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方法論記事

性別を肯定するホルモン療法を模倣したラットモデルの確立

2.1K 閲覧数

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DOI：

10.3791/67470

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2025年1月10日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Gender-Specific Medicine, Istituto Superiore di Sanità, 2Department of Biomedicine and Prevention, University of Rome “Tor Vergata”, 3Centre Animal Research and Walfare, Istituto Superiore di Sanità

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、テストステロンまたはエストラジオールと酢酸シプロテロン(トランスジェンダーの人々の人間の治療に使用)の皮下投与による性別肯定ホルモン療法を模倣した2つのげっ歯類モデルの開発について説明しています。

要約

トランスジェンダー(TG)とは、性自認と出生時に割り当てられた性別が一致しない人のことです。彼らはしばしば、性別適合ホルモン療法(GAHT)を受け、個々の性自認により適した第二次性徴を獲得するための医学的介入を受け、多くの社会心理学的変数の改善に一貫した結果をもたらします。ただし、GAHTはさまざまな身体系を対象としており、まだ完全に特定および特徴付けられていないものの、いくつかの副作用が記録されています。したがって、GAHTを受けているTGの人々は、集団の感受性の高いサブグループと見なされる可能性があり、リスク評価の枠組みで特定の注意を払う必要があります。たとえば、標的動物モデルの使用を通じて。本研究では、GAHTを模倣する2つのラットモデル、すなわちTG女性のためのGAHTを模倣した脱男性化女性化モデル(dMF)と、TG男性のためのGAHTを模倣した女性化脱女性化モデル(dFM)を実装するための手順を説明した。このモデルは、ヒトGAHTに使用されるのと同じホルモン、すなわち、dMF用のβ-エストラジオールと酢酸シプロテロン、dFM用のテストステロンを、2週間の同じ曝露経路で投与することによって実施されました。治療中、ラットは毎日チェックされ、健康状態と潜在的に攻撃的な行動を評価します。犠牲になって、血液と標的組織は、生化学的、分子的、および組織病理学的分析のためにサンプリングされ、保存されています。性別固有のパラメーター、つまり精子数と陰核の寸法も評価されています。さらに、雌雄および雌のラット肝臓で独占的および/または優先的に発現するCYP450アイソフォームが同定され、GAHTの成功を検証し、モデルを設定するための新規バイオマーカーとして特徴付けられます。甲状腺の関与も、内分泌系の主要な標的として調査されています。

概要

男性、女性、どちらでもない、両方、またはその中間のどこか1であるという個人の心理的認識は、性自認と呼ばれます。生物学的性別と一致する場合(シスジェンダーの場合)もあれば、異なる場合(トランスジェンダー-TG)もあります。TG男性とは、女性として生まれたが、自分自身を男性と認識している個人のことです。TG女性は男性として生まれますが、自分自身を女性として認識しています2。現在、世界中には2,500万人のTG患者がいると推定されています3、そのほとんどが性別違和、つまり出生時に割り当てられた性別との不一致を特徴とする心理的状態4に苦しんでおり、その結果、仕事や家庭での社会的差別や困難を引き起こし、しばしばうつ病につながる可能性があります。 不安とストレス5.このような理由から、TGの人々はしばしば性別適合ホルモン療法(GAHT)や性別適合手術を受けます。TG男性のGAHTはテストステロン(T)の投与を特徴とし(表1)、TG女性のGAHTはエストロゲン(E2)と抗アンドロゲン(表2)の投与を特徴としています6。

GAHTは通常、個人の生涯にわたって持続し、内分泌系7,8に継続的に作用します。したがって、GAHTがTGの人々の健康に与える影響と、その潜在的な長期的な影響を分析することが重要です。さらに、TGの人々は、一般の人々と同様に、GAHTとして内分泌系を標的とする化学汚染物質、特に内分泌かく乱物質(ED)にさらされ、その結果、過剰刺激が生じる9。

EDは、天然ホルモンの分泌、活性化、合成、放出、結合など、さまざまなホルモンおよび代謝プロセスを変化させることにより、生物および/またはその子孫に影響を与える化学物質のグループです。EDは環境中に蔓延しているため、日常的に使用する食品や製品(例えば、ペットボトルや容器、金属製の食品缶のライナー、洗剤、難燃剤、食品、玩具、化粧品、農薬など)は、一般の人々が生涯を通じて継続的に曝露されています10。さらに、EDへの低線量曝露でさえ、組織や臓器の損傷につながる可能性があり、ED曝露に関連する一般的な現象は、実験動物とヒトの両方で性特異的な影響の発生です11。一例として、食品接触材料であるビスフェノールA(BPA)への曝露は、そのエストロゲン作用による女性の子宮内膜症や多嚢胞性卵巣症候群などの健康リスク、および生殖能力の低下に関連しています12。男性では、BPAはレベルを下げ、精子の質を低下させる可能性があります13。さらに、農薬は女性の乳がんのリスクが高く、男性の重大な生殖能力の問題と関連しています13。これまでのところ、TGの人々9におけるEDを含む環境汚染物質の毒物学的影響を研究するための特定のツールは利用できません。

本研究は、2つのTG動物モデル、すなわち脱男性化-女性化モデル(dMF)と脱男性化モデル(dFM)の開発のために選択された方法とパラメータを記述することを目指している。特に、現在のヒトの治療法に基づくホルモンの適切な用量レベル、時間、および投与方法の選択が評価される14。さらに、モデルを一意に定義する組織および機能バイオマーカーが同定され、特徴付けられます。さらに、動物における治療の有効性と忍容性、および長期研究で使用するための最も適切なマーカーの選択について、そのような目的で使用される技術とともに詳細に説明されています。

モデルを特徴付けるために、次のエンドポイントが分析されます:テストステロン(T)血清レベル(両方のモデルでGAHTの成功を評価するための最良のバイオマーカー9,15)。エストラジオール(E2)血清レベル(両方のモデル);甲状腺刺激ホルモン(TSH)およびチロキシン(T4)(dMFモデル);精子数(dMFモデル);陰核寸法(dFMモデル);生殖器官、肝臓、甲状腺の病理組織学的解析(両モデル)さらに、以下の性特異的肝シトクロムP450アイソフォーム(CYP450s、両モデルとも)の遺伝子発現も分析されている16,17:CYP2C11(男性肝臓で特異的に発現)、CYP3A18(男性肝臓で女性より25倍多く発現)、CYP2C12(女性肝臓で特異的に発現)、およびCYP2C6(主に女性の肝臓で発現するが、低レベルで存在する、 男性でも)。

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プロトコル

これらの試験は、指令2010/63/EU、2014年3月4日のイタリア政令第26号、およびOECDの医薬品安全衛生基準(GLP)の原則に従って実施されます。この研究プロトコルは、イタリア保健省によって承認されました (承認番号 806/2021-PR)。ここでは、男女ともに性的に成熟した16匹の若いSprague-Dawleyラット(304匹±13gの雄ラットと190匹±7gの雌ラット、8〜9週齢)を購入し、標準的な実験室条件(22±0.5°C、相対湿度50%〜60%、1時間あたり12〜14回の空気交換を伴う12時間の暗光交互)で2つ/ケージに収容 します。すべてのケージに、各動物の環境強化のために、木をかじるブロックを挿入し、毎週交換します。

注:GAHTは青年期(タナーステージ2〜3)に開始できるため、げっ歯類の8〜9週間に対応し、TGの人々の9の生涯にわたって長期間持続するため、8〜9週齢の動物が選択されています。

1. グループサイジングとアニマルケア

  1. ラットはOECDによって示された好ましい種であり(例:ガイドライン421生殖/発生毒性スクリーニング試験)、OECDガイドライン407で提案および考慮された唯一のげっ歯類種であるため、若年成人の雄および雌のSprague-Dawleyラット(8〜9週齢)をモデルとして使用します(げっ歯類の反復投与での28日間の経口毒性試験、EIの検出パラメータで更新)。
  2. グループサイジングにはG*Powerソフトウェアを使用します。dFM モデルと dMF モデルの両方で、4 つの試験グループを選択します: 1 つの対照群 (C) と、異なる用量の GAHT で治療された 3 つの動物群。2 つのグループ (治療用量と C) の比較を参照してサイジングを行い、Mann-Whitney 検定、両側の有意水準 alpha = 0.0167 (各治療用量と C の 3 つの比較に Bonferroni 補正を適用した alpha = 0.05 に対応)、および 1-β 検出力 = 0.80 を使用してサイジングを行います。
    1. 計算されたラット/グループの数は次のとおりです。
      dFMモデルの場合、動物/グループn = 4、Kinnearらによると18 は、治療の2週間後、次のレベルを示しています:対照群では:0.2 ± 0.3 ng / mL、ホルモン療法群では:16 ± 5 ng / mL(平均±標準偏差)、Cohenのd = 4.46(非常に大きな効果)で測定された効果次元に対応します。
      dMFモデルの場合:Gómez et al.19 によると、2週間の治療後、次のレベルを示しています:対照群:1.901 ± 0.413 ng / mLおよびホルモン療法群:0.043 ± 0.023 ng / mL(平均±標準誤差)は、Cohenのd = 6.35(非常に大きな効果)で測定された効果次元に対応します。
    2. 2 つのモデルを揃えるには、性別/グループごとに n=4 匹の動物を選択し、合計で N = 32 匹になります。
  3. 順応の1週間後、ラットを性別ごとに2つの実験グループ(dMFおよびdFM、4匹のラット/グループ)に分け、それぞれが1つのC(対照雄、CMおよび対照雌、CF)と選択したGAHTの3つの治療グループで構成されます。
  4. すべてのラットを1日2回(午前8時30分と午後4時)監視して、一般的な健康状態とGAHT投与による潜在的な攻撃性を確認します。実験動物の体重に最適な動的重み付け機能を備えた分析天秤を使用して、体重(bw)と飼料消費量を週に2回記録します。
  5. dFM実験モデルでは、治療開始直前(ポイント0)と治療終了時(ポイント13)に、デジタルゲージを使用してすべてのラットの陰核径を測定し、精度で読み取ります。
  6. 犠牲の前にすべての動物の体重を量り、dMFモデルでは、犠牲の直後に精子の数を増やすために精巣上体を取り除きます。

2. 用量の選択と調製

  1. dFMラットに投与されるホルモンの次の3つの用量を使用してください:週あたり5、10.5、および22.5 mg / kg、dMFモデルでは、次の3つの選択された用量レベル(DL)を使用します:DL1 E2 0.045 mg / kg + CPA 0.2 mg / kg、DL2 E2 0.09 mg / kg + CPA 0.2 mg / kgおよびDL3 E2 0.18 mg / kg + CPA 0.2 mg / kg。
    注: すべての用量は、TG の人々15 に使用される主要なヒト臨床ガイドラインと、文献で利用可能な限られたデータを考慮して選択されます。
  2. 化学安全フードを使用して、毎週すべてのストック溶液を準備します。すべての物質を車両としてゴマ油に適切に混合し、完全に可溶化します。
    注:どちらのモデルでも、線量変換計算機(https://dosecal.cftri.res.in/)を使用して、変換する線量、線量が設定されている種、動物種、および線量を変換する重量を入力します。dFMモデル(表3)の場合、ヒトホルモン療法、週あたり最大用量100mgのT20。ラットで計算された用量は、週あたり10.5 mg / kgのTです。.2回目の投与は、ラット18で週に22.5mg / kgです。3回目の用量は週あたり5 mg / kgで、計算された2つの用量間の係数を2.1に維持することによって特定されます。.dMFモデルについては、表4を参照され、投与量は、ヒト21およびin vivo研究14,19,22を通じて入手可能なデータに対する推奨レジメンに基づいている。

3. 動物治療

  1. T(dFMモデル用)とE2 plus CPA(dMFモデル用)の皮下投与を、注入部位の皮膚をつまんで持ち上げ、一種のカーテン状にすることで行います。次に、1mLの注射器の針を動物の背中と平行に挿入します。中に入ったら、必要な量(Tの場合は100μL、E2 + CPAの場合は200μL)をゆっくりと注入します23。
    1. 動物を次のように扱います:dFMモデルの場合、ゴマ油(ビヒクル)に溶解したTエナント酸を週2回/週2回2週間投与します(Tの皮下注射ごとに100μL)。dMFモデルでは、ごま油(ビヒクル)に溶解したE2とCPAアセテートを週5回、2週間(皮下注射ごとに200μL)投与します。Cグループのラットは、車両(ゴマ油)のみと同様に扱います。

4. 採血、犠牲、組織採取

  1. 治療の2週間後、犠牲の直前に、ガス状麻酔システムを使用し、すべての動物を麻酔します。透明なポリスチレン誘導チャンバーで反射が失われるまで、100% 酸素中で 2% から 3.5% イソフルランを 1.5 L/min の速度で変化させる用量で麻酔を誘発します。ラットを加熱パッドの腹臥位に置き、心臓内採血手順全体を通じて標準的なラット鼻マスクによって投与される1.5%から3.5%までの維持用量でイソフルランの用量を調整します。.
  2. 21Gの針で5mLのシリンジを調製し、真空をなくします。指で心臓を探りながら、肋骨5と6の間の肘の曲げられた点のほぼ部分で、体に垂直な外側胸壁に針を慎重に挿入します。心臓の心室に入ると、血液は毛細管現象によって注射器に入ります。シリンジピストンをゆっくりと連続的に引っ込めて、血液が溜まるまで動かします。
  3. 採血後、ラットをCO2 チャンバーに入れ、CO2 窒息を使用して安楽死を行い、チャンバー容積の30%〜70%の充填率で1分間に変位させます。2〜3分後、呼吸と心拍24を監視して動物の死亡を確認します。
  4. 犠牲の後、すべての動物を解剖台に仰向けの位置に置き、前足を上向きにし、後足を下に向けてピンで固定します。動物の腹部に消毒液を振りかけます。
  5. 次の臓器を切除します:精巣、精巣上体、子宮、卵巣、肝臓、甲状腺。35 mLの10%緩衝ホルマリン(すべての臓器)またはBouinの溶液(精巣のみ)を入れた50 mLチューブで秤量して保存するか、極低温チューブ(臓器/チューブ)に収集し、すぐに液体窒素で凍結します(-80°Cで保存するため)。
    1. まず、恥骨から上腹部まで、正中線をハサミで皮膚を切ります。胸郭に2つの横方向の切り込みを入れ、切開部の両側の皮膚を反射させて胸部内臓を露出させます。
    2. 最初に生殖器官を取り出します。雄ラットでは、腹腔内に位置する楕円形の対になった器官である精巣を腹腔内位置(陰嚢嚢)で切除します。陰嚢を切って押し、精巣が突き出ていることを確認してから、軽くつかみます。ペンチで内臓脂肪を保持し、精巣を内臓から切り取ります。切除後、精巣を秤量し、組織病理学的分析のためにBouinの溶液に保存します。
    3. 雌ラットでは、最初に子宮を繊細につかみ、次に内臓脂肪組織から卵巣(両方の子宮角の端にある)を切り取ります。切除後、卵巣の重さを量ります。
    4. 雌ラットと雄ラットの両方で、肝臓が位置する腹腔の右側に移動します。肝臓は多葉性器官であり、多くの部分を識別することが可能である:左内側(小さい)、左外側(大)、右内側(小さい)、右外側(大)、尾状、および正方形葉25。鉗子で肝臓をつかみ、壊さないように注意してください。ペンチで剣状突起をつかみ、はさみで横隔膜を完全に切断します。
    5. 鉗子を使用して剣状突起を持ち上げ、腹腔から肝臓を取り出します。はさみで横隔膜から肝臓を分離します。その後、肝臓の重さを量って保管します。
    6. 甲状腺摘出のためには、はさみの助けを借りて、動物の首に沿って垂直に切り、皮膚と筋肉組織を取り除き、甲状腺が位置する気管の端を穏やかにトリミングします。さらなる分析のために甲状腺を保存する26。
  6. 以下で説明するように精子カウントを行います。
    1. 精巣を摘出した後、それぞれの精巣の後縁に付着し、陰嚢に含まれている精巣上体をつかみます。
    2. この実験では、右の精巣上体の尾から精液サンプルを採取します。採取時には、ハサミで脂肪と結合組織の尾部を洗浄し、残った部分から分離し、DMEM1mLを入れたシャーレ(35mm×10mm)に入れます。ハサミでカットし、パスツールピペットで流して、内容物の放出を促進します。
    3. 得られたすべての液体を15 mLチューブに移し、DMEMで容量を10 mLにします(希釈係数1:10 = 0.1)。内容物をピペットで固定し、均質化して懸濁液を作成します。わずかに振とうした後、懸濁液10μLを取り、ノイバウアーチャンバーにロードします。カメラをロードし、カメラをロードしてから3分後、カウントを開始します。

5. 酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)アッセイ

  1. 血液サンプル(動物あたり約2〜5mL)を2mLチューブに収集し、室温で1時間凝固させます。すべての血液サンプルを遠心分離機で2回、4°C、3000 x gで15分間遠心します。
  2. 遠心分離された血液は、色の異なる3つの層からなる多層的な外観をしています。最上層は、血液の液体部分である血漿(通常は黄色または透明)で構成されています。プラズマの下の層は白っぽい色または灰色の色をしており、バフィーコートです。最下層には赤血球が含まれており、色が濃い赤または明るい赤に見える場合があります。性ホルモンレベルを決定するには、ピペットですべてのサンプルの血清を採取し(バフィーコートや赤血球層に触れずに)、アリコート(500μL)に分けて-80°Cで保存します。
  3. どちらのモデルでも、ELISAテストを実施して、性ホルモンを測定するために、サンプル中のタンパク質、抗体、または抗原の存在を検出および/または測定します。直接法を使用し、各ELISAキットの指示に従ってください。この研究では、ラットで次のホルモンの血清レベルが決定されました:E2、ラットエストラジオールELISA;T、マウス/ラットテストステロンElisa;TSH、ラットELISAキットおよびT4、ラットELISAキット。

6. 病理組織学的解析

  1. 以下の手順に従って、組織の組織学的スライドを調製します。
  2. 抽出時に子宮、卵巣、甲状腺、肝臓のサンプルを10%緩衝ホルマリンで少なくとも48時間固定します。
    注意: ケミカルフードの下で作業してください。物質/混合物を吸い込まないでください。蒸気/エアロゾルの発生を避けてください。
  3. サンプルを流水で1時間洗浄した後、処理まで80%エチルアルコール(C2H5OH)で保存し、細胞死による原形質構造の変化から保護します。
  4. 精巣を、ピクリン酸の飽和溶液15 mL、濃縮ホルマリン5 mL(33%-40%)、および氷酢酸1 mLからなるブアン溶液で48時間固定します。サンプルを80%エチルアルコールで洗浄します。
    注意: ケミカルフードの下で作業してください。
  5. 自動組織処理装置を用いて固体パラフィンへのインクルージョンを行います。インクルージョンプロセスの最後に、溶かしたパラフィンを注いだ小さな金属容器にサンプルを入れ、冷凍プレート上で冷まして、カット用のブロックを形成します。目的の切断セクションに応じて向きを変えます。
  6. その後、回転するミクロトームを使用してサンプルをカットします。小さなブラシを使用して5〜6μmの切片を採取し、37°Cの水に数秒間広げて、顕微鏡のスライドガラスに置きます。スライドを垂直に数分間水気を切り、36°Cのオーブンで少なくとも1時間乾燥させます。
  7. ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、下記のように行ってください。
    1. スライドをテルペン由来の清澄剤(キシレン代替品)に5分間浸して脱パラフィンします。
    2. スライドを次の一連の段階的なエタノールに浸して、スライドを再水和します。各溶液について、100%エタノール、95%エタノール、80%エタノール、50%エタノール、および蒸留水。
      注:はプロトコルの停止点になることができ、スライドは水中でRTに数時間放置できます。オプションで、スライドを水中で4°Cで保存することもできます。
    3. スライドをメイヤーのヘマトキシリンに5分間置きます。すぐに水道水を入れた容器に5分間戻します。セクションから最も遠いコンテナの後ろの隅に水道水を流します。水中の紫色がなくなるまで、定期的に容器を空にします。
      注意: スライドからセクションが剥がれるのを防ぐため、スライドに直接水を流さないでください。
    4. スライドをエオシンY 1%水溶液に2分間入れます。スライドを蒸留水に15秒間移します。スライドを次の一連の段階的なエタノールに浸して脱水します。各溶液について、15秒/ディップ:50%エタノール、80%エタノール、95%エタノール。
    5. スライドを100%エタノールに1分間入れ、さらに1分間新鮮な100%エタノールに変更します。スライドをテルペン起源の清澄剤(キシレン代替物)に2分間置き、さらに2分間、テルペン起源の新鮮な清澄剤(キシレン代替物)に変更します。一度に1つのスライドを取り外し、カバースリップを置きます。
    6. セクションを封入剤で覆い、スライドの底にカバースリップを置きます。
      注意: 封入剤がスライドを所定の位置に引っ張っていることを確認してください。カバーガラスが平らでない場合は、軽くたたいて所定の位置に押し込みます。余分な封入剤はペーパータオルで拭き取ります。
    7. テルペン由来の清澄剤(キシレン代替品)にクリーニングワイプを浸し、スライドの裏側を拭いて滴り落ちた媒体を取り除きます。スライドを段ボールのような可動式の固体面に平らに置きます。手順6.7.6で説明したように、残りのすべてのスライドにカバースリップを追加します。スライドを乾燥させ、封入剤をフード内のRTで硬化させます。
      注意: ケミカルフードの下で作業してください。
  8. 染色後、サンプルをカバースリップで覆い、光学顕微鏡で評価します。病理組織学的変化は、分布、重症度、および形態学的特徴に基づいて説明されています。
  9. Shackelford et al.27 によって説明され、次のように要約された基準に基づいて、変更の重症度を考慮して、5 段階の評価スケール (0 から 4) を使用して、傷害スコアリングを半定量的に実行します。
    グレード0:変更なし
    グレード1:最小限の変更。その影響は組織にはほとんど見えません。小さくてまれです。組織の一部が 10% 以下に影響を与えます。
    グレード2:光の交換。小さな組織学的変化を表します。このグレードは、組織またはその構造が11%から20%の体積変化を示した場合に使用されます。
    グレード3:中程度の変化。変化は組織で明らかです。程度は、組織またはその構造の21%〜40%の間の変動の存在を示します
    グレード4:顕著な変更。組織またはその構造の圧倒的な組織学的変化。変動は組織の41%〜100%に影響を及ぼします。
  10. 子宮、卵巣、精巣、甲状腺の定量的組織形態測定分析を行います。光学顕微鏡に適用された画像解析システムを使用して組織切片を検査し、以下の手順に従ってください。
    1. 子宮:2倍の対物レンズを使用して、右子宮角の各横断面、外部および内部の子宮筋層、および子宮内腔の総面積を測定します。子宮内膜と子宮内膜の面積、および子宮内膜の面積と子宮内膜の面積の比を計算します28。
    2. 卵巣:卵巣の中央位置にある全セクションの1つを使用して、発達のさまざまな段階にある卵胞を明らかにします。4倍の対物レンズを使用して、一次卵胞、二次卵胞、黄体卵胞、Graaf卵胞、およびatresic卵胞を数えます。フォーチュン29に従って卵胞の分類を行います。さらに、各サンプルの卵巣の面積とその卵胞密度(卵胞数/卵巣面積×100)30を測定します。
    3. 精巣:10倍対物レンズを使用して、20個の尿細管/サンプルを測定します。さらに、総ルーメン面積、総面積、長手方向の直径、および横方向の直径28を測定します。
    4. 甲状腺:次のパラメータを測定します:卵胞密度(卵胞の数と特定の領域との比率、目標の10倍)。間接的な濾胞細胞の高さ (ランダムに選択された 5 つの卵胞における卵胞面積とコロイド面積の平均比/サンプル 40x 対物レンズ);卵胞上皮領域と核数の平均比率(卵胞の成熟を確認するための同じ卵胞内)。濾胞細胞の高さ(ランダムに選択された5つの卵胞/サンプルにおける5つの細胞の高さの平均、64倍の目的)31。

7. 遺伝子発現

  1. どちらのモデルでも、-80°Cで保存した肝臓サンプルを使用して遺伝子発現解析を行います。 キットを使用して、動物組織のライセートから開始する全RNA精製のプロトコルに従ってください。
    1. 肝臓溶解物を得るには、組織サンプル(10 mg)をミニピナーで粉砕し、600 μLのRL BUFFER(キットに付属)を組織サンプルに加え、サンプルが均質化されるまで粉砕を続けます。
  2. 抽出後すぐに、得られたRNAを定量し、蛍光分光計を使用してその品質(変性またはタンパク質残基の存在)を評価します。260 nmと280 nmの波長で分光光度吸光度を読み取り、核酸とタンパク質がそれぞれ吸収します。
  3. 全RNA濃度を評価した後、製造元の指示に従ってcDNA合成キットを使用して、各サンプルから1 μgの全RNAを含む適切な量をcDNAに逆転写します。
  4. 得られたcDNAをRT-PCRで解析します。
    1. 目的遺伝子の遺伝子発現を解析するために、各標的遺伝子、および構成的に発現するグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)の参照遺伝子に対して、特異的なフォワードプライマーとリバースプライマーが設計されています。ウェブアプリケーションのPrimer-BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)を使用して、目的の遺伝子のみに対するペアリングの特異性を保証し、商用サプライヤーによって合成されたオリゴヌクレオチドを得るのに最適なプライマーを選択します。使用したプライマーペアの配列を表5に示します。
    2. 凍結乾燥プライマーをRNAseフリー蒸留水で最終濃度100 mMに再懸濁します。専用キットを使用してqPCR解析を行います。最終容量20 μLで反応を行い、アニーリングしたcDNAを1:40に希釈します。各サンプルを96ウェルPCRプレートに二重にロードします。
    3. このプログラムに従って、サーマルサイクラーでqPCRランを実行します:95°Cで1サイクル、10分間。95°Cで15秒、58°Cで30秒、72°Cで1分間で40サイクル。最後に、55°Cから95°C(30 s/°C)までの解離サイクルを実行して、増幅された製品の特異性を確認します。マシンの専用ソフトウェアを使用して、各サンプルの閾値サイクル値(Cycle Threshold、Ct)を取得します。結果をPfafflの式32に従ってΔΔ Ct(デルタデルタCt)として表します。
      ΔCt標的遺伝子= Ctコントロール-Ct処理
      ΔCt参照遺伝子 = Ctコントロール - Ct処理
      ΔCt = ΔCt 標的遺伝子 - ΔCt 参照遺伝子

8. データ分析

  1. スプレッドシートを使用してデータ管理を実行します。統計解析ソフトウェアを使用して分析を実行します。特定のソフトウェアを使用してグラフィックをデザインします。
  2. bwゲイン、飼料消費量、絶対および相対臓器重量、ホルモン血清レベル、組織形態測定データ、および遺伝子発現データを平均±標準偏差として表します。ノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス分析を実行し、続いてポストホックなペアワイズ比較(マン・ホイットニー検定)を実行します。
  3. 2 因子フィッシャー正確確率検定を使用して組織学的データを解析し、重症度グラデーション (総所見発生率) を参照せずにカテゴリに割り当てられたサンプルを含む、対照群との有意差を特定します。Cochran-Armitage Trend Testを使用して、用量反応の傾向を特定します。p値が0.05<場合、グループ間の差を有意と見なします。

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結果

Tassinariら14 およびTammaroら33によって実証されたように、以下の結果はラットに対するGAHTの成功とモデルの適切性を示しました。

死亡や攻撃性などの異常な行動は記録されておらず、毒性や苦痛の臨床徴候(例えば、活動の低下、立毛、手入れの行き届いていない外観)は観察されません14。

発情期および発情期の成体雄ラットおよび雌ラットの血漿T濃度は、それぞれ5.71 ± 0.84 ng / mlおよび1.24 ± 0.29および0.80 ± 0.36 ng / mlです34。性腺に無傷のラットにおけるTの平均循環レベルは3.5 ± 0.5 ng / mL35です。両モデルの対照ラットで測定されたTおよびE2レベルは、文献33で示された...

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ディスカッション

GAHTを模倣したげっ歯類モデルの実施は、TGの人々の潜在的な特異的感受性と脆弱性、および通常は彼らの生涯にわたる治療の長期的な結果を研究するために重要です。

文献に類似の研究がほとんどないことを考えると、この実験の重要なポイントは、モデルを設定するための用量の選択です。そのような用量は、動物での長期投与と互換性があり、副作用、毒性、および/または死亡を引き起こすことなく、十分に低くなければなりません。.もう1つの重要な点は、人間の好ましい経路を考慮に入れて、採用する最良の投与経路である。実際、dFMモデルでは、TはTG男性15の臨床診療に従って投与されますが、dMFモデルでは、投与経路はTG女性15の臨床診療と重複しませんでした。より信頼性の高い方法を確立するには、さらなる実験が必要です。実際、2つのラットモデルは、人間の治療を可能な限り模倣するように設計されています。彼らは、生殖、甲状腺恒常性、肝臓代謝など、いくつか...

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開示事項

著者らは、この研究は、利益相反を引き起こす可能性のある商業的または金銭的関係なしに行われたと宣言しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
分析天びん ABJ 320-4NMKernZ741091
BouinBiooptica05-M01008
遠心分離機 5415 REppendorfドルフ用
酸シプロテロンSigma-AldrichC3412
D-MEM 培地Gibco
ExcelTaq 2X 高速 Q-PCR マスターミックス (SYBR、ROX)、200 RXNスモビオ TQ1210
ホルマリン溶液、中性緩衝液、10%シグマ・アルドリッチHT501128
GraphPad プリズム・ソフトウェア・バージョン5.0  Windows用GraphPadソフトウェア
ヘマトキシリン・バイオオプティカ05-06002/L
ヘオシン・バイオオプティカ05-10007/L
イメージング・ソフトウェアコンNIS-BR
JMP 10統計ソフトウェアSAS Institute 
MicromThermo ScientificHM 325
顕微鏡Nikon Microphot FX
マウス/ラット テストステロン ELISABiovendorRTC001R 96T
NanoDrop 1000 分光光度計Thermo ScientificND-1000
ParaffinaBiooptica087910
ポータブル天びんSCOUT STX2202OHAUSbr/> 30253064
プライマープライマー プライマー ライ
ストラジオール ELISAバイオベンダーRTC009R96T
ラット TSH(甲状腺刺激ホルモン) ELISA キットELK バイオテクノロジーELK228396T
ラット TSH(甲状腺刺激ホルモン) ELISA キットELK バイオテクノロジーELK228396トン
SensiFASTcDNA合成キットBiolineBIO-6505350反応
セサムオイルACROSAC241000010
SpragueDawleyラット 男性と女性のEnvigo8/9 週齢 標準
食ムセドラ4RF18
T4(チロキシン) ELISA キットELK バイオテクノロジーELK871696T
テストステロン エナントゲン酸塩シグマ・アルドリッチT3006
サーマルサイクラー LineGene 9600 Plus BioerAurogene
ティッシュプロセッサシャンドンエクセルシオール ES、サーモサイエンティフィック)
トータルRNA精製キットNorgen1720050カラム
Victor 3 マルチラベルリーダー パーキンエルマー
&ベータ;-エストラジオール17-吉草酸シグマ-アルドリッチE1631
エッペン 酢 ニ<マー ライズ エー

参考文献

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性別を肯定するホルモン療法を模倣したラットモデルの確立
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