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方法論記事

ポリソームプロファイルを用いた熱ストレス下での翻訳効率試験

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DOI:

10.3791/67445

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2024年10月11日

 , 
1Department of Biochemical Science and Technology, National Taiwan University

この記事について

サマリー

ここで紹介するプロトコールは、ショ糖密度勾配遠心分離により 、シロイヌナズナからトランス ラトーム、リボソームに関連するmRNAを非ポリソームおよびポリソームRNAに単離するためのポリソームプロファイリングを含みます。この方法は、熱ストレスを受けた シロイヌナズナの翻訳効率を示しています。

要約

熱ストレス下での異なる遺伝子の翻訳制御は、植物が環境に適応するための重要なステップです。さまざまな遺伝子の翻訳活性を評価することは、植物のレジリエンスを支える分子メカニズムを理解するのに役立ち、地球規模の気候変動に直面してもストレス耐性が強化された作物の開発に貢献します。この論文では、熱ストレスにさらされた植物におけるポリソームプロファイリングによる翻訳効率を評価するための詳細な方法論を紹介します。 手順は、シロイヌナズナの熱ストレス治療、ポリソームプロファイルを用いた翻訳効率試験、プロファイルに基づく非ポリソームRNAとポリソームRNAを単離することによる翻訳効率の計算の3つに分かれています。最初の部分では、 シロイヌナズ ナの植物は、環境の課題を模倣するために制御された熱ストレス条件にさらされます。この処理には、植物を指定された時間高温にさらすことが含まれ、一貫性と再現性のある応力誘導が保証されます。このステップは、熱ストレスに対する植物の生理学的および分子的応答を研究するために重要です。第2部では、ポリソームプロファイリングを用いた翻訳効率試験を行います。ポリソームは、リボソーム負荷に基づいてmRNAを分離するショ糖勾配遠心分離によって抽出されます。これにより、mRNA上のリボソーム占有率を調べることができ、ストレス条件下での翻訳制御メカニズムに関する洞察が得られます。第3部では、RNAはポリソーム画分と非ポリソーム画分の両方から単離されます。スパイクインRNAは、各画分中のRNAの量を正確に測定するために使用されます。翻訳効率の計算は、通常のストレス条件と熱ストレス条件下でこれらの画分にわたるmRNAの分布を比較することによって実行されます。特定の遺伝子の翻訳活性は、リボソーム関連RNAおよび全RNAを用いた定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)を行うことにより、さらに評価されます。この方法論は、熱ストレスの影響にのみ焦点を当てており、植物の翻訳調節を分析するための詳細なプロトコルを提供します。

概要

翻訳は、生物がmRNAから機能的なタンパク質を合成し、代謝やシグナル伝達などの重要な細胞機能や生物学的プロセスをサポートし、ストレス応答を可能にするために重要です。翻訳がなければ、細胞は重要なタンパク質を産生することができず、その構造、機能、および調節に影響を与え、それによって生命の維持と生物学的多様性の育成に影響を及ぼします1,2。したがって、植物の並進効率を研究することは非常に重要です。翻訳には、いくつかの重要なステップがあります。まず、開始はmRNAがリボソームに結合するときに起こり、真核生物のeIFなどの開始因子によって促進され、開始コドン(通常はAUG)が識別されます。次に、それぞれが特定のアミノ酸を持つトランスファーRNA(tRNA)分子がリボソームに順次結合することで伸長が進行します。ペプチド結合は隣接するアミノ酸間に形成され、mRNA配列に従ってポリペプチド鎖を伸長します。最後に、リボソームに新しく合成されたタンパク質を放出するように促す放出因子によって認識される停止コドン(UAA、UAG、またはUGA)に遭遇すると、終了が開始されます。翻訳全体を通じて、さまざまな真核生物の開始因子(eIF)、伸長因子、およびリボソームRNAが連携して、精度と効率を確保します3,4。

これまでの研究では、翻訳後修飾がeIF間の相互作用の制御に重要な役割を果たし、それによって翻訳効率に影響を与えることが示されています。In vitroでの研究では、カゼインキナーゼ2(CK2)キナーゼがeIF3c、eIF5、およびeIF2βをリン酸化して、eIF1 5,6との相互作用を増加させることが明らかになりました。暗所では、E3リガーゼCONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC 1(COP1)は、S6K-RPS6のTOR媒介リン酸化を阻害することにより翻訳を抑制します。非リン酸化RPS6は機能的なリボソームを形成することができず、したがって翻訳7を停止する。逆に、光条件下では、SUPPRESSOR OF PHYA 105(SPA1)キナーゼはeIF2αをリン酸化してeIF2複合体の組み立てを促進し、翻訳開始を促進します8。この知見は、環境シグナルに応答して翻訳を調節する複雑な制御機構を明らかにしている。

適度な環境刺激は、光形態形成8,9などの成長を促進するための翻訳プロセスを効果的に促進することができます。しかし、環境要因が過剰である場合、不動の植物は、環境ストレスによって引き起こされる損傷を軽減するための適切な調節メカニズムを進化させる必要がある10。植物のストレス応答に関連する以前の研究では、大多数は代謝、ホルモン、および転写レベルでの調節に焦点を当てていました11,12,13,14。しかし、最近の研究では、トランスレーショナルレギュレーションが植物のストレス耐性に及ぼす影響が強調され始めています15,16,17。植物は、並進効率を低下させることでストレス耐性を高め、それによって不要なエネルギー消費を最小限に抑えることができます。植物細胞における非膜性ストレス顆粒の形成により、未翻訳のmRNAおよび関連タンパク質がそれらの中に凝集し、翻訳効率を低下させる18。植物がしばしば遭遇する一般的な環境ストレスの1つは、植物細胞内のストレス顆粒の形成を誘発することが報告されている熱ストレスである19,20。地球温暖化による地球平均気温の上昇は、作物の収穫量に深刻な影響を及ぼします21。そのため、熱ストレス下での植物の生理制御を研究することは非常に重要です。これまでの研究では、コムギの加熱処理によりポリソーム結合mRNAが減少することが分かっています。しかし、ストレス顆粒に保存されたmRNAは放出され、リボソームに再結合し、回復後の翻訳を促進した22。さらに、以前の研究では、水没した植物における全mRNAとポリソーム結合mRNAとの間の遺伝子発現が比較されている16。その結果、アブシジン酸および非生物的ストレス応答に関連するmRNAの定常状態レベルが、潜水後にわずかに増加することが示されました。さらに、ポリソーム結合mRNAの量が有意に増加しました。これらの結果は、翻訳調節が植物のストレス耐性を制御する上でより重要な役割を果たす可能性があることを示唆しています。したがって、ストレス処理されたサンプルのトランスラトームを研究するためには、効果的なポリソームRNA単離法が重要です。

このプロトコールでは、RNA単離法を、LiCl沈殿法による高リスクで大量のフェノール/クロロホルム抽出法から、必要な量が少ない小規模フェノール/グアニジンチオシアン酸抽出法に変更しました。前者の方法は、ポリソーム画分と直接混合することを含み、その結果、より大きな実験廃棄物9,15,23が生じる。対照的に、この修正されたアプローチは、密度差の原理を利用しています:ポリソームRNAは、最初に高塩の無糖溶液と混合され、次に超遠心分離によって沈殿されます。続いて、少量のフェノール/グアニジンチオシアン酸試薬を用いてRNA抽出を行います。この方法により、有機性廃棄物の発生を効果的に削減し、私たちの実験をより環境に優しいものにします。さらに、使用される有機溶剤は毒性が低くなっています。これらの理由から、私たちはそれに応じて実験手順を調整し、改善することになりました。さらに、以前の方法では、より詳細な経原子解析に不可欠なスパイクイン正規化を使用して翻訳効率を計算するための包括的なプロトコルが提供されていませんでした。

ここでは、熱ショックストレス下での シロイヌナズ ナの翻訳効率と経原子解析を調べるためのポリソームプロファイリングとポリソームRNA単離プロトコールについて説明します。このプロトコルは、正常、熱ショック、および回復後の条件下でのCol-0野生型の翻訳効率を評価するために採用されました。ポリソームプロファイリングの結果とポリソームRNAの割合から、 シロイヌナズ ナの実生における熱ストレス処理後の翻訳効率の変化が明らかになった。

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プロトコル

1.熱ストレス処理シロイヌナズナ苗サンプル調製

  1. 1.2%植物寒天培地を添加したショ糖(pH 5.6)を含まないMurashige and Skoog(MS)基礎培地寒天プレート上に置いた濾紙にスポイトを付けて、各複製および各条件について250個の種子をプレート化します。
    注:MSプレートに苗を植えるには、滅菌濾紙をプレート上に置いて、苗の根が培地の奥深くまで浸透するのを防ぎ、サンプリングを容易にします。次に、濾紙の上に種を植えます。植物の成長や実験結果に対する糖の影響を排除するために、栽培にはショ糖を含まないMS培地を使用することをお勧めします。
  2. 植えた種子が入ったMSプレートをアルミホイルで包んで光を遮断し、4°Cで2日間インキュベートして春化を誘導します。
  3. 春化した種子を成長チャンバーに移し、16時間:8時間、22°Cの明暗日長、光強度100μmol/m2/sで成長させます。
  4. 熱ストレスサンプルの場合は、生後5日の苗木が入ったMS培地プレートを防水粘着テープで密封し、40°Cの水浴に1時間置きます。
  5. 熱処理後に回収する試料は、熱処理後すぐにプレートを冷却してください。その後、それらを22°Cの成長チャンバーに2時間置きます。
  6. 処理済みまたは未処理の250本の苗木を1.5 mLの微量遠心チューブに収穫し、複製ごとに1.5 mLの微量遠心チューブに詰め、サンプルをすぐに液体窒素で凍結します。
    注:各条件について、2つのサンプルグループを調製しました。1つはポリソームプロファイリング解析用で、もう1つは非ポリソームおよびポリソームRNA抽出用です。

2. ショ糖グラジエントの調製

  1. 12.5%、24.4%、36.3%、48.1%、60%の濃度のスクロースを含むグラジエント溶液を調製します。溶液組成には、50 mM Tris-HCl、25 mM KCl、10 mM MgCl2、100 μg/mL ヘパリン、および 50 μg/mL シクロヘキシミド(CHX)が含まれます。
  2. グラジエント溶液を高濃度から低濃度に、下から上に向かってロードします。グラジエント溶液の各濃度を添加した後、溶液を固体状態に凍結してから、次の濃度を添加します。スクロースグラジエントの濃度ごとに、2.2 mLを添加します。このプロセスにより、不連続なショ糖密度勾配が発生します。
  3. 調製したショ糖グラジエントを-80°Cで一時的に保存し、使用前に4°Cで一晩解凍してください。

3. ポリソームプロファイリングサンプル調製

  1. 熱ストレスを受けているか未処理であるかにかかわらず、ホモジナイザーを使用してホモジナイザーを使用して粉末に凍結した生後5日齢のCol-0苗250本を1分間粉砕します。
    注:同じ背景を持つ植物の数が等しい場合、それらのRNA抽出収量は同じです。ただし、バックグラウンドの異なる過剰発現植物や変異体植物を比較する場合は、植物の条件に応じて使用する植物の量を調整する必要があります。
  2. 非ポリソームおよびポリソームRNAを含む抽出溶液を得るには、500 μLのポリソーム抽出バッファー(200 mM Tris-HCl、pH 8.0、50 mM KCl、25 mM MgCl2、50 μg/mLシクロヘキシミド、100 μg/mLヘパリン、2% PTE、10% DOC、400 U/mLリボヌクレアーゼ阻害剤)を各チューブに加え、反転およびボルテックスしてサンプルを混合します。プロセス全体を通してサンプルが4°Cに維持されていることを確認してください。
  3. 抽出溶液を4°C、12,000 x g で10分間遠心分離します。次に、上清を100 μmのセルストレーナーでろ過し、透明で粒子を含まない抽出溶液を得ます。
    注:抽出溶液中に存在する粒子は、超遠心分離中に沈殿し、ポリソームプロファイリング測定の精度に影響を与える可能性のあるペレットを形成する可能性があります。
  4. ろ過した上清を事前に調製したショ糖グラジエントにロードし、平衡に達することを確認します。
    注:超遠心分離機の回転速度が速いため、超遠心分離機の安全性と適切な機能の両方を確保することが不可欠です。これを実現するには、回転前にサンプルの重量が同一であることを確認する必要があります。そこで、精密天秤を用いて、グラディエントの重みが完全に均一であることを確認しています。
  5. サンプルをロードしたショ糖グラジエントを、超遠心分離機スイングバケットローターを使用して、4°C、210,000 x g 、3.5時間遠心分離します。加速率と減速率を最大に設定します。超遠心分離後、非ポリソームおよびポリソームRNAは、対応するショ糖勾配溶液中の密度に応じて分布します。
    注:ショ糖勾配では、密度の低い非ポリソームRNAが上層に分布し、一方、mRNA上の活性翻訳に関与する多数のリボソームの存在により高密度を特徴とするポリソームRNAは、下層に分布します。その後、密度勾配フラクショネーターを使用してポリソームプロファイリングを測定できます。

4. ポリソームプロファイリング解析

注:マイクロボリュームシリンジポンプを備えた密度勾配フラクショネーターを使用して、ポリソームプロファイリングを測定します。

  1. マイクロボリュームシリンジポンプ用のチェイス溶液(70%ショ糖、10%グリセロール、0.02%ブロモフェノールブルー)を準備します。
  2. ソフトウェアを使用して密度勾配フラクショネーターを制御します。脱イオン水を使用して機械を校正します。キャリブレーション後、それを使用してポリソームプロファイリングを実行します。
    1. ベースライン調整を実行するには、ライトが赤から緑に変わるまで UV/VISDetector をオンにします。レコーダーの オフセット ノブを調整してマーカーラインを揃えてから、 ベースライン調整 ノブを最小の開位置に回します。UV / VISDETECTORの 感度 ノブをレベル2.0に設定し、 自動ベースライン ボタンを押します。最後に、 レコーダーオフセット ノブを使用して、目的のベースラインを20に調整します。校正されたプロセスは、メカニズムのブランドと異なるサンプルによって異なります。
  3. 超遠心分離後、チューブピアシングシステムを使用してサンプルの入ったチューブを密度勾配分画分留器にセットし、チューブをチェイシング溶液とUV検出器を備えたシリンジポンプに接続できるようにします。
  4. 密度グラジエントフラクショネーターをソフトウェア制御モード(REMOTE)に切り替え、マイクロボリュームシリンジポンプの注入流量を3 mL/minに設定します。
  5. ソフトウェア設定を開始して、OD254を測定することにより、フラクショネーターを使用してポリソームプロファイルグラフを取得します。

5. 非ポリソームおよびポリソームRNAの単離

注:プロトコルのこの部分では、前述したのと同じ手順に従って超遠心分離を行った後、同じバッチの異なるサンプルグループを使用しました。

  1. ポリソームプロファイルの測定結果に基づいて、非ポリソームとポリソームRNA画分を別々に収集します。非ポリソーム画分とポリソーム画分の両方の溶液の体積を計算し、非ポリソーム画分(上部)を収集します。
    注:プロファイルによると、2つ以上のリボソームを持つ画分はポリソーム画分として定義され、40S、60S、および80SのrRNAピークを持つ画分は非ポリソーム画分として定義されます。
  2. RNAのターゲット画分を、予冷した2倍高塩水(400 mM Tris-HCl、pH 8.0、100 mM KCl、50 mM MgCl2)と十分に混合します。
  3. キットからEukaryotic Poly-A RNA Controlの希釈ストック8 μLを加えます。
    注: 7 番目のステップに必要なスパイクイン正規化の場合。真核生物のPoly-A RNA Control Kitには、植物には存在しないDAP遺伝子などの枯草菌の遺伝子が参照遺伝子として含まれています。抽出後の反応中の参照遺伝子損失の割合を決定するには、抽出前に、DAP遺伝子のRNAサンプルを含む試薬を同量の試薬を非ポリソームRNAまたはポリソームRNAを含む異なるチューブに加えます。これにより、抽出後の反応中の参照遺伝子損失の割合を決定することができ、標準化の目的で使用できます。
  4. 高塩溶液混合RNAを4°C、450,000 x gで、超遠心分離機スイングバケットローターを使用して5時間遠心分離します。
  5. 超遠心分離後、RNAは遠心分離管の底に沈殿します。上清を上から慎重に注ぎ取り、底のRNAペレットを保存します。
  6. RNAペレットを500 μLの予冷ジエチルピロカーボネート(DEPC)処理水ですばやく洗浄し、この手順を3回繰り返します。
    (注)DEPC処理水が洗浄過程でRNAを再溶解するのを防ぐため、DEPC処理水を使用する前に予冷し、溶解性を低下させる必要があります。さらに、洗浄中のDEPC処理水とRNAペレットとの接触時間を最小限に抑える必要があります。

6. 非ポリソームおよびポリソームRNA抽出

  1. 500 μLのRNA抽出試薬を加え、抽出するRNAサンプルと混合します。10分間インキュベートします。
  2. 100 μLのクロロホルムを加えて十分に混合し、10分間インキュベートして相分離します。
  3. 反応混合物を4°C、12,000 x g で10分間遠心分離します。RNAを含む上部の透明な水層を新しいチューブに移し、等量のイソプロパノールと穏やかに混合し、-20°Cで2時間インキュベートしてRNAを沈殿させます。
  4. 沈殿後、4°C、12,000 x g で10分間遠心分離します。上清を慎重に捨て、RNAペレットを底に保持します。
  5. RNAペレットを1mLの予冷75%エタノールで洗浄します。4°C、12,000 x g で10分間遠心分離し、上清を廃棄し、RNAペレットを風乾します。
  6. RNAペレットが乾燥したら、RNAペレットを30μLのDEPC処理水に再懸濁し、フルスペクトル(220 nm-750 nm)分光光度計を使用してRNA濃度(OD260)を測定します。

7. スパイクイン正規化

  1. 抽出された1000 ngのRNAを逆転写に使用し、メーカーの指示に従ってqPCRキットを使用して行います。非ポリソームRNAとポリソームRNAの両方をcDNAに逆転写する必要があります。
  2. 1 μLのcDNAを DAP 遺伝子プライマーと混合し、SYBRバッファーを使用して、製造元の指示に従って標的遺伝子の発現レベルを測定します。次に、リアルタイムPCRを使用して DAP 遺伝子発現を検出します。
    注: DAP 遺伝子のプライマーの配列は次のとおりです。
    フォワードプライマー = 5'-ATA AAA GAA TTC AGC TAA CGC TTC C-3'
    リバースプライマー = 5'-TTG TTT CTT TGC CTC TAT TGT ATC C-3'
  3. 測定された非ポリソームおよびポリソームRNAグループにおける DAP 遺伝子の発現レベルを比較し、比例損失条件下でのRNA含有量を推定します。正規化されたRNA含有量を使用して、ポリソーム中のRNAの比率を計算します。

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結果

シロイヌナズナの野生型であるCol-0は、16時間:8時間の光日長でMS培地で増殖しました。防除には、熱ストレス処理を施さずに生後5日の苗木を使用しました。熱ストレス群は予熱水浴中で40°Cで1時間の熱処理を行い、回収群は熱処理直後に22°Cで2時間行った。異なる熱処理条件と回収条件を採用することで、後続のステップを利用してそれらの並進効率を測定できます。

RNA抽出の前に、まずスクロースグラジエントを調製する必要があります。非ポリソームRNAとポリソームRNAを密度差に基づいて分離するために、ショ糖濃度12.5%、24.4%、36.3%、48.1%、および60%のグラジエント溶液を調製しました。次に、グラジエント溶液を高濃度から低濃度にロードしました(図1A)。その後、このグラジエントを利用して、低密度の非ポリソームRNAを上層で分離し、高密度のポリソームRNAをスクロース濃度の高い下層に分布させることができます。非ポリソームおよびポリソームRNAは、処理済みまたは未処理のCol-0から抽出した。溶液中...

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ディスカッション

このプロトコルは、シロイヌナズナの実生の翻訳効率を測定するための簡単で標準化された方法の概要を示しています。このプロトコルの重要なステップは、二次遠心分離とRNA抽出試薬抽出によるRNAの安定性の確保、およびスクロース勾配の綿密な調製です。さらに、スパイクイン正規化法により、非ポリソームおよびポリソームRNAを標準化および定量するための重要なステップを提供します。すべての手順をRNaseフリーのバッファーとツールを使用して氷上で実施することが非常に重要です。さらに、ショ糖濃度の正確な調製を確保し、振とうを最小限に抑えてグラジエントへの影響を軽減します。以前の研究24,25,26では、ストレス応答に関する研究は主に転写分析と表現型分析に焦点を当ててきました。ポリソームプロファイル解析により、ストレスやその他の環境刺激下での植物の翻訳プロセスの制御をさらに調査することができます。

...

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開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

私たちは、国立台湾大学(台湾)の科学技術部が後援する生命科学部のテクノロジーコモンズと計装センターからの超遠心分離技術研究サービスに感謝します。また、技術サポートを提供してくださったYu-Ling Liang氏と、原稿を批判的に読んでくださったCheng研究室のメンバーにも感謝します。この研究は、台湾の国家科学技術評議会のYoung Scholar Fellowship Einstein Programによって助成されました。NSTC 113-2636-B-002-007 から M.-C.C.M.-C.C.は、国立台湾大学からの財政的支援に感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mL エッペンドルフチューブLabcon3012-870-000-9RNA抽出
13.2 mL遠心チューブベックマン・コールター331372超遠心分離
ブロモフェノールブルーHoneywell32712ポリソームプロファイル
クロロホルムHoneywell32211RNA抽出
シクロヘキシミド(CHX)Sigma-AldrichSI-C7698ポリソームプロファイル
ジエチルピロカーボネート (DEPC)Sigma-AldrichD5758RNA抽出
エタノールSigma-Aldrich32221RNA抽出
GeneChip 真核生物 Poly-A RNAコントロールキットInvitrogen900433標準化
グリセロールHoneywell15523正規化
ヘパリンSigma-AldrichSI-H3149ポリソームプロファイル
HiScript III RT SuperMix qPCR キット用VazymeR323-01Normalization
KClJ.T.Baker 3040-01ポリソームプロファイル
MgCl2Sigma-AldrichSI-M8266ポリソームプロファイル
MS 基礎培地PhytoM524植物培養
ピークチャート シリンジポンプブランデルSYN4007LSポリソームプロファイル
ポリオキシエチレン-10-トリデシルエーテル (PTE)Sigma-AldrichP2393ポリソームプロファイル
RNasinPromegaN251Bポリソームプロファイル
デオキシコール酸ナトリウム (DOC) Sigma-AldrichSI-D6750ポリソームプロファイル
ショ糖Sigma-AldrichS5391ポリソームプロファイル
SYBR Green SupermixBio-RadBP170-8882Normalization
TRI reagentMRCTR118RNA extraction
Tris-HClJ.T.Baker 4109-06ポリソームプロファイル
超遠心分離機ベックマンコールターオプティマL-100K超遠心分離
機UV/VISDETECTORブランデルUA-6ポリソームプロファイル

参考文献

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