S0130
エン酸三ナトリウム二水和物	グマ	W302600
ピンセット	Labshark	130302001