ここでは、代謝オリゴ糖工学、クリックケミストリー、および増殖顕微鏡法を組み合わせたシンプルなプロトコールを提案し、日常的な顕微鏡装置を使用して細胞内シアル化 N-糖タンパク質のバイオイメージングを分解能を向上させました。
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この記事について
サマリー
要約
メタボリックラベリング技術により、生体直交レポーターを糖鎖に組み込むことができ、クリックケミストリーや生体直交化学により、細胞内の分子色素の標的生体結合が可能になります。代謝オリゴ糖工学(MOE)は、分子認識を含む多数の生物学的プロセスにおけるグリコシル化の本質的な役割と、癌から遺伝性疾患、ウイルスおよび細菌感染に至るまでの病状への影響により、かなりの関心を集めています。
MOEは細胞表面の複合糖質の検出でよく知られていますが、生理学的および病理学的状況における細胞内糖鎖の研究においても非常に重要な方法論です。このような研究は、高い空間分解能から大きな恩恵を受けています。しかし、超解像顕微鏡はほとんどの研究室で容易に利用できず、日常的な導入に課題を提起しています。拡大顕微鏡は、蛍光マーカーで標識された生体試料を物理的に拡大することにより、顕微鏡の解像度を向上させる最近の代替手段です。サンプルを膨潤性ゲルに埋め込み、化学処理によって等方性に膨張させることにより、超解像技術を必要とせずに、細胞内構造をより高い精度と分解能で視覚化できます。
この研究では、MOEとクリックケミストリーを組み合わせて細胞内シアル化糖鎖を可視化する拡大顕微鏡の能力を示します。具体的には、共局在研究のための免疫蛍光法に関連する可能性のあるシアリル化を標的とするレポーターを用いた生体直交標識および拡大顕微鏡法の手順を提案します。このプロトコルにより、シアロコンジュゲート生合成、細胞内輸送、およびリサイクルのローカリゼーション研究が可能になります。
概要
蛍光顕微鏡は、細胞内の特定の分子の標識や可視化に広く使用されていますが、アッベの光の回折限界1によって本質的に分解能が制限されており、約200〜250nmより近い物体を区別する能力が制限されます。この制限は、光の波の性質と顕微鏡の対物レンズの開口数から生じ、細胞内構造をイメージングする際に課題をもたらします。これらの制限を克服することで、ナノメートルスケールでの特定の生物学的プロセスに関するより深い洞察が得られます。
光の回折限界を超えるために、STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)やSTED(Stimulated Emission Depletion)などの超解像顕微鏡技術が開発されました2,3。STORMは、蛍光色素の確率的活性化に依存しているため、任意の時点でスパースなサブセットのみをイメージングできます。これにより、個々の蛍光色素の正確な局在化が可能になり、高解像度の画像再構成が可能になります。一方、STEDは、デプレッションレーザーを用いて励起スポットの周辺部の蛍光を選択的に消光することで分解能を向上させ、点像分布関数を効果的に狭めます。
これらのアプローチは、すべての蛍光色素が同時に検出される広視野顕微鏡や共焦点顕微鏡法とは対照的であり、すべての回折パターンを組み合わせた画像が得られ、近くにある個々の蛍光色素の区別を防ぎ、解像度の低下につながります。しかし、これらの超解像法には、非常に特殊な光源、装置、サンプル調製、および/または蛍光色素が必要であるため、これらの技術は高価で、ほとんどの研究室でアクセスが困難であり、日常的な実験での実装が困難です。これらの制約により、科学界は、容易に利用できる顕微鏡装置や日常的な染色プロトコルと互換性がある、より高い分解能を達成するための代替ソリューションを探すようになりました。2015年、Boyden氏らは、サンプルを物理的に拡張することで光学顕微鏡の限界を回避する方法、Expansion Microscopy(ExM)4を開発しました。
ExMは、光の回折限界を超えることなく、生体試料のナノスケールの詳細を提供する3段階の手法です(図1)。代わりに、従来の回折限界顕微鏡を使用して、等方性的に物理的に拡大されたサンプルを画像化します。ゲル化と呼ばれる最初のステップは、アクリル酸ナトリウムとアクリルアミドをベースにした膨潤性高分子電解質ヒドロゲルに、生体サンプル(通常は固定された細胞または組織)を埋め込むことです。その後、生体サンプルは酵素処理を受けて、タンパク質や膜などの特定の成分を部分的に分解し、高密度の細胞構造を分解して細胞が均一に増殖できるようにします。分解と呼ばれるこのステップは、機械的特性に関してサンプルの構造成分を均質化することでこれを達成し、サンプルの歪みにつながる可能性のある膨張差を防ぎます。最後に、拡張と呼ばれる最後のステップでは、ハイドロゲルを包埋して分解したサンプルを脱イオン水に入れ、膨潤させます。この技術により、サンプルはすべての次元で約4〜5倍の線形倍率で拡大し、標準的な顕微鏡技術を使用して細胞の微細な詳細を視覚化することができます。膨張の等方性を考えると、ゲルマトリックス内で拡大された生物学的サンプルは、その3次元の幾何学的詳細と、そのさまざまな構造成分間の空間的関係を保持します。したがって、空間情報は膨潤しても保持されますが、ゲルアンカーされた蛍光標識または生体分子との間の距離は、すべての方向に均一に増加します。これにより、信号の分離が向上し、分解能が向上します。
図1:ExMプロトコルの概要(a)ゲル化:生体サンプルは、膨潤性高分子電解質ハイドロゲル内に固定され、埋め込まれています。(b)消化:サンプルの機械的特性は、酵素と界面活性剤を使用して均質化され、そうでなければ膨張を制限し、歪みを引き起こすタンパク質と脂質膜を分解します。(c)膨張:ヒドロゲルを脱イオン水に浸し、等方性に膨張させます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2015年以降、ExMは空間情報の保存において大幅な技術的改善が見られました。特に、様々な分子アンカーは、膨潤性ヒドロゲル5,6に直接生体分子を共有結合的に結合するように設計されている。このプロトコールでは、生体分子の遊離アミン基(通常はリジン残基またはタンパク質のN末端位置)と反応するN-アクリルオキシスクシンイミド(NAS)を使用して、アクリロイル基を糖タンパク質を含む細胞のタンパク質に生体結合しました。このアクリロイル基は、ゲル化中に架橋反応を通じて他のモノマーと反応し、これらの生体分子を直接ポリマーに固定します。
ExMは、メタボリックオリゴ糖工学(MOE)を含む幅広い標識法に対応しています。MOEは、生体直交的なケミカルハンドル7を備えた代謝前駆体の類似体を組み込むことにより、糖鎖の標識を可能にする強力なツールです。これらの類似体は化学レポーターとして知られており、毒性を引き起こすことなく代謝経路に組み込まれます。MOEアプローチでは、レポーター単糖類が代謝的に活性化ヌクレオチド糖に加工され、その後、新生複合糖質に移行します。私たちの主な焦点は、シアリル化の研究、特に細胞間相互作用、免疫調節、および発生における役割のために健康と疾患の文脈で重要なシアリル化N-糖タンパク質の細胞内動態と輸送の研究です。異常なシアリル化は、がん8,9,10,11、感染症12、遺伝性疾患13,14,15などの疾患に関与しており、治療法の開発やバイオマーカーの発見における重要な標的となっています。シアリル化を理解することで、糖鎖生物学や疾患のメカニズムに関する洞察を深めることができます。
シアル化は、ヒトに最も多く存在するシアル酸であるN-アセチルノイラミン酸(Neu5Ac)の類似体、またはNeu5Acの代謝前駆体であるN-アセチルマンノサミン(ManNAc)の類似体を用いてMOEを用いて調べることができる8,16。ManNAcはサイトゾルでNeu5Acに変換され、核内でシチジン-5′-モノホスホ-N-ノイラミン酸(CMP-Neu5Ac)に活性化されます。ゴルジ体装置内のシアリルトランスフェラーゼは、ヌクレオチド糖に活性化されると、Neu5Ac単位を成長中の糖鎖の末端位置に移動します(図2)。不自然なManNAc誘導体が代謝的に取り込まれた後、タグ付けされたシアル化糖鎖は、生体直交的なクリックケミストリーを通じて、レポーターハンドルに相補的な反応性基を持つフルオロフォアに共有結合することができます。これにより、in vivoまたはex vivoで複合糖質を直接観察することができます。
ほとんどの単糖レポーターにとって、受動的拡散を介して原形質膜を通過するには、過アセチル化型が必要です。しかし、過アセチル化されたレポーターと保護されていないレポーターの両方が、シアル化を効率的にプローブすることが示されています16。無防備なシアル化レポーターは、Neu5Ac類似体のピノサイトーシスとManNAcのまだ同定されていないトランスポーターという能動的な輸送メカニズムによって細胞に侵入することができます。保護されていない糖は、同等の効果を得るためにより高い濃度(通常は100〜500μM)を必要としますが、細胞内に入れば、シアル酸代謝経路に直接侵入することができます。対照的に、ペルアセチル化糖は、代謝活性になる前に、細胞内の非特異的エステラーゼによって完全に脱アセチル化する必要があります。低濃度(通常は10〜50 μM)で使用できますが、不完全な脱アセチル化は酵素活性を妨げたり、部分的にアセチル化されたシアル酸類似体が組み込まれたりして、下流の分析に支障をきたす可能性があります。さらに、酢酸の放出は局所的にpHに影響を与え、細胞機能に影響を与える可能性があります。また、Chenらは、Per-O-アセチル化糖が非酵素的メカニズムを介してタンパク質中の遊離システイン残基と反応し、オフターゲット取り込みと非特異的シグナルの増加につながることを実証しました17,18。したがって、現在のプロトコルでは、保護されていないManNAcレポーターを雇用しています。
図2:代謝性オリゴ糖のエンジニアリングとシアル酸の標識。 UDP-GlcNAcは、サイトゾルのGNE/MNKのUDP-GlcNAc 2-エピメラーゼドメインによってManNAcに変換されます。その後、ManNAcは、GNE/MNKのManNAc 6-キナーゼドメインによってサイトゾル内でリン酸化され、ManNAc-6-リン酸を形成します。 N-アセチルノイラミン酸シンターゼは、ManNAc-6-Pとホスホエノールピルビン酸との縮合を触媒してNeu5Ac-9-リン酸を生成し、その後、シアル酸ホスファターゼによって脱リン酸化されてNeu5Acを生成します。Neu5Acは、エンドサイトーシスおよびリソソームリサイクル8を介してサルベージ経路によっても供給される。核に輸送された後、CMP-シアル酸合成酵素によってCMP-Neu5Acに変換されます。ゴルジ体では、CMP-NeuAcは、成熟した複合糖質上の糖鎖の末端位置にNeu5Ac部分を導入するシアリルトランスフェラーゼの基質であり、最終的に細胞膜で発現または分泌されます。生体直交ハンドルを持つManNAzケミカルレポーターは、未確認の活性トランスポーターを介して細胞に侵入し、代謝経路に入ることができます。生合成後に糖鎖に取り込まれた標識Neu5Azユニットは、CuAACを介した蛍光プローブの標識によって標識されます。略語:NAc = N-アセチル;UDP-GlcNAc =ウリジン二リン酸 N-アセチルグルコサミン;ManNAc = N-アセチルマンノサミン;GNE = UDP-GlcNAc 2-エピメラーゼ;MNK = ManNAc 6-キナーゼ;ManNAc-6-P = ManNAc-6-リン酸;NANS = N-アセチルノイラミン酸合成酵素;PEP =ホスホエノールピルビン酸;Neu5Ac = N-アセチルノイラミン酸;Neu5Ac-9-P = Neu5Ac-9-リン酸;NANP = シアル酸ホスファターゼ;CMP =シチジン-5'-一リン酸;CMAS = CMP-シアル酸シンテターゼ;ST=シアル酸転移酵素;ManNAz = N-アジドアセチルマンノサミン;Neu5Az = N-アジドアセチルノイラミン酸。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
可能な生体直交反応の中で、銅触媒アジド-アルキン環化付加反応(CuAAC)16,19に関心を集中させました。私たちの経験によると、CuAACは固定細胞の細胞内糖鎖を標識するための最良の選択肢です。この反応は十分に確立されており、生体直交化学で徹底的に研究されており、複雑な生物学的環境で使用するために標準化されており、知識の強固な基盤と最適化されたプロトコルを提供しています。その高速反応速度は、確かに高い反応効率と特異性を提供し、合成が容易で安定で、生体系に存在せず、天然の生体分子に対して不活性なアジド基とアルキン基を含んでいるため、銅の毒性が問題にならない固定細胞アプリケーションに最適です。株促進アルキン-アジド環化付加(SPAAC)20,21は、銅の毒性を回避しながら、速度論が遅く、プローブがかさばるため、疎水性トラップによる細胞内アプリケーションのバックグラウンドシグナルが高くなり、信号対雑音比が低下する傾向があるのに対し、逆電子要求量ディールス・アルダー(IEDDA)22,23は高速で銅フリーですが、より複雑なプローブ合成を伴い、MOEアプリケーションではまだ完全に特性評価されていないかさばるレポーターグループが必要です。ExMは固定細胞のみを必要とするため、CuAACは生体直交標識のための堅牢で効率的なソリューションを提供します。
この論文では、代謝標識、生体直交クリックケミストリー、および拡大顕微鏡法を組み合わせて、細胞内の細胞内シアル化糖タンパク質を可視化するためのプロトコルを提示します。本論文で述べる実験手順では、化学レポーターとして N-アジドアセチルマンノサミン(ManNAz)を利用し、膨張手順に先立って低分子有機フルオロフォアのCuAACライゲーションを行います。糖タンパク質は、ゲル化、消化、および増殖の前にNASでハイドロゲルに固定されます。シアル酸のMOE標識は、 シスゴルジ体に局在するマウス抗GM130一次抗体に例示されるように、共局在評価のための免疫蛍光法と関連付けることができます。このプロトコールは、生理学的状態の細胞、または化学処理を受けた細胞に適用することができます。これを説明するために、クロロキンを使用して、細胞内の糖タンパク質の処理と輸送に影響を与えるリソソーム機能を阻害しました。核染色は、細胞の局在化だけでなく、ExMプロセスの品質を示す指標としても、ランドマークとして使用されます。膨張係数は、膨張前(preExM)と膨張後(postExM)の原子核のサイズを比較することで、実際に測定できます。
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プロトコル
1. 細胞播種
注:次のステップは、層流フードの下の無菌条件下で実行します。この方法は、本研究で使用された細胞株(HeLa、MCF7、初代線維芽細胞)のいずれか、または研究で一般的に使用されるほとんどの接着性細胞株モデルに適用できる20,24,25。
- T75フラスコに10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したDMEM高グルコース培地で、5%CO2 雰囲気下で37°Cで細胞を増殖させます。
- 細胞が完全にコンフルエントになったら、細胞培養培地を取り出し、4mLのPBSで細胞を洗浄します。
注:このステップおよびその後のすべての洗浄ステップで使用されるPBS溶液は、使用前に0.2μmPTFEメンブレンによるろ過により滅菌する必要があります。 - 0.5 g/Lのトリプシンを含む1x トリプシン-EDTA溶液2 mLで、細胞を37°Cで5分間インキュベートし、フラスコの底から細胞を放出します。
- 10% FBSを含むDMEM高グルコース培地8mLを加え、十分に混合して、すべての細胞がフラスコの底から剥離していることを確認します。
- 細胞を15mLのコニカルチューブに移し、200 × gで5分間遠心分離します。それまでの間、12ウェルプレートの各ウェルにカバーガラス(直径12 mm、厚さ130-160 μm)を1枚追加します。
注:カバーガラスの厚さは、後続のイメージングステップで使用する顕微鏡の要件に合わせて調整する必要があります。 - 遠心分離後に上清を除去し、ペレットを1 mLの細胞培養培地に再懸濁します。
- 少なくとも2つの測定値にわたる血球計算法により、平均細胞数/mLを決定します。
- 細胞懸濁液を細胞培養培地で1mLあたり300,000細胞の濃度に希釈し、懸濁液1 mLを各ウェルに播種します。
- 次のステップに進む前に、5%CO2
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結果
以下に示すのは、HeLa細胞(図3A)およびMCF7細胞(図3B)のシアル化糖タンパク質を可視化するためのプロトコールの適用であり、CQ処理(プロトコールセクション2)および免疫蛍光共局在染色(プロトコールステップ5.3)を省略しています。
図3:ExMプロトコール前(左)と後(右)のシアル化標識パターンの比較。 (A)Hela細胞および(B)MCF7細胞を500 μM ManNAzで24時間インキュベートしました。標識は、CuAACを介してAlexa...
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ディスカッション
現在のCuAAC標識プロトコルは、反応緩衝液にアミノグアニジンを含んでいません。細胞内複合糖質の可視化を目的としているため、代謝取り込みステップ後に固定された細胞に対して行われ、細胞毒性の問題を回避し、触媒系の取り込みを改善します。アミノグアニジンの使用は、通常、生細胞の細胞表面標識に推奨され、デヒドロアスコルビン酸とタンパク質のアルギニン、ヒスチジン、およびリジン残基との間の副反応を防ぐためである28。これらの修飾は、実際にタンパク質の機能に影響を及ぼし、摂動や細胞毒性を引き起こす可能性があります。CuAAC反応バッファーのもう一つの重要な考慮事項は、BTTAAによる銅イオンの錯体化は迅速ですが、即時ではないということです。修飾糖の効率的な標識を確実にするために、標識プロセスを開始する少なくとも30分前に溶液を調製し、初心者ユーザーによる結果の再現性を確保することをお勧めします。
取得には、任意の共焦点顕微鏡を使用できます。サンプルが拡大すると、観測可能なフィールドも拡大します。セル全体をキャプチャするには、画像間のオーバーラップが...
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開示事項
著者には、競合する金銭的利益やその他の利益相反はありません。
謝辞
この作業の達成に役立つ技術環境を提供してくれたTisBioの施設とPLBSプラットフォームに感謝します。この研究は、CNRSとMinistère de l'Enseignement Supérieur et de la Rechercheからの助成金によって支援されました。François Foulquier博士、Zoé Durin博士、Dorothée Vicogne夫人、Céline Schulz夫人には、議論を刺激し、Fibroblast 533T細胞株と一次抗体GM130を提供してくださったことに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| (+) L-アスコルビン酸ナトリウム | Sigma Aldrich | 11140 | |
| 12ウェル細胞培養プレート | Corning | 3513 | |
| アクリルアミド | Sigma Aldrich | A8887 | |
| アクリル酸 N-ヒドロキシスクシンイミドエステル | シグマ アルドリッチ | A8060 | |
| アレクサ フルーア 488 アルキン | イエナバイオサイエンス | CLK-1277-5 | |
| アレクサフルオア546ヤギ抗マウスIgG | Invitrogen | A11003 | |
| 硫酸アモニウム | シグマアルドリッチ | 9913 | |
| ビスアクリルアミド | シグマアルドリッチ | 146072 | |
| BSA | シグマアルドリッチ | A7906 | |
| BTTAA | イエナバイオサイエンス | CLK-067-100 | |
| 遠心分離チューブ 2 mL | エッペンドルフ | 30120094 | |
| クロロキン二リン酸塩 | シグマ アルドリッチ | C6628 | |
| コニカルチューブ 15 mL | ファルコン | 352097 | |
| カバー スリップ 12 mm #1 エ | プレディア | CB00120RA120MNZ0 | |
| カバー スリップ 32 mm #1 | エプレディア | CB00320RA140MNZ0 | |
| CuSO4 | シグマ アルドリッチ | 209198 | |
| DMEM 高グルコース培地 | ダッ | チャーL0104-500 | |
| ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(PBS) | Dutscher | L0615-500 | |
| ウシ胎児血清 | バイオウエスト | S1810-500 | |
| 線維芽細胞 533T | - | - | 健康な個人から収集 |
| FIJI ImageJ 2.9.0 | - | - | |
| ゼラチン | バイオ-RAD | 170-6537 | |
| グアニジン HCl | シグマ アルドリッチ | 50950 | |
| HeLa細胞 | ATCC | CCL-2 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
| Imaris 10.2 | - | - | |
| K2HPO4 | Euromedex | PB0447-B | 無水 |
| LSM 780 共焦点顕微鏡 | Zeiss-MCF7 | ||
| ATCC | HTB-22 | ||
| N-アセチルマンノサミン (ManNAc) | BIOSYNTH | MA05269 | |
| NaCl | Carlo Erba | 479687 | |
| N-アジドアセチルマンノサミン (ManNAz) | BIOSYNTH | MA46002 | |
| Objectif "Plan-Apochromat" 63x/1,4 Oil DIC M27 | Zeiss | 420782-9900-799 | |
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS)10x | Euromedex | ET330 | |
| プロテイナーゼK | シグマアルドリッチ | P2308 | from Tritirachiumアルバム |
| 精製マウスGM130抗体 | BDバイオサイエンス | 610822 | 50µg |
| アクリル酸ナトリウム | シグマ アルドリッチ | 408220 | |
| T75 フラスコ | コーニング | 430641 | |
| TEMED | シグマ アルドリッチ | T9281 | |
| トリス アセテート EDTA (TAE) 10x | Euromedex | EU0202-B | |
| トリトン X-100 | シグマ アルドリッチ | X-100 | |
| トリパン ブルー | ダッチャー | 702630 | |
| トリプシン-EDTA 1x | ダッチャー | L0930-100 |
参考文献
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