方法論記事

骨格筋間質細胞外小胞の酵素的単離

DOI：

10.3791/67439

⸱

2025年2月7日

 ,  ,  , 
1Regenerative Bioscience Center, Department of Animal and Dairy Science, College of Agricultural and Environmental Science, University of Georgia

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、機械的剥離、酵素解離、ろ過、および示差超遠心分離を通じて、げっ歯類の筋肉組織から骨格筋間質細胞外小胞(SkM-EV)を分離および精製することを目的としています。一貫性と信頼性を示しています。単離されたSkM-EVは、筋肉の恒常性と疾患に関する洞察を提供し、診断バイオマーカーや治療手段としての応用が期待できます。

要約

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細胞外小胞(EV)は、細胞が放出する脂質二重層封入ナノ粒子で、タンパク質、RNA、DNAなどの生理活性カーゴを輸送し、細胞間コミュニケーションを行います。筋肉の恒常性や疾患における細胞間のEV媒介性クロストークを調査することは、筋肉の発達、再生、および萎縮についての理解を深める大きな可能性を提供します。しかし、骨格筋由来EV(SkM-EV)を単離するための現在のプロトコルは、主に細胞膜を損なうことなく筋肉組織からEVを放出することが困難であるため、高純度と高収率を達成するという課題に直面しています。この記事では、機械的分離、酵素解離、ろ過、超遠心分離からなるSkM-EV分離の効率的なプロトコルを紹介します。これらのステップは、筋肉組織からのEV放出を促進するように最適化されており、高純度のSkM-EVが得られます。続いて、ナノフローサイトメトリー、BCAアッセイ、およびウェスタンブロットアッセイを実施して、単離されたSkM-EVの量と質を特徴付けます。このプロトコルは、基礎研究、疾患診断、および薬物送達を進めるための組織由来EVを取得するための信頼性の高いプラットフォームを確立することが期待されています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞外小胞(EV)は、細胞から細胞外環境に放出されるナノサイズの膜結合粒子です。これらのEVは、レシピエント細胞が取り込むと、核酸、タンパク質、脂質を移動して複数のシグナル伝達経路を調節します。具体的には、骨格筋から単離されたEV(SkM-EV)は、筋原性制御マイクロRNAまたは転写因子1,2,3,4を伝達することにより、筋肉の変性、再生、および成長に関与しています。SkM-EVの亜集団と特性についての理解が深まるにつれ、これらの小胞は早期診断のバイオマーカーとして、また神経筋疾患の治療標的として有望視されています5,6。この拡大する分野は、病理学的研究と臨床応用の両方にエキサイティングな機会を提供します。

現在のSkM-EVに関する研究は、主にex vivo培養後の細胞培養上清から得られるものに焦点を当てています2,7,8、したがって、連続継代後の標的細胞株の忠実度や、人工環境におけるEV特性の変質に対する感受性に関する懸念が提起されています。このことは、ex vivo培養の影響を回避し、in vivo条件をよりよく表現するために、SkM-EVを筋肉組織から直接分離する必要性を浮き彫りにしています。筋肉組織からEVを分離するためのいくつかのアプローチが開発されていますが9,10、研究は依然としてプロトコルの詳細が大きく異なり、一貫性と比較可能性に影響を与えています。SkM-EVの分離と特性評価のための標準化されたプロトコルは、関連する研究全体の信頼性を確保するために緊急に必要とされています。

骨格筋の生理学的特性を考慮し、機械的剥離、酵素解離、濾過、および示差超遠心分離を使用して、げっ歯類の骨格筋サンプルからSkM-EVを分離および精製するプロトコルを開発しました。ナノフローサイトメトリー、BCAアッセイ、ウェスタンブロットアッセイを用いた包括的な解析により、このプロトコルは限られた時間内で高純度かつ大量のSkM-EVを一貫して得られることがわかりました。急性および慢性の筋肉損傷を含むさまざまな条件の骨格筋サンプルに適用できます。さらに、適切な調整を行うことで、この方法は、ヒト患者や他の動物モデルの筋肉組織に合わせて調整することができます。SkM-EVの単離プロセスの標準化は、SkM-EVの品質の一貫性を確保し、歩留まり、サイズ、貨物組成、機能などのEV特性の比較を容易にし、診断バイオマーカーとしての潜在的な応用を進め、さまざまな生理学的および病理学的プロセスにおけるそれらの役割についての理解を深めるために不可欠です。

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プロトコル

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このプロトコルは、機械的剥離、酵素解離、ろ過、および示差超遠心分離を使用して、骨格筋組織から細胞外小胞(EV)を分離します。これにより、前脛骨筋(TA)、長指伸筋(EDL)、ヒラメ筋(SOL)、腓腹筋(GAS)、大腿四頭筋(QUA)など、個々のまたは組み合わせたげっ歯類の四肢の筋肉群からEVを分離できます。動物の使用は、ジョージア大学の動物管理および使用委員会によって承認され、この研究は、研究における動物の世話と使用に関する国立衛生研究所のガイドラインに準拠していました。動物たちは、ジョージア大学の動物酪農科学部内の動物施設に収容されました。この研究では、野生型(C57BL/6J)の成体雄マウスを使用し、マウスから採取した組織を生後3か月で犠牲にしました。使用した試薬および機器の詳細は 、材料表に記載されています。

1.マウスからの筋肉群の機械的剥離

  1. マウスをCO2で安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行います(施設で承認されたプロトコルに従います)。両方の後肢を剃ります。
  2. マウスの脚を滅菌プレートに固定し、脚の前面を上に向けて固定します(図1A)。
  3. 解剖ハサミを使用して、マウスの足首の外側の皮膚に小さな切開(5 mm)を行います。
  4. はさみの1枚の刃を切開部に慎重に挿入し、皮膚の下に配置しますが、下にある筋肉組織には配置しません。次に、皮膚を膝に向かって上向きに切り、切開の長さを伸ばします。
  5. 粗いピンセットを使用して切開部に沿って皮膚をつかみ、筋肉が見えるまで開口部を広げます。
  6. 膝から足首まで伸びるTA筋を脛骨11の外側に位置させ、鋭利なピンセットを使用して、筋肉を覆う結合組織の薄い層をつかんで剥がします(図1B)。
  7. 足首の近くで、TAの端にある2つの腱、1つはTA筋に直接接続されており、もう1つはEDL腱(小さく、外側のTA腱の隣に位置しています)を特定します。解剖ハサミを使用して両方の腱を切断します。
  8. ラフエンドのピンセットで両方の腱をつかみます。次に、別の粗いピンセットまたは先端のピンセットを使用して腱を分離し、TAをEDLから分離します(図1C)。
  9. 切断したばかりの腱でTAを持ち上げ、粗いピンセットでつないでください。次に、解剖ハサミを使用して膝の近くのTA腱を切断し、筋肉を取り除きます。このプロセスを繰り返してEDLを取り出し、両方の筋肉を氷上のPBSに保存します。
  10. 脚を離し、マウスを裏返して、後面が上を向くようにします。
  11. 脚の皮膚を部分的に取り除いた状態で、解剖ハサミを使用して足首の近くの皮膚を切ります。次に、粗いピンセットを使用して、膝の後ろに向かって皮膚をつかんで上向きに剥がし、GASを露出させます。
  12. 解剖ハサミを使用して、足首近くのGAS腱を切断します(図1D)。
  13. GAS腱を粗いピンセットでつかみ、上に持ち上げてGASの下側を露出させます。
  14. GASの下側、膝の近く(GASがまだ接続されている場所)にある小さなSOL腱を見つけます。解剖ハサミを使用してSOL腱を切断し、SOLを上向きに収縮させます(図1E)。
  15. 切断されたSOL腱を鋭利なピンセットでつかみ、そっと持ち上げて、SOLをGASの下側から切り離します。
  16. 解剖ハサミを使用して、SOLの端をGASの切断された端に付着する場所で切断し、2つの筋肉を分離します。SOLをPBSで氷上に保存します。
  17. GASの端を膝の近くで切り、氷の上のPBSに入れます。
  18. 膝の下の4つの筋肉を取り除いた後、マウスを裏返して前面が上になるようにします。
  19. 必要に応じて、粗いピンセットで皮膚をさらにはがして、QUAを露出させます。マウスの脚を90°の角度で配置して、QUAを強制的に曲げます。解剖ハサミを使用して膝に最も近い腱を切断します。
    1. QUAが近位腱によってのみ接続されるまで、筋肉と骨の間を切断することにより、QUAを大腿骨から分離します(図1E)。次に、近位腱を切断し、QUAを取り外します。QUAをPBSの氷の上に置きます。
  20. 筋肉の剥離後、脛骨と腓骨がはっきりと露出していることを確認します(図1F)。
  21. PBSで筋肉を数回すすぎ、毛皮や血液などの汚染物質を取り除きます(図1G)。その後、ペーパータオルで筋肉をやさしく乾かします。分析天びんを使用して筋肉重量を測定し、後で筋肉のグラムあたりに収集されたEVを計算するために使用されます。

2. 剥離した筋肉塊の酵素的解離

  1. 鋭利なピンセット、破片ピンセット、メス、またははさみを使用して、筋肉サンプルから筋腱を静かに取り除きますamp(図2A)。
  2. 腱を抜去した後、ハサミまたはメスを使用して、筋線維に沿って縦方向(腱から腱まで)に筋肉を縦方向に切断し、厚さ1mmの筋肉の塊に切り込み、表面積と体積の比率を増やします(図2B、C)。
    注意: 切断中の筋繊維の損傷を制限するようにしてください。TA、GAS、QUA などの大きな筋肉の場合は、EDL や SOL などの小さな筋肉と比較して追加のカットを行い、すべての筋肉サンプルで表面積と体積の比率がほぼ等しくなるようにします (図 2D)。
  3. 各マウスに10 mLの新鮮な消化酵素緩衝液(DEB)を準備し、使用するまで氷上に置いておきます。
    1. DEBを調製するには、ダルベッコ改変イーグルス培地(DMEM)1 mLあたり2 mgのコラゲナーゼII酵素を1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液と混合します。.混合後、0.2μmフィルターで溶液をろ過します。
    2. DEBの酵素活性が250単位を超えていることを確認します。溶液が完全に混合され、コラゲナーゼII酵素粉末が見えなくなるまで、DEBをボルテックスします。
  4. 筋肉組織をアリコートに分離し、それぞれに20 mgの筋肉組織が含まれています。.次に、酵素解離のために各アリコートに1 mLのDEBを添加します。
  5. DEBと筋肉混合物をインキュベーター内のシェーカーで37°Cで12時間、毎分100回転(rpm)の振とう速度でインキュベートします(図2E)。

3. SkM-EVを濃縮するためのろ過と低速遠心分離

注:冷蔵遠心分離機を4°Cに設定し、設定温度に達するまで運転します。必要なチューブとサンプルは、使用する準備ができるまで氷上に保管してください。

  1. 酵素消化手順に従って、識別可能な筋肉の塊が見えないようにします(図3A)。冷蔵遠心分離の前に、DEB-筋肉混合物から10 μLの溶液を抽出し、必要に応じて細胞生存率試験のために0.2 mLチューブに移します。
  2. 新しい空の1.5 mL微量遠心チューブを準備し、ラベル付けします。プランジャーを取り外し(廃棄しないでください)、ハブを0.45 μmフィルターの上端にねじ込んで、0.45 μmフィルターと5 mLシリンジをセットアップします。下端が新しくラベル付けされた空のチューブに配置されるようにフィルターを配置します(図3D)。1x PBSを0.2 μmフィルターでろ過します。
  3. 混合物を1,000 x g 、4°Cで10分間遠心分離し、破片をペレット化します(図3B)。上清(約1mL)をP200マイクロピペットを使用してシリンジに移します(図3C、E)。
  4. シリンジプランジャーを再度挿入し、上清をゆっくりとフィルターに押し込み、上清を通過させて新しく標識した1.5 mL微量遠心チューブに収集します(図3F)。
  5. プランジャーを再度取り外し、約200 μLの1x PBSをシリンジにピペットで移します。
  6. プランジャーを再度挿入し、200 μLの1x PBSをフィルター(図3G)にゆっくりと押し込み、フィルターから残っている上清をフィルターからラベル付きの1.5 mL微量遠心チューブに取り除きます。
  7. 組織サンプルごとに新しいフィルターを使用して、他のチューブについてもろ過プロセスを繰り返します。
  8. ろ過後、溶液が透明で、筋肉の塊が残っていないことを確認します(図3H)。

4. SkM-EV精製のための示差超遠心分離

注:冷蔵遠心分離機を4°Cに設定し、設定温度に達するまで運転します。必要なすべてのチューブとサンプルを氷上に保管し、すぐに使用できます。

  1. ろ過した溶液を新しい1.5 mLマイクロチューブ(最大200,000 x gに適しています)に移します。すべてのマイクロチューブを1x PBSでバランスを取り、容量が等しいことを確認してから、マイクロ超遠心分離機に入れます。
  2. すべてのチューブの容量が等しいことを確認したら、チューブを閉じて、バランスをとるためにマイクロ超遠心分離機のローターに入れます(図4A)。
  3. マイクロ超遠心分離機の電源を入れ、100,000 x g 、4°Cで1時間運転するように設定します(図4B)。
  4. チューブを装填したローターをマイクロ超遠心分離機に入れ、蓋を閉めて真空をオンにします(図4C)。
  5. 真空度がレベル2に達したら、スタートボタンを押して、遠心分離プロセスが完了するまで待ちます(図4D)。
  6. マイクロ超遠心サイクルが完了したら、バキュームボタンをクリックしてチャンバーを再加圧してから、ローターとチューブを取り外してください。チューブを氷の上に保ち、ペレットを乱さないように直立させて配置します。
  7. ペレットの乱れを避けながら、P200マイクロピペットで上清を慎重に取り除きます(図4E)。
  8. チップを取り出し、P200マイクロピペットを使用して上清を取り除いた後、1x PBSを50 μLをチューブに加えます。GASおよびQUAサンプルの場合は、溶解を助けるために最大500μLの1x PBSを添加します(図4F)。
  9. P20マイクロピペット(または500μLを添加した場合はP200マイクロピペット)を使用してペレットを完全に分解して見えなくなるまで、ペレットを静かに上下させて再懸濁します。
  10. チューブを閉じて、短期保存(1週間未満)の場合は4°C、長期保存の場合は-80°Cで保存するか、ナノフローサイトメトリー、ウェスタンブロット、またはその他のアッセイを使用してサンプルをすぐに特性評価する場合は、チューブを氷上に戻します。

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結果

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このプロトコルに従って、骨格筋細胞外小胞(SkM-EV)は、野生型マウスの脛骨前筋(TA)、長指伸筋(EDL)、ヒラメ筋(SOL)、腓腹筋(GAS)、および大腿四頭筋(QUA)を含むさまざまな筋肉群から成功裏に抽出されました。これらのSkM-EVのその後の特性評価は、ナノフローサイトメトリーによって行われ、表1に要約されているように、それらの明確な特徴が解明されました。驚くべきことに、わずか1gの筋肉組織から、平均粒子サイズ73.93 nm±2.70 nm、粒子サイズの中央値は72.55 nm±2.42 nmで、1.18e14±4.86e13 SkM-EVの印象的な収率が得られました。サイズ分布は13.28nm±1.71nmの分散を示し(図5)、EVの認識された定義と正確に一致しています12,13。

単離されたSkM-EVの完全性を確保するため、蛍光膜プローブであるMemG...

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ディスカッション

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プロトコルは、マウスから後肢の筋肉群を解剖するか、または利用可能なプロトコル16に基づいて死後のヒトの筋肉組織を取得することから始まります。以下の骨格筋細胞外小胞(SkM-EV)の単離手順は、間質性SkM-EVを遊離するための組織の軽度の酵素消化、ろ過および低速遠心分離、および超遠心分離の3つの主要なセクションで構成されています。最後に、分離されたSkM-EVのプロファイリングにさまざまな手法が適用されます。

サイズ、筋線維の種類、および外部刺激に対する抵抗17の点で四肢の筋肉間の大きな違いを考慮して、このプロトコルは、前脛骨筋(TA)、長指伸筋(EDL)、ヒラメ筋(SOL)、腓腹筋(GAS)、および大腿四頭筋(QUA)を含む個々の筋肉からSkM-EVを分離するための詳細な手順を提供します。マウスから筋群を分離し、これらの筋肉組織から細胞を解離するために用いられる技術は、成体のげっ歯類の筋肉から無傷の筋線維および幹細胞を...

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開示事項

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著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

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この作業は、国防総省のW81XWH2210261(Yao Yao)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.6 mL 微量遠心チューブThermoFisher Scientific05-408-120
1.5 mL micro tube (C) エッペンドルフ5720411009
1.5 mL 微量遠心チューブThermoFisher Scientific3448透明、目盛り付き、非滅菌
BD 5 mL シリンジBecton Dickinson14-827-52 ルアーロックチップ
Cell Counting Slides, Dual Chamber for Cell CounterBio-Rad145-0011
Centrifuge 5430REppendorf22620667
洗浄液NanoFCM Inc.
コラゲナーゼIIワージントン バイオケミカル コーポレーションLS004176
DPBS (10x) 液体 (-カルシウム,-マグネシウム)CytivaSH30378.02最終使用希釈液は 1x
DPBS / 変性 (1x)CytivaSH30264.02
ダルベッコの改変イーグルス培地 (DMEM)ジェネシー サイエンティフィック25-500
E-POD ピュアウォーターリモートディスペンサーミリポアシグマZRXSP0D01
FA-45-30-11 微量遠心ローターエッペンドルフ05-401-503
フィッシャーボルテックス ジーニー2サーモフィッシャーサイエンティフィック12-812
フロー ナノアナライザーナノFCM株式会社
Heratherm OGS60 一般プロトコル オーブンThermoFisher Scientific51028112重力対流、2.3 立方フィート 120 V
MemGlow-488 プローブCytoskeleton Inc.MG01-02
ミリパック スペシャル ミリポアミリポア シグマTANKMPK02
ペニシリン・ストレプトマイシンギブコ15070063
ピペットライト LTS ピペット L-1000XLS+レイニン 17014382
ピペットライト LTS ピペット L-200XLS+レイニン17014391
ピペットライト LTS ピペット L-20XLS+レイニン17014392
ピペットチップ ER LTS 1000µL F 768G/8レイニン30808038
ピペットチップ ER LTS 20µL F 960G/10レイニン30807966
ピペットチップ ER LTS 200µL F 960G/10レイニン30807967
品質管理ビーズNanoFCM Inc.
S110-AT 固定角ローターサーモフィッシャーサイエンティフィック455391,10,000 rpm
S16 exo 65-155nm ビーズNanoFCM Inc.
はさみSPI、米国
Sorvall mX 150+ マイクロ超遠心機ThermoFisher Scientific50135641
TC 20 自動セルカウンターBio-Rad1450102
Trypan Blue SolutionCorning25-900-CI
ピンセットSPI、USA
VWR 15mL 遠心チューブアバントール89039-668
Whatman Puradisc 13フィルターCytiva6782-13040.45 µm孔径
野生型C57BL/6Jマウスジャクソン研究所ストック #000664

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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