方法論記事

感染関連遺伝子発現を研究するための嚢胞性線維症凝集体バイオフィルムモデル

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DOI:

10.3791/67477

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2025年4月18日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, University of Liverpool, 2Division of Molecular Microbiology, School of Life Sciences, University of Dundee

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この研究では、嚢胞性肺環境を反映した緑膿菌遺伝子発現を評価するための凝集ポリ微生物バイオフィルムモデルを開発し、RNA抽出プロトコルを最適化するためのフレームワークを概説しています。アプリケーションには、抗菌効果の評価や、嚢胞性線維症に関連する条件下での抗生物質の代替品の研究が含まれます。

要約

嚢胞性線維症の人々の慢性肺感染症の治療に使用される新規抗菌薬の標準的な前臨床試験方法は、敵対的な肺ニッチの環境条件を反映していません。現在の還元主義的な試験条件は、嚢胞性肺ニッチに適した条件下での活性の証拠なしに、前臨床パイプラインに沿って化合物が進行する可能性があります。従来の抗菌薬の研究に用いられるいくつかのアプローチは、抗定量感知剤やシデロフォア阻害剤などの抗病原性治療薬など、代替抗生物質には適していない可能性があります。このプロトコルは、緑膿菌の凝集バイオフィルムモデルを文書化し、単一種および多種の培養物(黄色ブドウ球菌およびカンジダアルビカンス)における耐性および感染関連遺伝子発現を比較し、algDを例に、遺伝子発現のコロニー形成単位(CFU)の減少と変化を調べます。このモデルは、化合物の量が限られている可能性のある医薬品開発パイプラインの探索段階で新規化合物の研究を可能にするために、少量の静的な細菌培養物に最適化されています。単一種の緑膿菌バイオフィルムは、合成嚢胞性線維症培地2(SCFM2)で24時間形成された後、メロペネムを異なる濃度(1、16、および256μg/mL)でさらに24時間処理しました。黄色ブドウ球菌とカンジダ・アルビカンスをSCFM2で一緒に増殖させ、さらに緑膿菌を24時間接種し、メロペネムで治療することにより、ポリミクロバイオフィルムを確立しました。前臨床試験における化合物有効性測定と臨床試験結果との間に直接的な関連性がないことは、現在の実験室スクリーニングツールの適用性に疑問を投げかけています。このモデルにより、耐性や病原性に寄与する遺伝子など、緑膿菌の遺伝子発現に関連する因子の影響を理解することができ、それによってこのギャップを埋めることができます。

概要

嚢胞性線維症(CF)は、白人の集団内で最も一般的な常染色体劣性疾患です1.嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)遺伝子の変異は、気道内の粘液の過剰産生を含む一連の臨床症状を引き起こします。イオン輸送が損なわれると、この粘液は脱水状態になり、その結果、粘液線毛系によって適切に除去されず、慢性肺感染症1に対する感受性が高まります。CF肺の微生物学は、日和見病原体の明確なグループで構成されており、インフルエンザ菌と黄色ブドウ球菌は、CFの乳児や子供の肺に感染する主要な生物と考えられており、その後、これらの生物が減少し、その後、成人期にはBurkholderia spp.または緑膿菌が定着します1,2,3,4.細菌種に加えて、真菌微生物もCF肺環境によく見られ、カンジダsppとアスペルギルスsppは最も一般的に分離された真菌種です3,4,5。これらの生物はCF肺感染症に重要な役割を果たしていますが、培養技術や培養に依存しない方法の進歩により、CF肺感染症が単一の細菌種に限定されることはめったにないことが示されており、CF肺の複雑な多微生物性が浮き彫りになっています1,6.

この知識にもかかわらず、慢性肺感染症で使用する抗生物質の開発と試験のための現在のin vitroおよびin vivoの方法は、CF肺niche7と完全に類似していません。焦点は、単一種の培養に対する薬物の最小阻害濃度(MIC)を決定することに置かれています。これにより、CF 肺病理学8の主要な要素である感染性微小環境について、限られた考慮しか得られません。そのため、方法は通常、プランクトン培養としての細菌の増殖を伴いますが、この成長状態はCF肺内の細菌の成長を反映していない可能性があります。これは、緑膿菌にとって特に重要であり、通常、他の細菌種や真菌種を追加で含むバイオフィルムの凝集体として現れます9。このような要因は、慢性肺感染症に対する抗菌薬の試験において課題を提示し、CF肺環境における抗菌薬感受性試験方法と抗菌活性との格差を浮き彫りにしています9,10.これらの課題は、抗病原性治療薬などの代替抗生物質をスクリーニングする際に、MICアッセイが活性の指標ではなく、宿主と病原体の相互作用の理解を提供しない場合に悪化します11。

アルギン酸は、細胞外多糖類であり、肺のニッチ内の緑膿菌バイオフィルムの主要成分であり、抗生物質や免疫剤に対する細菌の耐性を高めるとともに、表面接着性を高めます12.アルギン酸塩は抗病原性療法の開発にとって魅力的な標的であり、アルギン酸塩生合成を標的とするいくつかの治療法が開発されており、例えば、アルギン酸塩生合成の重要な遺伝子であるアルgDを標的とする治療法が開発されています13,14。このような治療法は、CF患者における抗生物質療法と組み合わせて使用 され、緑膿菌のバイオフィルムを破壊し、細菌をプランクトン状態に変換することができる。これにより、バイオフィルムの細胞外マトリックスが破壊されると、抗生物質が細菌の標的に到達する能力が増加するため、抗生物質の有効性が向上します15。しかし、in vitro活性の証拠にもかかわらず、CF肺ニッチ内でのこれらの治療薬の作用は不明のままです。

ここで紹介する凝集バイオフィルムモデルは、CF肺内で緑膿菌と共通の共植者である黄色ブドウ球菌とC.アルビカンスを追加することで、これらの問題に対処する役割を果たします。また、呼吸器環境で見られるように、緑膿菌がバイオフィルム凝集体で増殖することを可能にします。成長のための栄養環境として、喀痰模倣培地である合成嚢胞性線維症培地2(SCFM2)を使用することで、ムチン、細胞外(e)DNA、CF肺内で見られるものを複製するアミノ酸プロファイルなどの宿主の影響<追加できます>16。

CF肺の状態をさらに捉えるために、バイオフィルムは、肺の増悪期間中にCF患者に頻繁に処方される抗生物質であるメロペネムにさらされます。このモデル内での抗生物質の使用は、抗病原性薬剤が処方される可能性のある臨床状態を再現する手段として、例えば、増悪時の呼吸器症状を管理するための抗生物質治療と組み合わせた併用療法として推奨されます。.さらに、メロペネムを含めることで、感染関連条件下での抗生物質曝露に対する緑膿菌の転写反応の評価が可能になります。このモデルは、CF肺内の適切な薬物標的となる因子に関する情報を提供するために使用できます。また、このモデルを修正して、トブラマイシンなどの他の関連する抗生物質を含めたり、他の目的遺伝子の発現を評価したりすることもできます。

ここでは、この凝集多微生物モデルを使用して、黄色ブドウ球菌とカンジダ・アルビカンスの存在、およびメロペネムの濃度の変化(1、16、および256 μg/mL)が緑膿菌によるalgDの発現に及ぼす影響を評価します。メロペネムは、主に緑膿菌の肺感染症を治療するために処方され、黄色ブドウ球菌またはC.アルビカンスには直接的な影響はありません。これらの共生種の両方のMICは>256μg/ mLです。.

この研究は、SCFM2内の宿主因子や共コロニー形成微生物などの関連因子が緑膿菌感染関連遺伝子の発現にどのように影響するかについての理解を深め、慢性CF呼吸器感染症で使用する抗病原性治療薬の開発と試験の基礎を提供します。

プロトコル

1. 単一生物種のバイオフィルムの調製

  1. 凍結ビーズストック培養物から緑膿菌PAO1を蘇生させるには、Lysogeny Broth(LB)寒天培地に1つのビーズをストリーキングし、37°Cで24時間インキュベートします。
  2. PAO1の一晩培養物を調製するには、ストリークプレートから1つのコロニーを取り出し、それを5 mL LB培地に加えます。一晩(18時間)インキュベートし、OD600の0.05(1 x 108 CFU/mLに相当)に希釈し、さらにPalmer, et al.16に従って調製したSCFM2で1:100に希釈します。
  3. 丸底の96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに180μLの接種物を加えます。コロニー形成単位(CFU)による計数のために、生物学的トリプリケートでバイオフィルムを調製します。生物学的複製ごとに合計3回の反復が、qPCRのみで実行されます。3つの別々のウェルに、培地コントロールに使用する滅菌SCFM2を180 μL加えます。
    注:丸底プレートは、周囲の成長培地17にバイオフィルム全体を均一に露光できるという優位性により、従来の平底プレートとは対照的に選択されました。
  4. バイオフィルムを24時間かけて形成し、37°Cでインキュベートし、75rpmで振とうします。

2. 多種バイオフィルムの作製

  1. 上記のように、P. aeruginosa PAO1およびS. aureus SH1000を凍結ビーズストック培養物から蘇生させます。C. albicansのCAF2.1を凍結ビーズストック培養物から蘇生させるには、Saboraudデキストロース寒天培地に1つのビーズをストリーキングし、37°Cで24時間インキュベートします。
  2. SH1000 と CAF2.1 の一晩培養物を調製するには、ストリークプレートから 1 つのコロニーを取り出し、5 mL の LB を添加します (生物ごとに別々の一晩培養します)。18時間一晩インキュベートします。黄色ブドウ球菌 SH1000 と C. albicans CAF2.1 の LB から OD600 までの値 0.1 で一晩培養します。これはそれぞれ 1 x 109 と 1.2 x 107 CFU/mL に相当します17,18。
  3. 黄色ブドウ球菌とC.アルビカンスを希釈して、SCFM2でそれぞれ1 x 106および1 x 105 CFU / mLの濃度で両方の種を含む単一の接種物を形成します。
  4. 162 μLの接種材料を96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加えます。生物学的トリプリケートにバイオフィルムを接種し、コロニー形成単位(CFU)による計数を行います。生物学的複製ごとに合計3回の反復が、qPCRのみで実行されます。3つの別々のウェルに、培地コントロールに使用する180 μLの滅菌SCFM2を加えます。
  5. バイオフィルムを24時間形成し、37°Cでインキュベートし、75rpmで振とうします。
  6. ストリークプレートから単一のコロニーを取り出し、それを5 mLのLB培地に加えて、PAO1の一晩培養を準備します。一晩(18時間)インキュベートし、OD600で0.05(1 x 108 CFU/mLに相当)で添加し、さらにSCFM2で1 x 105 CFU/mLに希釈します。
  7. 14.2 μL の PAO1 接種物を 96 ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加えると、PAO1 の最終接種材料は 1 x 104 CFU/mL になります
    注:異なる種間の接種剤の濃度のこの変動は、黄色ブドウ球菌とC.アルビカンスが緑膿菌に負けず、抗生物質が存在しない24時間バイオフィルムからのスポットプレーティングによってすべてが回収可能であることを保証するためです。
  8. ポリマイクロバイオフィルムを24時間かけて形成し、37°Cでインキュベートし、75rpmで振とうします。

3. 単一種および複数種のバイオフィルムのDNaseと抗生物質処理

  1. 2 μL の DNase I をバイオフィルムを含むウェルに最終濃度 50 μg/mL で直接加え、37 °C で 1 時間インキュベートし、75 rpm.
    で振とうします。 注:これは、肺増悪の管理戦略として嚢胞性線維症の多くの人々が服用するrhDNase(組換えヒトDNase)の投与量を反映して、抗菌薬の浸透を改善するために粘性バイオフィルムを薄くするために追加されます。
  2. 希釈剤として蒸留水を使用して、メロペネムの抗生物質ストックを2.56 mg / mLに調製します。.2倍に段階希釈して、0.01 mg / mL〜2.56 mg / mLの濃度を達成します。.
  3. 各メロペネム希釈液を20μLをバイオフィルムに加えると、1 μg/mL - 256 μg/mLの投与量範囲が得られます。抗生物質の代わりに、20 μLの蒸留水をネガティブコントロールバイオフィルムに加えます。
  4. 96ウェルマイクロタイタープレートを透明フィルムでシールし、75rpmで振とうしながら37°Cで24時間インキュベー
    5. トします。

4. 生存細胞と代謝活性の列挙

注:次の手順は、CFU定量専用のバイオフィルム用です。

  1. 10 μLのセルラーゼ(100 mg/mL、0.05 Mクエン酸緩衝液)をバイオフィルムに加え、140 rpmで振とうしながら37°Cで1時間インキュベートします。セルラーゼは、バイオフィルム内のセルロース骨格を破壊するために定期的に使用されます19,20,21。必要に応じてピペッティングで上下に動かし、目に見える塊がなくなるまでバイオフィルムをさらに破壊します。
  2. 0.02%レサズリン溶液10μLを添加して、試験バイオフィルムおよびコントロールバイオフィルムの代謝活性を評価し、140rpmで振とうしながら37°Cで1時間インキュベートします。
  3. マイクロプレートリーダーで540 nmの励起波長と590 nmの発光波長を使用して、各ウェルの蛍光を測定します。
  4. ブランク培地サンプルから蛍光値を差し引いてバックグラウンド蛍光を補正し、(F抗生物質処理バイオフィルムの平均/平均F陰性コントロール)x 100%として減少率を計算します。
  5. 破壊されたバイオフィルムとプランクトン細胞の両方を含むウェルの内容物を、次のように選択的寒天上に連続希釈およびスポットプレーティングすることにより列挙します:
    緑膿菌の計数のための1%グリセロールおよびCNサプリメントを添加したシュードモナス選択的寒天培地< /> 黄色ブドウ球菌の列挙のためのマンニトール塩寒天|
    ペニシリン(250 U/mL)、ストレプトマイシン(250 μg/mL)、硫酸ゲンタマイシン(30 μg/mL)、およびバンコマイシン(3 μg/mL)を添加した酵母ペプトンデキストロース寒天培地に、C. albicansの計数用。
    注:ウェルの全内容物は、浮遊骨材バイオフィルムをプランクトン細胞から分離するという課題のために列挙されています。ただし、このアプローチは、嚢胞性線維症の肺に存在する状態をより正確に反映しています。インキュベーション後に蓋に結露が生じることがあります。ウェル間の汚染がないように、滅菌コントロールを選択的な寒天上にスポットプレートします。
  6. 選択的寒天にスポットプレーティングした後、プレートを37°Cで24時間インキュベートしてから、計数します。

5. RNA抽出用バイオフィルムの作製

注:この時点以降のすべてのステップは、RT-qPCR分析専用のバイオフィルム用です。

  1. バイオフィルムが入った96ウェルマイクロタイタープレートを37°Cインキュベーターから取り出し、1 mLのマイクロ遠心チューブに移します。移管時には、バイオフィルムの複製が生物学的反復ごとにプールされていることを確認してください。これにより、RNA抽出に十分なバイオマスが確保されます。
  2. バイオフィルムを含む1.5 mLチューブを16,000 x gで5分間遠心分離します。同日にRNA抽出を行う場合は、ステップ6.2.1に進みます。同日にRNA抽出を行わない場合は、上清を取り除き、ペレットを-20°CのRNA安定化溶液250μLに保存してください。この溶液は、いくつかの研究で細菌ペレットの保存に使用されています22,23.

6. RNA抽出

  1. 市販のキットを使用して、細菌のRNA単一種および複数種のバイオフィルムを抽出します。メーカーのガイドラインの指示に従ってバッファーを準備します。
  2. 培地の上清を取り除き、廃棄します。ペレットを安定化溶液で保存した場合は、室温まで解凍し、16,000 x gで5分間遠心分離します。ペレットを600 μLのRNA抽出試薬に再懸濁し、2 mLシリンジに取り付けられた0.2 mmの針を使用して手動で破壊します(5〜10回吸引するか、ペレットが完全に破壊されるまで
    3. 吸引します)。
  3. メーカーのガイドラインの指示に従ってRNA精製ステップを実行します。
  4. UV分光器、RNA BRアッセイキット、チューブを使用してRNAを定量します。アッセイキットを使用したRNAの検出可能な限界は10〜1200 ng/μLであるため、このプロトコルのRNAの最小許容収量は10 ng/μLです。
    1. サンプルとスタンダードに必要なチューブ数を設定します(スタンダードは2つ必要です)。
    2. サンプル数ごとに199 μLのバッファーと1 μLの試薬(+2標準、エラーの場合は2)を加えて、作業溶液を調製します。
    3. 190 μLの作業溶液と10 μLのStandard 1およびStandard 2を別々のチューブに加えます。
    4. 199 μLの作業溶液と1 μLのRNAサンプルを別々のチューブに加えます。30秒間渦巻き、その後、暗い場所に5分間保管します。
    5. 蛍光光度計で、[RNA]>[Broad range RNA]を選択し、指示に従います。
    6. 分光光度計を使用してRNAの品質を評価します。分光光度計にDNase/RNase-Free Waterの1 μLをピペッティングして、分光光度計をブランクにします。糸くずの出ないワイプで水を拭き取り、吸光度の比率を260/280nMに設定します。1 μL の RNA を分光光度計にピペットで移します。RNAが純粋な場合、260〜280 nMの1つのピークが観察され、~2.0の比率が表示されます。
  5. 抽出したRNAをcDNA Synthesis Kitを用いて相補的DNA(cDNA)に変換します。50 ng/μLを超えるRNAサンプルの場合は、まずDNase/RNase-Free Waterを使用して50 ng/μLに希釈します。
    1. チューブを使用して、表1に従ってcDNA反応混合物を調製します。
    2. 次の条件を使用してサーマルサイクラーにチューブを置きます:25°Cで5分間、42°Cで30分間、85°Cで5分間、cDNAをすぐに使用するか、-20°Cで凍結して保存します。

7. qPCR

  1. qPCR Master Mixを使用してqPCRを実行します。以下のalgDおよびハウスキーピング遺伝子(16S)プライマー(表2)を使用してください
    注:プライマーは、緑膿菌の全ゲノム配列を参照してNCBI-primer Blastオンラインツールを使用して設計され、その後、商用ベンダーを通じて合成されました。プライマーは、NCBI-primer Blastツールを使用した配列マッチングにより、ポリマイクロビカルバイオフィルムの特異性が検証されました。
  2. プライマー20 μLを480 μLのDNase/RNase-Free Waterで希釈することにより、プライマーを4 μM(4 pm/μL)に希釈します。これらは、複数の用途のために冷凍することができます。
  3. 表3.
    の指示に従って、qPCRマスターミックスの作業溶液を調製します。 注:algDワーキングソリューションには、メロペネム濃度あたり3回の生物学的リピートと3回のテクニカルリピート、6回のネガティブコントロール、および2回のエラーに十分な溶液が含まれています。16S ワーキング溶液には、既知の RNA 濃度の 2x 標準試料と 2x エラーに十分な溶液が含まれています。
  4. 18 μLのalgDワーキング溶液を適切なqPCR反応チューブに加えます。これには、algD 発現分析用の合計 36 本のチューブと、ネガティブ コントロール用の 6 本のチューブが含まれます。
  5. 各qPCR反応チューブに2 μLのRNAを、またはネガティブコントロールに2 μLのDNase/RNase-Free Waterを添加します。
  6. 18 μLの16Sワーキング溶液を適切なqPCR反応チューブに加えます。これには合計2本のチューブが含まれます。既知の濃度のRNA2 μLをqPCR反応チューブに加えます。
  7. 次の条件に従ってqPCRを実行します:95°Cで2分、95°Cで15秒(40サイクル)、60°Cで1分。
  8. 前述したように、2-ΔΔCt法を使用してqPCR結果を解析します24。algD発現を解析する場合は、それぞれのバイオフィルム組成のコントロールとして0 μg/mLでのalgD発現を使用し、未処理の培養に関連するフォールド変化発現を考慮してください

結果

図1Aに示す結果は、単一菌種のPseudomonasバイオフィルムをメロペネムで処理した際、どの投与量においても有意な減少が観察されなかったことから、その耐性が高いことを強調している。メロペネムに曝露させなかった陰性対照では 8.31 ± 0.07 Log10CFU/mL の回収率を示し、生存細胞の最大の減少は 16 µg/mL で起こり、回収率は 8.06 ± 0.10 Log10CFU/mL となった。しかし、このレベルの耐性は予想通りである。文献によれば、P. aeruginosaバイオフィルムは浮遊細胞よりもメロペネムに対して遥かに高い耐性を持ち、浮遊細胞の MIC が 2 µg/mL であるのに対し、バイオフィルムに対して殺菌的に作用させるには >256 µg/mL の濃度が必要であることが示されている25,26。

図1Bは、メロペネムに曝露しなかったコントロールバイオフィルムと比較して、各抗生物質濃度のP. aeruginosa単独培養バイオフィルムにおける代謝活性の平均減少率を示しています。蛍光の減少は代謝活性の低下を意味し、生存細胞数の減少の指標として捉えられます。メロペネム処理した培養物では代謝活性の上昇（負の減少率として表示）が見られ、殺菌活性がない（または極めて限定的である）ことが示されました。

CFU回収量の増加を伴わない代謝活性の上昇は、抗生物質への曝露に対する細菌の代謝応答を示している可能性があります。単一菌種バイオフィルムと多菌種バイオフィルム（図2）を比較すると、P. aeruginosaの全体的な増殖にわずかな差しかなく、抗生物質が存在しない場合、単一菌種バイオフィルムからの生存細胞の回収量は、多菌種バイオフィルムで観察された値よりも0.74 ± 0.17 Log10CFU/mL高い結果となりました。多菌種バイオフィルムからは、S. aureusが6.95 ± 0.11 Log10CFU/mL、C. albicansが1.66 ± 2.88 Log10CFU/mL回収されました。しかし、C. albicansはメロペネムが添加されていない場合にのみ存在し、抗生物質が投与されたバイオフィルムからは回収されませんでした。メロペネムはカンジダに直接的な影響を与えないことが、ラボで実施されたC. albicans単一培養のMICアッセイ（メロペネムのMIC値は>256 µg/mL）で示されているため、共存する他の菌種であるS. aureusおよびP. aeruginosaの抗生物質曝露に対する細菌ストレス応答が、真菌にとって過酷な環境をもたらしたと考えられます。

P. aeruginosa のバイオフィルムは、単独培養および共存病原体との共培養のいずれにおいても、256 µg/mLまでのメロペネム濃度で生存細胞回収率に減少が見られないことから、臨床におけるこのような慢性感染症に対処するためには、抗病原性療法などの代替治療法の必要性が浮き彫りになります。これらの治療法は、抗菌薬と併用することで細菌負荷を効果的に減少させることができる可能性があります。

P. aeruginosa PAO1単一種バイオフィルムにおけるalgD の発現
SCFM2で培養し、異なる濃度のメロペネム（1, 16, および 256 µg/mL）に曝露したP. aeruginosa PAO1におけるalgD の発現を、SYBR-Green RT-qPCRを用いて評価した。その後、16S をコントロール遺伝子として用い、2-ΔΔCt法により発現解析を行った（図3）。algD の発現は、使用したメロペネムの濃度間で有意な差は見られず、単一種バイオフィルムとして増殖した場合、PAO1のalgD 発現はメロペネムの存在によって大きく影響されないことが示唆された。

P. aeruginosa PAO1多種生物バイオフィルムにおける algD の発現
共生生物の存在がPAO1におけるalgD の発現やメロペネムへの反応に影響を与えるかを確認するため、S. aureus SH100およびC. albicans CAF2.1からなるバイオフィルム中で増殖させたP. aeruginosa PAO1においてもalgD の発現を評価した。メロペネム曝露濃度0-16 µg/mLの間では、algD の発現に有意な差は見られなかった。しかし、256 µg/mLでは、他の抗生物質濃度と比較してalgD の発現が有意に高く（0 µg/mL対256 µg/mL p = 0.0075、1 µg/mL対256 µg/mL p = 0.035、16 µg/mL対256 µg/mL p = 0.0048）、対照条件よりも約7倍高かった（Figure 4）。このことは、S. aureus およびC. albicans の存在下で増殖させた場合、P. aeruginosa 単独で増殖させた場合と比較して、最高濃度のメロペネムにおいてalgD の発現が増加することを強調しており、多種微生物環境においてアルギン酸産生が増加することが示唆される。単一種および多種生物バイオフィルム間でalgD の発現に差があることは示されたが、この発現増加が特定の種（S. aureus またはC. albicans) の存在によって引き起こされたものか、あるいは両微生物が関与する相互作用によってこの遺伝子発現の変化が引き起こされたものかは不明である。

これらの結果は、治療法や環境が遺伝子発現に及ぼす影響を理解することの重要性を強調しており、特に将来的な毒性標的治療法の試験において重要となります。

P. aeruginosa、S. aureus、およびC. albicansにおける濃度に対する細菌増殖抑制の棒グラフ。
図1～からなる単一菌種バイオフィルム Pseudomonas aeruginosa PAO1バイオフィルムをSCFM2中で24時間培養し、以下で処理した。 50 µg/mL DNase Iで1時間処理した後、さまざまな濃度のメロペネムでさらに24時間処理した。A平均対数10CFU/mL。点線は、2 logの減少（99 %の減少に相当）を示している。 P. aeruginosa 陰性対照からの回収率（B）相対蛍光単位の減少率。点線は蛍光の50%減少を示しており、この線を超える最初の点（値）をMIC50値とみなす。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

グラフにおけるメロペネム濃度に対する細菌の増殖 (A) および蛍光減少 (B)。
図2～からなる多種バイオフィルム 緑膿菌 PAO1, 黄色ブドウ球菌 SH1000、および カンジダ・アルビカンス CAF2.1バイオフィルムをSCFM2で24時間培養し、以下で処理した。 50 µg/mL DNase Iで1時間処理し、さらにさまざまな濃度のメロペネムで24時間処理した。点線は、～における2 log減少（99%減少に相当）を示す。 *P. aeruginosa* 陰性対照からの回復率。有意性は二元配置分散分析（two-way ANOVA）によって判定し、**** p < 0.0001. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

相対発現量 vs 濃度 (µg/ml) の棒グラフ。統計解析結果 (ns) を示す。
図 3: P. aeruginosa PAO1 の単一種から抽出された algD の発現。 バイオフィルムを SCFM2 中で 24 h 培養し、50 µg/mL の DNase I で 1 h 処理した後、さまざまな濃度のメロペネム (0, 1, 16, 256 µg/mL) に曝露させた。遺伝子発現は 2-ΔΔCt 法を用いて解析した。解析にはハウスキーピング遺伝子 16S を使用した。有意性は Tukey の多重比較検定により決定した。この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

相対発現量対濃度の棒グラフ、統計的有意差、遺伝子発現解析。
図4: ～の発現 algD ～からなる多種バイオフィルムから抽出された 緑膿菌 (*P. aeruginosa*) PAO1、 *S. aureus* SH1000、および *C. albicans* CAF2.1バイオフィルムをSCFM2で培養し、〜で処理した。 50 µg/mL DNase Iで1時間処理し、その後、さまざまな濃度（0、1、16、 256 µg/mL) でさらに24時間培養した。遺伝子発現は2-ΔΔCt法を用いて解析した。ハウスキーピング遺伝子 16S 解析に使用された。**p < Tukeyの多重比較検定により決定された0.01。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

cDNA反応あたりの容量（μL)
5X iScript रिएक्शनミックス4
iScript逆転写酵素1
DNase/RNaseフリー水14
2.5ng RNA1
全反応量 20

表1：cDNAマスターミックスの調製液。cDNA反応1回あたりに必要な成分および量。

遺伝子フォワードプライマーリバースプライマー
algDCGCCGAGATGATCAAGTACATGTAGTAGCGCGACAGGTTG
16SACCGCATACGTCCTACGGCGAAGACCTTCTTCACACACG

表 2：algD および 16S の正方向および逆方向 qPCR プライマー。

反応あたりの液量（µL)algD ワーキングボリューム（µL)16S 作動容量（µL)
GoTaq qPCR Master Mix (2X)1044040
フォワードプライマー1444
リバースプライマー1444
DNase/RNaseフリー水626424
合計 1879272

表3：qPCRマスターミックスの調製溶液。algDおよび16SqPCRマスターミックス溶液に必要な成分と量。

補足図 1：Pseudomonas aeruginosa LESB58、Staphylococcus aureus SH1000、およびCandida albicans CAF2.1からなる多種バイオフィルム。バイオフィルムをSCFM2中で24時間培養し（n = 3）、50 µg/mLのDNase Iで1時間処理した後、様々な濃度のメロペネムでさらに24時間処理した。点線は、陰性対照からのP. aeruginosa回収率における2-log減少（99%減少に相当）を示す。統計解析は二元配置分散分析（two-way ANOVA）により行った。*p=0.0242, ** p=0.0013, **** p <0.0001。こちらのリンクをクリックして図をダウンロードしてください。

ディスカッション

これらの結果は、CF患者の肺増悪の管理に頻繁に使用されるにもかかわらず、メロペネムが単一種または多種のバイオフィルムモデルで緑膿菌の増殖に有意な影響を与えなかったことを示しています。緑膿菌の回復率のわずかな増加は、128 μg/mL および 256 μg/mL のメロペネムで処理した後、両方のモデルで観察され、 黄色ブドウ球菌 多種バイオフィルム;しかし、これらの増加は重要ではありませんでした。メロペネムにさらされたときのC.アルビカンスの減少は、抗菌剤のストレスに反応して細菌によって作成される真菌にとって敵対的な条件が原因である可能性があります。緑膿菌を単一種のバイオフィルムとして増殖させた場合、メロペネム濃度間のalgD発現に有意差は観察されませんでした。しかし、256 μg/mL のメロペネムで処理した場合、algD 発現は多種バイオフィルムで有意に高く、これらの条件下でアルギン酸産生が増加する可能性があることを示唆しています。バイオフィルム組成とメロペネム濃度の間で観察される algD 発現の違いは、関連因子の存在が感染関連遺伝子発現にどのように影響するかを示しており、抗生物質の代替品を開発およびテストする際に抗菌薬の使用と多微生物感染の状態を考慮することの重要性を強調しています。

モデルの有用性にもかかわらず、アプリケーションを確実に成功させるにはいくつかの考慮事項があります。バイオフィルム内の黄色ブドウ球菌とアルビカンス菌の確立は、緑膿菌に感染する前に不可欠です。黄色ブドウ球菌とアルビカンス菌がグラム陰性に負けるリスクがあるためです。このバイオフィルムモデルでは、C. albicans 抗生物質がなくても、黄色ブドウ球菌や緑膿菌と比較して生存率が有意に低いため、貧弱なパートナーであるようです。これは、酵母が資源をめぐって競争に勝っているか、バイオフィルム内の種間相互作用によって悪影響を受けていることを示唆しています27,28。抗生物質に直接的な抗真菌活性がないにもかかわらず、メロペネムの存在下でのC.アルビカンスの欠如は、メロペネムに対する黄色ブドウ球菌のストレス反応が、C.アルビカンス29,30にとって住みにくい環境を作り出す可能性があるという考えを裏付けています。ただし、菌株の選択は、多微生物バイオフィルムモデルから回収できるC.アルビカンスの量に影響を与える可能性があることに注意することが重要です。PAO1の代わりに緑膿菌LESB58を使用すると、異なる傾向が観察されます(補足図1)。 LESB58では、C. albicansはすべての濃度のメロペネムで回復可能であり、抗菌剤の結果として緑膿菌の濃度が低下し、群集組成が変化するため、実際にはわずかな増加を示します。ただし、これらの違いにもかかわらず、PAO1は実験室の参照株であるため、このモデルでは使用されており、比較研究に一貫性があり、十分に特徴付けられたベースラインを提供します。この一貫性は、再現性とバイオフィルム内の相互作用について信頼できる結論を導き出すために非常に重要です。

SCFM2で増殖した細菌から大量のRNAを抽出することは、培地の粘性のため、困難な場合があります。したがって、RNA抽出前に0.2 mm針でバイオフィルムを破壊することは、RNA収量を高め、RT-qPCRに十分な濃度(≥10 ng / μL)を抽出するための重要なステップです。RNAは分解の影響を非常に受けやすい31ため、抽出後、RNAを使用するすべての下流活動が氷上で実行されるようにしてください。RNA、cDNA、およびqPCRプライマーを定期的に凍結融解すると、製品の劣化の可能性が高まる可能性があります。したがって、できるだけ制限する必要があります。これらのモデルの適用におけるもう一つの一般的な課題は、RNA抽出またはqPCRアッセイ中の汚染のリスクです。このリスクは、RNA抽出前にDNA分解溶液を装置に噴霧し、手順全体を通してDNase/RNaseフリーのピペットチップを使用することで最小限に抑えることができます。DNase/RNaseフリーの水を定期的に交換することも、qPCRアッセイ内の汚染のリスクを減らすのに役立ちます。

このプロトコルは、アルギン酸の産生におけるアルギン酸の必要性のために、algDに焦点を当てることを選択しました 緑膿菌 急性および慢性感染症の両方で32。したがって、アルギン酸は抗病原性治療薬の標的としてますます研究されています33,34。このモデルは algD の発現を評価するために使用されてきましたが、さまざまな抗病原性薬物標的に対する他の緑膿菌遺伝子の発現を評価するために適用できます。メロペネムは、特に緑膿菌が C. albicans35 の存在下で増殖する場合、抗生物質がアルギン酸生合成遺伝子の発現に影響を与えることを示唆する証拠により、この研究で利用されました。さらに、メロペネムは、緑膿菌呼吸器感染症の治療および管理のために臨床的に処方されることが多く、このモデル内でのその関連する使用を強調しています36。ただし、これらのモデルでは、さまざまな抗生物質の追加、または二重治療も可能です。このモデルに抗生物質を組み込むことで、このモデルを使用して、カルバペネムに対する緑膿菌によるポリン媒介耐性の発達など、細菌耐性メカニズムの進化的変化を研究することもできます37。この多微生物バイオフィルムモデルは、他の関連種、例えば、Rothia sp.およびStreptococcus sp.などの共生細菌を含むように適応させるか、またはAspergillus sp.などの他の感染原因微生物で置換して、試験中の医薬品候補の要件を反映することができる。

CF 肺を模倣する多微生物バイオフィルム モデルは以前に開発されています38。ここで説明するモデルは、少量の微生物培養に適したセットアップを使用してスループットを向上させることを目的として、以前の研究に基づいて構築されています。これは、利用可能な材料が限られている可能性がある新しい化合物をテストする場合に有利です。モデルは小規模で静的であるため、肺の微好気性環境をより厳密に反映するために、さまざまな酸素利用可能性でバイオフィルムを成長させることが可能です39,40。再現性の容易さと費用対効果の理由から、この研究で報告されたバイオフィルムは好気性的に成長しました。

この研究から得られた貴重な洞察にもかかわらず、いくつかの制限を認識する必要があります。第一に、宿主細胞が存在しないため、哺乳類の細胞を直接標的にする病原性因子の研究におけるその有用性が制限されます。これは、病原性因子の研究に適した in vitro モデルを確立する際の課題を概説し、慢性感染症の敵対的な環境を再現するモデルのさらなる開発の必要性を強調しています。さらに、病原性因子と見なされていますが、アルギン酸塩はバイオフィルムの重要な特徴であり、実験室と環境の両方で緑 膿菌 によって生成されます。抗バイオフィルム剤を研究するために in vitro モデルを使用することは、標的が真核細胞に直接作用する抗外毒素剤などの他の抗病原性療法を研究するためにモデルを使用するよりも難しくない可能性があります41。

PAO1の 緑膿菌 株の選択は、 in vitro モデルの再現性と標準化に適していますが、慢性感染からの分離株を含めることが望ましい場合があります。患者サンプルから単離された菌株でこのモデルを使用した将来の実験は、呼吸器ニッチに適応した菌株に対する抗菌剤の効果を観察するために実施される予定です。

この in vitro モデルで喀痰模倣物として SCFM2 を使用することで、抗生物質治療の過程で気道関連環境で培養された凝集バイオフィルムの行動変化を標準化および再現可能に観察できます。SCFM2 は、バイオフィルムの形成をサポートする重要な要素である細胞外 DNA (eDNA) とムチンが含まれているため、SCFM の元のバージョンよりも選択されました。ただし、p-アミノ安息香酸、NAD+、アデニン、グアニン、キサンチン、ヒポキサンチン42 を含む SCFM3 や、鉄欠乏バージョンである SCFM4 など、合成喀痰培地の他の変異体も利用可能であることに注意することが重要です。さらに、Ruhluelらによって開発された嚢胞性線維症肺培地(CFLM)や嚢胞性線維症副鼻腔培地(CFSM)などの合成喀痰培地の使用43は、気道の区画化を可能にし、さまざまな環境における多微生物バイオフィルムに対する抗病原性治療薬の挙動と効果を視覚化することができます。

AlgD はアルギン酸の生合成経路における重要な酵素ですが、その発現レベルだけでアルギン酸の生成の指標と見なすべきではありません。転写後および翻訳後修飾、および調節メカニズムなどの他の要因は、生成されるアルギン酸の量に影響を与え、バイオフィルム形成の減少、環境ストレスに対する感受性の増加、およびアルギン酸生成が減少する抗生物質感受性の増加につながる可能性があります12,14.アルギン酸タンパク質を標的とするいくつかの抗病原性治療薬が開発中であり、このモデルはそれらの有効性を決定するのに適切ではなく、アルギン酸産生または機能的読み出しを直接測定することがより有益である44。また、一部の抗病原性療法は、アルギン酸生合成または調節のさまざまな段階を標的とする場合があるため、アルギン酸産生を測定すると、病原性因子44に対する治療の正味の効果が直接把握されます。それにもかかわらず、現在の研究の抗病原性療法のいくつかは、主要なアルギン酸遺伝子を標的としており、このような遺伝子発現モデルは、そのような療法の効果を研究するのに適切です13,14。このような技術はハイスループットスクリーニングにも簡単に適応できるため、複数のサンプルや条件の迅速な評価が可能になり、潜在的な抗病原性化合物の初期スクリーニングを含む大規模研究に有益です。

全体として、単一種および複数種のバイオフィルムモデルは、CFに適した条件下で緑膿菌の感染関連遺伝子の発現を研究するための貴重なツールです。モジュレーター療法の大規模な展開は、CF ヘルスケアの状況に革命をもたらしました。しかし、CF モジュレーターの一連の臨床的利点にもかかわらず、研究ではシュードモナスのクローン系統が循環するまで続いていることが示されており、緑膿菌肺感染症を管理するための新しい治療法が依然として必要であることが強調されています45,46。議論された制限にもかかわらず、これらのモデルの適用は、CF肺ニッチ内の化合物の有効性と、この環境内での新規抗病原性化合物と既知の抗生物質との相互作用を評価するために、医薬品開発パイプラインの発見段階で有用である可能性があります。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

HL、DN、JFは、戦略研究センター(SRC)の助成金を受けました。嚢胞性線維症における抗菌治療薬の開発のためのエビデンスに基づく前臨床フレームワーク(PIPE-CF;課題番号SRC 022)を英国嚢胞性線維症トラストおよび米国嚢胞性線維症財団から発行しました。THは、MRC Discovery Medicine North Doctoral Training Partnershipの博士課程の学生制度によってサポートされています。私たちは、CFトラストとCF財団(SRC022)およびMRC DiMEN DTPスキームの資金提供に感謝します

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
マルチウェルプレート用の呼吸が簡単なシーリングメンブレン シグマ・アルドリッチ 
ブンゼンバーナー
セルラーゼ (100 mg/mL)Cambridge Bioscience HY-B2220-5g
CNサプリメント シグマ・アルドリッチ 1.07624
Direct-zol RNA Miniprep kitZymo ResearchR2050
Dnase I サーモフィッシャーサイエンティフィックEN0521
DNase / Rnaseフリー水VWRJ60610。
ゲンタマイシン硫酸塩(30 µg/mL)シグマ・アルドリッチ G3632
グリセロール (1%)Thermo Fisher Scientific15514029
GoTaq qPCR Master Mix プロメガ A6101
iScript Cdna 合成キット バイオ・ラッド1708890
ペニシリン (250 U/mL)Scientfic Laboratory SuppliesP3032-10MU
Qubit 4 FluorometerThermo Fisher ScientificQ33238
Qubit RNA BR Assay Kit Thermo Fisher ScientificQ10210
Qubit tubesThermo Fisher ScientificQ32856
Resazurin solution (0.02 %)Thermo Fisher ScientificR12204
RNAlater SolnInvitrogenAM7021
Streptomycin (250 µg/mL)シグマ・アルドリッチ S9137
サーマルサイクラー (T100 サーマルサイクラーを使用)Biorad1861096
TRIzol 試薬 Invitrogen15596026
バンコマイシン (3 & micro;g/mL)シグマ・アルドリッチ 
Z763624XC1709007

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