ここでは、成虫の ショウジョウバエ の眼の高解像度イメージングのための迅速で低コストのワークフローを紹介し、パターン化と成長欠陥を定量化します。ポイントマウント、高解像度画像取得、および画像分析によるサンプル調製のプロトコルについて説明します。
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この記事について
サマリー
要約
ショウジョウバエの複眼は、形態形成を促進する分子メカニズムと生物学的プロセスを明らかにした、正確にパターン化された組織です。これは、オマチディアと呼ばれる反復単位の目の単純な構造であり、遺伝的相互作用と遺伝子機能を特徴付けるために使用されます。目の構造に影響を与える突然変異は、簡単に検出および分析できます。したがって、このシステムは、リソースが不足している機関で頻繁に使用されます。さらなる表現型解析には、定量解析に適した高倍率画像を生成するための走査型電子顕微鏡(SEM)が含まれることがよくあります。しかし、SEMは高価であり、高価な試薬が必要です。サンプル調製は数日に及びます。また、多くの場合、サンプル調製や機器のメンテナンスのためにフルタイムのスタッフが必要です。これは、リソースが不足している機関や予算の緊縮財政中にそれらの有用性を制限します。昆虫学では、高解像度のデジタルイメージング技術の使用は、種の同定と特性評価のための一般的な方法です。この論文では、戦略を組み合わせて、成虫のショウジョウバエの構造の高解像度デジタルイメージングと、オープンソフトウェアのImageJを使用した定量分析を可能にする方法について説明します。このワークフローは、定量的表現型分析への費用対効果の高い迅速なアプローチにより、資金不足やリソース不足の研究施設の制限を解消する、迅速で学生に優しい代替手段です。
概要
ショウジョウバエ・メラノガスターは、分子シグナル伝達経路や細胞の挙動を解明するために何十年にもわたって使用されてきた強力な遺伝モデル生物です。多細胞発生に不可欠な進化的に保存されたシグナル伝達経路の多くが、ショウジョウバエで初めて同定され、その作用機序が定義された。ヒトの疾患関連遺伝子の約65-75%がショウジョウバエ1,2にオルソログを持っています。成体のショウジョウバエの眼は、がん3,4、神経変性5、代謝障害6などのヒト疾患に関与する重要な保存遺伝子の発見を促進する偏りのない遺伝的スクリーニングを可能にした重要なモデルです。
ショウジョウバエの眼は、オマチディアと呼ばれる~800単位の眼で構成され、これらは成虫の眼7の表面を横切る六角形のパターンで正確に配列されています。各オマチジウムは、非対称の台形内の異なる位置を占める8つの視細胞ニューロンで構成されています。これらは、4つの非神経錐体細胞と2つの一次色素細....
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プロトコル
1.成虫の ショウジョウバエ の収集と固定
- ショウジョウバエのクロスを設定するか、菌株を選択してフライフードの入ったバイアルに入れます。バエが成長し、成虫が閉じるまで(25°Cで~10~14日)、所望の温度(通常は25°C)でバイアルをインキュベートします。
- ハエをCO2 で麻酔し、CO2 パッドの上に置きます。
- 羽でハエを選別し、目的の表現型(例:まっすぐな翼)を持つ個体を選択します。1 mLの血清ピペットの先細りの端に収まるようにガチョウの羽をトリミングして、フェザーフライソーターを作成します。
- 1.7 mLの微量遠心チューブに1 mLの70%エタノールを調製します。選択したハエを微量遠心チューブに入れ、氷の上に置きます。微量遠心チューブは4°Cで一晩保管してください(図2A)。
注:ハエをエタノールで24時間以上保存しないでください。70%エタノールでハエを長期間保存すると、目と体の色素が失われます。
2. ポイントマウントによるサンプル調製
注: ショウジョウバエ は柔らかい体の昆虫で、風乾す....
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結果
ショウジョウバエの目は、組織のパターン形成、成長制御、および細胞死を研究するための優れたモデルシステムです。私たちは最近、細胞内pH(pHi)が組織の成長にどのように影響するかを調査した研究を発表しました。まず、発育中の眼におけるナトリウム-プロトン交換体DNhe2(哺乳類NHE1のオルソログ)の過剰発現がパターニング欠陥と増殖の増加を引き起こす遺伝システムを確立した16。pHiが高いほど増殖の増加は、酵母から哺乳類まで、種全体で観察されます17。しかし、pHiが増加すると、大人の目は対照と比較して小さく見えることも観察されました。
成人の眼領域の定量分析を行い、 DNhe2 発現の上昇が ショウジョウバエ の眼の組織サイズをどのように減少させるかを決定しました。まず、眼球インサート顕微鏡(図5A)を用いて低解像度の画像を取得しましたが、定量的な測定を行うに.......
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ディスカッション
ここでは、成虫の ショウジョウバエ の構造のサンプル調製、高解像度イメージング、および分析の方法について説明します。 ショウジョウバエ の眼は、がん19、神経変性20 、代謝性疾患21などの疾患の根底にある分子メカニズムに重要な洞察をもたらした遺伝的に扱いやすいモデルシステムです。特に、がん患者の「アバター」が生成され、発がん性変異を有するトランスジェニック ショウジョウバエ が生成され、ハイスループットの薬物スクリーニングに使用できる22。私たちは大人の目に焦点を当てていますが、このプロトコルは、翼、脚、胸部、腹部などの他の関心のある構造を分析するために適応させることができます。
細かい運動能力は、このプロトコルのいくつかの重要なステップで必要です。ポイントマウントによる.......
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開示事項
著者には、開示すべき利益相反はありません。
謝辞
著者は、議論とサポートを提供してくれたGrillo-Hill pHlyラボのメンバーに感謝します。Tim Andriese、Randy Kirschner、Kitty (Ngoc-Huong) Nguyen、Marco Parent、Jonny Shaloub、Librado Veliz の優れた技術サポートに感謝します。この研究は、NIH SC3GM132049 and 1R16GM153640 awards (BKGH)、CSU Biotechnology Faculty-Student Research Award (LM and BKGH)、サンノゼ州立大学 (FJL) の理学部と生物科学部からのスタートアップ資金の支援を受けました。特に、このプロセスにおけるベルント・ベッカーの機知と支援には特筆すべき点があります。BioIcons(https://bioicons.com/)コミュニティに感謝します。特に、ピペットアイコンのServiere、図1と図2で使用されているショウジョウバエ、鉗子、卓上電子顕微鏡アイコンのDBCLSは、CC-BY 4.0 Unportedの下でライセンスされています。また、SciDraw(https://scidraw.io/)コミュニティ、特にクリエイティブ・コモンズ4.0ライセンス(CC-BY)の下でライセンスされているディオゴ・ロッシュ・....
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1 mL 血清学的ピペット | ThermoFisher Scientific | 170353N | |
| 1.7 mL 微量遠心チューブ | Genesee Scientific | 24-282LR | |
| 20x APO顕微鏡対物レンズ | ミツトヨ(株) | 378-804-3 | |
| アーカイブ 65 ポンド厚紙 | ニーナ株式会社 | 91901 | |
| Canon EF 70-200 mm USM II 望遠レンズ | Canon | 3044C002 | |
| Canon EOS 6D Mark II DSLR カメラ本体 | Canon | 1897C002 | |
| ディフューザードーム | 巨視的ソリューション | PA-DIF-GIM-SM | |
| ミツトヨ M プラン用 ディフューザー APO 対物 | マクロスコープ ソリューション | ミツトヨディフューザー | |
| ショウジョウバエバイアルとプラグジェ | ネシーサイエンティフィック | 32-117BF | |
| デュモン #5 細い先端の鉗子 | フィッシャー サイエンティフィック | NC9889584 | |
| ガチョウの羽 | アマゾン | B01CMMJI6U | |
| ヘビーデューティ 陽極酸化アルミニウム三脚 | Really Right Stuff, LLC | TFA-32G | |
| キムワイプ | フィッシャー サイエンティフィック | 06-666A | 糸くずの出ない実験用ティッシュ |
| レーベンハック M1000 Plus デジタルカメラ | Levenhuk | 70358 | |
| No. 3 取り付けピン | Indigo Instruments | 33414-3 | |
| Nutri-Fly Bloomington Drosophila media | Genesee Scientific | 66-113 | フライフード |
| ポイントパンチ | MCミースマニュファクチャリング株式会社 | 448Detail | |
| スクリューノブクランプ | Really Right Stuff, LLC | SK-Clamp | マクロレールを三脚に取り付けるため |
| Stackshot Controller and Macro Rail | Cognisys Inc. | ||
| 圧リングアダプタ | RAFカメラ | 763461174207 | の対物レンズをカメラレンズに接続するためのレンズアダプター |
| Titebond Glue | Franklin International | 5013 | |
| Yongnuo YN-24-EX Macro Twin Lite Flash | Shenzhen Yongnuo Photographic Equipment Co. | YN-24EX | |
| ソフトウェア | |||
| Canon EOS Utility (v. 3.16.1). | キヤノン | の買収ソフトウェア | |
| FIJI | National Institutes of Health | Fijiは、GNU General Public Licenseの下でオープンソースとしてリリースされています。 FIJIバージョン2.14.0/1.54f | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Boston, Massachusetts USA | Prism Version 10.3.1 | |
| Zerene Stacker (v.1.04) | Zerene Systems, LLC | Focus Stacking Software |
参考文献
- Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
- Hodgson, J. A., Parvy, J. -P., Yu, Y., Vi....
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再版と許可
