骨格筋間質細胞外小胞の酵素的単離

サマリー

このプロトコルは、機械的剥離、酵素解離、ろ過、および示差超遠心分離を通じて、げっ歯類の筋肉組織から骨格筋間質細胞外小胞(SkM-EV)を分離および精製することを目的としています。一貫性と信頼性を示しています。単離されたSkM-EVは、筋肉の恒常性と疾患に関する洞察を提供し、診断バイオマーカーや治療手段としての応用が期待できます。

要約

細胞外小胞(EV)は、細胞が放出する脂質二重層封入ナノ粒子で、タンパク質、RNA、DNAなどの生理活性カーゴを輸送し、細胞間コミュニケーションを行います。筋肉の恒常性や疾患における細胞間のEV媒介性クロストークを調査することは、筋肉の発達、再生、および萎縮についての理解を深める大きな可能性を提供します。しかし、骨格筋由来EV(SkM-EV)を単離するための現在のプロトコルは、主に細胞膜を損なうことなく筋肉組織からEVを放出することが困難であるため、高純度と高収率を達成するという課題に直面しています。この記事では、機械的分離、酵素解離、ろ過、超遠心分離からなるSkM-EV分離の効率的なプロトコルを紹介します。これらのステップは、筋肉組織からのEV放出を促進するように最適化されており、高純度のSkM-EVが得られます。続いて、ナノフローサイトメトリー、BCAアッセイ、およびウェスタンブロットアッセイを実施して、単離されたSkM-EVの量と質を特徴付けます。このプロトコルは、基礎研究、疾患診断、および薬物送達を進めるための組織由来EVを取得するための信頼性の高いプラットフォームを確立することが期待されています。

概要

細胞外小胞(EV)は、細胞から細胞外環境に放出されるナノサイズの膜結合粒子です。これらのEVは、レシピエント細胞が取り込むと、核酸、タンパク質、脂質を移動して複数のシグナル伝達経路を調節します。具体的には、骨格筋から単離されたEV(SkM-EV)は、筋原性制御マイクロRNAまたは転写因子1,2,3,4を伝達することにより、筋肉の変性、再生、および成長に関与しています。SkM-EVの亜集団と特性についての理解が深まるにつれ、これらの小胞は早期診断のバイオマーカーとして、^また神経筋疾患の治療標的として有望視されています^5,6。この拡大する分野は、病理学的研究と臨床応用の両方にエキサイティングな機会を提供します。

現在のSkM-EVに関する研究は、主にex vivo培養後の細胞培養上清から得られるものに焦点を当てています^2,7,8

プロトコル

このプロトコルは、機械的剥離、酵素解離、ろ過、および示差超遠心分離を使用して、骨格筋組織から細胞外小胞(EV)を分離します。これにより、前脛骨筋(TA)、長指伸筋(EDL)、ヒラメ筋(SOL)、腓腹筋(GAS)、大腿四頭筋(QUA)など、個々のまたは組み合わせたげっ歯類の四肢の筋肉群からEVを分離できます。動物の使用は、ジョージア大学の動物管理および使用委員会によって承認され、この研究は、研究における動物の世話と使用に関する国立衛生研究所のガイドラインに準拠していました。動物たちは、ジョージア大学の動物酪農科学部内の動物施設に収容されました。この研究では、野生型(C57BL/6J)の成体雄マウスを使用し、マウスから採取した組織を生後3か月で犠牲にしました。使用した試薬および機器の詳細は 、材料表に記載されています。

1.マウスからの筋肉群の機械的剥離

1. マウスをCO₂で安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行います(施設で承認されたプロトコルに従います)。両方の後肢を剃ります。
2. マウスの脚を滅菌プレートに固定し、脚の前面を上に向けて固定します(図1A)。
3. 解剖ハサミを使用して、マウスの足首の外側の皮膚に小さ....

結果

このプロトコルに従って、骨格筋細胞外小胞(SkM-EV)は、野生型マウスの脛骨前筋(TA)、長指伸筋(EDL)、ヒラメ筋(SOL)、腓腹筋(GAS)、および大腿四頭筋(QUA)を含むさまざまな筋肉群から成功裏に抽出されました。これらのSkM-EVのその後の特性評価は、ナノフローサイトメトリーによって行われ、表1に要約されているように、それらの明確な特徴が解明されました。驚くべきことに、わずか1gの筋肉組織から、平均粒子サイズ73.93 nm±2.70 nm、粒子サイズの中央値は72.55 nm±2.42 nmで、1.18e14±4.86e13 SkM-EVの印象的な収率が得られました。サイズ分布は13.28nm±1.71nmの分散を示し(図5)、EVの認識された定義と正確に一致しています^12,13。

単離されたSkM-EVの完全性を確保するため、蛍光膜プローブであるMemG.......

ディスカッション

プロトコルは、マウスから後肢の筋肉群を解剖するか、または利用可能なプロトコル¹⁶に基づいて死後のヒトの筋肉組織を取得することから始まります。以下の骨格筋細胞外小胞(SkM-EV)の単離手順は、間質性SkM-EVを遊離するための組織の軽度の酵素消化、ろ過および低速遠心分離、および超遠心分離の3つの主要なセクションで構成されています。最後に、分離されたSkM-EVのプロファイリングにさまざまな手法が適用されます。

サイズ、筋線維の種類、および外部刺激^{に対する抵抗17}の点で四肢の筋肉間の大きな違いを考慮して、このプロトコルは、前脛骨筋(TA)、長指伸筋(EDL)、ヒラメ筋(SOL)、腓腹筋(GAS)、および大腿四頭筋(QUA)を含む個々の筋肉からSkM-EVを分離するための詳細な手順を提供します。マウスから筋群を分離し、これらの筋肉組織から細胞を解離するために用いられる技術は、成体のげっ歯類の筋肉から無傷の筋線維および幹細胞を.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.6 mL 微量遠心チューブ	ThermoFisher Scientific	05-408-120
1.5 mL micro tube (C)	エッペンドルフ	5720411009
1.5 mL 微量遠心チューブ	ThermoFisher Scientific	3448	透明、目盛り付き、非滅菌
BD 5 mL シリンジ	Becton Dickinson	14-827-52	ルアーロックチップ
Cell Counting Slides, Dual Chamber for Cell Counter	Bio-Rad	145-0011
Centrifuge 5430R	Eppendorf	22620667
洗浄液	NanoFCM Inc.
コラゲナーゼII	ワージントン バイオケミカル コーポレーション	LS004176
DPBS (10x) 液体 (-カルシウム,-マグネシウム)	Cytiva	SH30378.02	最終使用希釈液は 1x
DPBS / 変性 (1x)	Cytiva	SH30264.02
ダルベッコの改変イーグルス培地 (DMEM)	ジェネシー サイエンティフィック	25-500
E-POD ピュアウォーターリモートディスペンサー	ミリポアシグマ	ZRXSP0D01
FA-45-30-11 微量遠心ローター	エッペンドルフ	05-401-503
フィッシャーボルテックス ジーニー2	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12-812
フロー ナノアナライザー	ナノFCM株式会社
Heratherm OGS60 一般プロトコル オーブン	ThermoFisher Scientific	51028112	重力対流、2.3 立方フィート 120 V
MemGlow-488 プローブ	Cytoskeleton Inc.	MG01-02
ミリパック スペシャル ミリポア	ミリポア シグマ	TANKMPK02
ペニシリン・ストレプトマイシン	ギブコ	15070063
ピペットライト LTS ピペット L-1000XLS+	レイニン 17014382
ピペットライト LTS ピペット L-200XLS+	レイニン	17014391
ピペットライト LTS ピペット L-20XLS+	レイニン	17014392
ピペットチップ ER LTS 1000µL F 768G/8	レイニン	30808038
ピペットチップ ER LTS 20µL F 960G/10	レイニン	30807966
ピペットチップ ER LTS 200µL F 960G/10	レイニン	30807967
品質管理ビーズ	NanoFCM Inc.
S110-AT 固定角ローター	サーモフィッシャーサイエンティフィック	45539	1,10,000 rpm
S16 exo 65-155nm ビーズ	NanoFCM Inc.
はさみ	SPI、米国
Sorvall mX 150+ マイクロ超遠心機	ThermoFisher Scientific	50135641
TC 20 自動セルカウンター	Bio-Rad	1450102
Trypan Blue Solution	Corning	25-900-CI
ピンセット	SPI、USA
VWR 15mL 遠心チューブ	アバントール	89039-668
Whatman Puradisc 13フィルターCytiva		6782-1304	0.45 µm孔径
野生型C57BL/6Jマウス	ジャクソン研究所	ストック #000664