免疫染色によるマウス網膜血管周皮細胞の3D可視化

サマリー

蛍光トマトレクチンの眼窩後注射後、血小板由来成長因子受容体βによる免疫蛍光染色により、網膜血管系の周皮細胞を調べました。標識された網膜をさらに組織透明化法で処理し、共焦点顕微鏡下で網膜血管系を取り巻く周皮細胞の3次元ビューを視覚化するために全体をマウントしました。

要約

網膜周皮細胞は、血管の発達と網膜の安定性に不可欠であり、網膜血管系の完全性を維持する上で重要な役割を果たします。周皮細胞の形態学的特性を詳細に把握するために、この研究では、蛍光剤の眼窩後注射、免疫蛍光染色、および組織透明化治療を組み合わせた新しいアプローチについて説明しました。まず、蛍光トマトレクチンを生きたマウスの後眼窩洞に注入して、網膜血管系を標識しました。5分後、マウスを屠殺し、その無傷の網膜を網膜カップから慎重に取り出し、血小板由来成長因子受容体βで免疫蛍光染色して周皮細胞を明らかにしました。さらに、染色された網膜を組織透明試薬で処理し、全体を顕微鏡スライドに取り付けました。これらのアプローチにより、透明な網膜では網膜の血管系と周皮細胞がはっきりと観察されました。共焦点顕微鏡下では、網膜血管樹に沿った周皮細胞の形態学的特性をさらに3次元的に再構築および分析するために、高解像度の画像を撮影する機会が増えました。方法論的には、このプロトコルは、網膜血管系内の周皮細胞を視覚化するための効果的なアプローチを提供し、生理学的および病理学的条件下での周皮細胞の役割に関する貴重な洞察を提供します。

概要

網膜周皮細胞は、血管内皮細胞の管腔側に沿って基底膜内に埋め込まれており、網膜血管1に巻き付けられた短距離プロセスの網目状のパターン^{を示しています。}周皮細胞と網膜血管系との間のこの密接な接触は、網膜環境恒常性の維持に寄与する²。多くの研究が網膜血管系の周皮細胞の形態学的証拠を提供してきましたが、網膜周皮細胞の形態学的特徴に関する私たちの理解のほとんどは、従来の組織学的手法から来ています³。

これらの研究に沿って、この研究は、従来の組織学的手法と最新の最先端の科学的方法を組み合わせることにより、網膜微小血管系の周皮細胞の形態学的詳細をより効果的に示すように設計されました。このアプローチでは、生きたマウスへの蛍光トマトレクチンの眼窩後注入、血小板由来成長因子受容体β(PDGFR-β)による免疫蛍光染色、および溶媒ベースの組織透明化戦略の3つの主要な技術を統合しています。蛍光トマトレクチンの眼窩後注射は、in vivoおよびin vitroの両方でマウスの網膜血管系を観察するのに効果的で信頼性が高いことが証明されています^4,5。PDGFR-βは、周皮細胞の免疫蛍光染色に一般的に使用されるバイオマーカーとして機能します⁶。より厚く、全マウント網膜内の周皮細胞の高解像度画像を撮影するために、組織透明化戦略は組織学的透明性を高める^2,7,8。

これらの技術はそれぞれ網膜研究で個別に適用されていますが、マウス網膜血管系の周皮細胞を調査するためのそれらの組み合わせた適合性は不明のままです。マウス網膜の平均厚さは約180〜220μm9であるため、クリア処理を行わずにこの厚い組織で抗体標識および共焦点イメージングを行うと、しばしば高いバックグラウンドシグナルが得られ、周皮細胞と血管との間の空間的関係の観察が複雑になる¹⁰。ここで説明するアプローチを通じて、網膜血管系内の周皮細胞を共焦点顕微鏡下の3次元(3D)ビューで視覚化するための簡単な方法を提供することを目指しています。網膜血管系の周皮細胞からのこの強化された細胞情報は、網膜環境恒常性の理解を深め、血管保護の潜在的な戦略を強調し、それによって網膜血管障害の機能的転帰を向上させる可能性があります。

プロトコル

この研究では、3匹の若年成人男性のC57BL/6マウス(8〜10週齢、体重20〜25g)を使用しました。彼らは、温度と湿度が制御された12時間の明暗サイクルに収容され、食料と水への自由なアクセスが許可されました。本研究は、中国医学院鍼灸研究所倫理委員会(承認番号2023-03-14-04)および「National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals」(National Academy Press, Washington, D.C., 1996)に従って実施されました。

1. 蛍光トマトレクチンの in vivo 後眼窩注射

1. マウスに麻酔をかけるために、50 mg / kgのペントバルビタールを腹腔内に注射します。.つま先をつまむ刺激に対する反応がないことを評価することにより、麻酔の深さを評価します。
2. マウスを右横臥位に置き、頭を左に向けています。
3. マウスの左目を露出させるために眼窩周囲領域を2本の指で静かに押して、動物の左後眼窩洞への注射の最も容易な投与を可能にする¹¹。
4. 27G針を装備した1mLシリンジを使用して、針の斜角を45°の角度で前方に向けてマウスの眼窩静脈洞に約2〜3mm優しく突き刺します。
5. 0.1 mL(1 mg / mL)の蛍光トマトレクチンをマウスの眼窩静脈洞に注入します。

2.眼の灌流と核摘出術

1. 眼窩後注射の5分後に、トリブロモエタノール溶液(250 mg / kg)を腹腔内に注入して、マウスに深く麻酔をかけます。その後、放血と心臓灌流によって動物を安楽死させます。呼吸が止まったら、手術用ハサミ¹²で胸腔を開きます。
2. 呼吸が止まったら、手術用ハサミで胸腔を開きます。手術器具は事前に滅菌し、ドラフト内で手術を行います。24Gの針を使用し、左心室頂点から左心室に2mm挿入します。0.1 M リン酸緩衝液 (PB、pH 7.4) に 20 mL の 0.9% 生理食塩水 20 mL を添加し、続いて 20 mL の 4% ホルムアルデヒドを用いて 3 mL/分の速度で灌流を行います。
3. 犠牲にしたマウスを横に置き、目を覆っている皮膚をハサミで取り除きます。ハサミと鉗子で目を摘出します。
4. 視神経と周辺組織を切断し、眼球を持ち上げて12ウェルプレートに移し、4%ホルムアルデヒドを0.1 M PBに2時間後固定します。
5. 0.1 M PB(pH 7.4)中の25%スクロースで組織を4°Cで凍結保護し、溶液の底に沈むまで凍結保護します。
   注:眼組織はショ糖溶液中でよく脱水するため、網膜をより簡単かつ完全に剥離することができ、その後の包括的な研究が容易になります。

3.網膜の解剖

1. プラスチック製のパスツールピペットを使用して、0.1 M PB(pH 7.4)を含むシャーレに眼球を移します。
2. 角膜の端を鋭利なハサミで穴を開け、角膜と虹彩の周りを切って捨てます。
3. 鉗子を使用して、水晶体と硝子体液を取り除きます。次に、カップ状の網膜を細い鉗子で目の中心から引き離します。清潔なシャーレで網膜を0.1 M PB(pH 7.4)ですすいでください。

4. 網膜の免疫蛍光染色と組織透明化

1. カップ状の網膜を慎重に取り除き、0.1 M PB(pH 7.4)の2% Triton X-100溶液で4°Cで一晩インキュベートします。
2. 網膜をブロッキング溶液(0.1 M PB + 1% Triton-X 100 + 0.2%アジ化ナトリウム + 10% 正常ロバ血清)に移し、シェーカーで72 rpmで4°Cで一晩回転させます。
3. 希釈バッファー(0.1 M PB + 0.2% Triton-X 100 + 0.2% アジ化ナトリウム + 1% 正常ロバ血清1%)中のヤギ抗PDGFR-β(10 μg/mL)の一次抗体を含む溶液に網膜を移し、4°Cで2日間シェーカーで回転させます。
4. Retinaを洗浄バッファー(0.1 M PB + 0.2% Triton-X 100)で室温で2回洗浄し、シェーカーで4°Cの洗浄バッファーに一晩保管します。
5. 翌日、ロバ抗ヤギ488の1 mg/mL二次抗体と0.2 ng/mL蛍光核4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含む混合溶液に網膜を移し、微量遠心チューブに入れ、シェーカー上で72 rpmで4°Cで5時間回転させます。
6. 6ウェルプレートで網膜を洗浄バッファー入りの6ウェルプレートで、室温で1時間、2回洗浄します。網膜をシェーカーの洗浄バッファーに入れ、4°Cで一晩保管します。 ステップ5に従ってイメージングと解析を行い、組織透明化前の画像を取得します。
7. 網膜を組織透明試薬に移し、シェーカー上で60rpmで37°Cで1時間静かに回転させます。
8. ティッシュクリア処理後、清潔なシャーレでカップ状の網膜を0.1 M PB(pH 7.4)ですすいでください。
9. スプリングハサミを使用して網膜の半径の約2/3に達する4つの放射状切開を行い、花びらの形を作ります。
10. 網膜を平らにして顕微鏡スライドに取り付け、小さな吸収紙で余分なPBを取り除きます。網膜の内側をスライド上に向けておきます。
11. 取り付けられた網膜をスペーサーで囲み、新鮮な組織透明試薬とカバースリップで隙間を埋めます。

5. イメージングと解析

1. 組織除去治療前(ステップ4.6の完了後)と治療後の網膜の外観を取得します。
2. 標識された網膜のモンタージュビューをパノラマティッシュスライススキャナーでスキャンします。NAが0.08の2倍対物レンズを使用します。
3. 10倍レンズ(NA0.40)と40倍(NA0.95)の対物レンズを搭載した共焦点イメージングシステムにより、高倍率の画像を撮影します。共焦点ピンホールを152μm(10倍対物レンズ)と105μm(40倍対物レンズ)に設定します。画像キャプチャの空間解像度を 1024 x 1024 ピクセル (10 倍対物レンズ) と 640 x 640 ピクセル (40 倍対物レンズ) に設定します。
4. 標識された網膜から2μmフレームで50枚の画像(Zスタック)をキャプチャ。投影/トポグラフィーモードですべての画像を1つの焦点に統合します。セットアップには、「 開始焦点面を設定」>「終了焦点面を設定」>ステップサイズを設定 > 「深度パターンを選択」>「イメージキャプチャ」>Zシリーズをクリックします。
5. さまざまな蛍光信号に対して、次の励起波長と発光波長を使用して画像をキャプチャします:499 nmおよび519 nmの緑色蛍光信号。591 nmおよび618 nmの赤色蛍光信号。401 nmおよび421 nmの青色蛍光シグナル。
6. Zスタック共焦点画像を分析ソフトウェアにインポートして、 新しい>サーフェスの追加を選択し、ボリューム設定の選択>ソースチャネルの選択>ディスプレイの調整>>スナップショットを選択して、3次元パターンの画像を再構築します。

結果

ホールマウント網膜の外観から見ると、組織クリア処理を施した膝膜と比較して、組織クリア処理を施した膝膜の組織透明度は、ホールマウント網膜の組織透明度が向上しました(図1)。

ホールマウント網膜の組織学的検査では、眼窩後注射により、網膜血管系を蛍光トマトレクチンで赤色で標識し、網膜周皮細胞をPDGFR-βで緑色で示しました(図2、 図3、 および図4)。この標識は、組織クリアリングの前後でサンプルで観察できましたが、比較として、組織クリア処理により網膜サンプルのバックグラウンドノイズが減少しました(図2)。また、この処理により、パノラマ組織スライススキャナー(図2)およびレーザー走査型共焦点顕微鏡(図3)により、標識された網膜周皮細胞および血管系がより鮮明になりました。

網膜周皮細胞のグラデーション分布は、網膜血管樹に沿ってここでも示されています(図3)。網膜の中央部から末梢部にかけて、網膜血管系の基底膜には、血管幹や枝、毛細血管などが中心となっております(図3)。

以上の観察結果に基づき、透明化された網膜試料からの高倍率Zスタック画像を用いて、周皮細胞と網膜血管系の空間的相関をさらに評価しました(図4)。画像処理システムの助けを借りて、さらに3Dビューを提供して、周皮細胞が異なる直径で網膜血管系にしっかりと巻き付けられていることを示しました(図4)。 図4A0-D0 は、網膜血管の上位から下位への階層的な分岐を表しています。周皮細胞は毛細血管に豊富に分布しているため、 図4D0 のPDGFRβ染色は、 図4A0-C0と比較して強い強度とシグナルを示しています。

組織除去処理を伴わないマウス網膜(図1A、 図2A、 図3A0-D0)とは対照的に、本アプローチは、ホールマウント網膜からの周皮細胞と血管との間の空間的関係を実証するための網膜背景信号を効果的に減少させた(図1B、 図2B、 図3A1-D1)。

図1:組織透明化処理なしと組織透明化処理ありのマウント網膜全体の光学的透過性の比較。 (A、B)組織透明化処理前と(B)後のマウント網膜全体の外観。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:組織透明化処理の有無と使用時における全マウント網膜からの網膜周皮細胞および血管系の標識特徴の比較。 (A、B)組織透明化処理前と(B)組織透明化処理後の全マウント網膜の代表的なモンタージュビューをVirtual Slide Systemで撮影した。血管系は赤(蛍光トマトレクチン)、周皮細胞は緑(PDGFR-β)、細胞核は青(DAPI)です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:組織クリア処理前と組織クリア処理後における網膜血管樹に沿った網膜周皮細胞のグラデーション状の画像解像度の比較 (A-D) 組織クリア処理前(A0-D0)と組織クリア処理後(A1-D1)の標識網膜の代表画像は、血管幹(A0、A0、 A1)、1 次分岐 (B0、B1)、2 次分岐 (C0、C1)、およびキャピラリー (D0、D1)。血管系は赤(蛍光トマトレクチン)、周皮細胞は緑(PDGFR-β)、細胞核は青(DAPI)です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:周皮細胞と異なる直径の網膜血管系との空間的相関。 (A-D)網膜血管樹に沿った標識網膜からの代表的な高解像度画像で、血管幹(A0、A1)、1次枝(B0、B1)、2次枝(C0、C1)、毛細血管(D0、D1)など、さまざまな直径の網膜血管系を取り巻く周皮細胞の分布を示しています。A1-D1:パネルA0-D0の対応する画像を再構成して、3次元ビューで異なる直径の網膜血管系と周皮細胞の空間的相関を示し、さらにパネルA1-D1(矢印)の局所領域の拡大ビューをインセットで示しました。血管系は赤(蛍光トマトレクチン)、周皮細胞は緑(PDGFR-β)、細胞核は青(DAPI)です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

本研究では、蛍光トマトレクチンの眼窩後注入、PDGFR-βによる免疫蛍光検査、および溶媒ベースの組織清澄化を用いて、網膜血管系における周皮細胞の形態を実証するための技術的プロセスを詳述した。結果は、これらの技術がホールマウント網膜の周皮細胞を強調表示するのに高い適合性があることを示しています。これらの方法論の組み合わせは、詳細な3Dの観点から網膜血管系の周皮細胞の形態学的特性を視覚化するための効果的なアプローチを提供します。

重要な技術の1つであるマウスの眼窩後注射は、マウスの網膜血管系を観察するための尾静脈および腹腔内注射法よりも優れた、血管標識剤を送達するためのシンプルで最適な方法であることが証明されています^13,14。眼窩後注射による血管標識の原理とメカニズムは完全には理解されていませんが、この方法が蛍光トマトレクチンで網膜血管系を堅牢に標識することは明らかです。蛍光標識は、組織化学的処理と組織透明化の両方を通じて安定しています。したがって、in vivoイメージングでの使用を超えて、蛍光トマトレクチンを用いた眼窩後注射は血管内腔を効果的に標識し、in vitroおよびex vivo組織学的検査のために網膜血管系の明確なビューを提供します。

網膜周皮細胞を標識するために、PDGFR-β¹⁵による免疫蛍光染色を利用しました。染色された網膜が顕微鏡的形態学的検査の下で組織光散乱を減らすために組織透明試薬でさらに処理されたことを考慮して、網膜を染色溶液でより長い時間インキュベートして抗体の浸透を強化しました^16,17。

ホールマウント網膜は比較的透明であり、網膜血管系¹⁸の概観を可能にする。しかし、その厚さによる光散乱のために、光の透過と高解像度イメージング¹⁹を制限する。組織透明化技術の助けを借りて、高解像度の視点から全マウント網膜の周皮細胞を見ることが可能になった^19,20。しかし、これらの方法は、マウス網膜周皮細胞の研究にはまだ広く適用されていません。この研究では、溶媒ベースの組織透明化アプローチにより、網膜血管系の周皮細胞を視覚化する能力が大幅に向上し、レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して高解像度のZスタック画像を取得することができました。

微小血管ツリーに沿って分布する周皮細胞は、網膜毛細血管ネットワーク²²内の血液の複雑な空間的および時間的分布において重要な役割を果たす。それらの高度に可塑的な形態と適応性収縮能力により、周皮細胞は、生理学的および病理学的条件下での局所的なニューロン活動に応答して毛細血管血流を調節するのに理想的です²³。血液-網膜関門または網膜神経血管結合の主要なプレーヤーとして、網膜周皮細胞は、血管新生、血管新生、および白血球転走の維持にも注目されています²⁴。

技術的な制限として、PDGFR−βに加えて、NG−2およびCD13などの他のマーカーもまた、周皮細胞を同定するために使用されてきたことに留意すべきである^22,24,25。したがって、ペリサイトを明確に示すために適切なペリサイト特異的マーカーを選択することは、依然として課題です。この研究は、PDGFR-βが周皮細胞の形態学的特徴を明らかにするためのより良い候補であるというさらなる証拠を提供します。

以上をまとめると、蛍光トマトレクチンの眼窩後注射、免疫蛍光染色、組織透明化の組み合わせにより、高解像度の画像を取得できることを実証し、生理条件下でのマウス網膜血管系における周皮細胞の詳細な形態を明らかにしました。これらの知見は、この方法が、病理学的条件下での網膜周皮細胞の変化に関する将来の研究に有用である可能性を示唆している。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)	サーモフィッシャーサイエンティフィ	D3571	光から保護
Alexa Fluor 488 ロバ抗ヤギ IgG (H+L)	サーモフィッシャーサイエンティフィ	A-11055	光から保護
C57BL/6 マウス 北京	バイタルリバー実験動物技術有限公司	SCXK (Jing) 2021-0006
共焦点イメージング システム	オリンパス	FV1200
ヤギ抗 PDGFR-&	研究開発	AF1042	25µg
Imaris ソフトウェア	Oxford Instruments	v.9.0.1
Lycopersicon esculentum(トマト) レクチン、DyLight594	Thermo Fisher Scientific	L32471	1 mg
微量遠心チューブ	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL
正常ロバ血清	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	10 mL
パノラマ組織スライススキャナー	オリンパス	VS120-S6-W
Photoshop および イラスト	Adobe	CS6
RapiClear 1.52 ソリューション	SunJin Lab	RC152001	10 mL
6 ウェル プレート	Costar	3335
スプリング ハサミ	Fine Science Tools	15003-08
Superfrost Plus 顕微鏡スライド	Thermo Fisher Scientific	4951PLUS-001	25 mm x 75 mm x 1 mm