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方法論記事

2本ボトル選択、ホームケージ飲酒、および微細構造解析を使用したげっ歯類のアルコール消費量のモデリング

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DOI:

10.3791/67486

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2024年11月8日

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1Center for Alcohol Research in Epigenetics, Department of Psychiatry, University of Illinois Chicago

この記事について

サマリー

このプロトコルは、ラットのアルコール消費をモデル化するための標準的な断続的なアクセスの2ボトル選択家庭用ケージ飲用パラダイムを説明しています。さらに、飲酒行動の微細構造分析を可能にするDIYリック検出システムで標準プロトコルを補強するためのステップバイステップの指示を提供します。

要約

2本選択の家庭用ケージの飲酒は、げっ歯類のエタノール消費を研究するために最も広く使用されているパラダイムの1つです。最も単純な形では、動物は2本のボトルを利用でき、1本には通常の水道水が入っており、もう1本にはエタノールが入っており、1日の摂取量は24時間のボトル重量の変化によって測定されます。したがって、このアプローチには特別な実験装置は必要ありません。このような実装の容易さは、前臨床アルコール研究者による広範な採用に最も貢献していると思われますが、このアプローチを使用して取得された飲酒データの解像度は、研究者がボトルの重量を測定する回数(たとえば、1日1回)によって制限されます。しかし、全体的な摂取量、薬理学的介入、およびニューロン操作の文脈で飲酒パターンを調べたいという願望が、個々のリックのレベルでデータを取得できるホームケージリック検出システムの開発を促しました。近年では多くの開発が進んでいますが、オープンソースのLIQ HD(Lick Instance Quantifier Home Cage Device)は、その手頃な価格と使いやすさから、この分野で大きな注目を集めています。このシステムはエキサイティングですが、マウスで使用するように設計されています。ここでは、標準およびリコメーターを装備した2本入りの家庭用ケージの飲用に適した手順を確認します。また、LIQ HDシステムをラットに適応させる方法として、より大きなケージサイズに対応するためのハードウェアの変更や、標準的な既製の飲料ボトルと互換性のある再設計された3Dプリントボトルホルダーなどを紹介しています。このアプローチを使用すると、研究者は、多くのラットの摂取量に加えて、毎日の飲酒パターンを並行して調べることができるため、追加のリソースへの投資を最小限に抑えて、取得したデータの解像度を高めることができます。これらの方法により、研究者は、正確な実験ニーズに応じて、標準的なボトルまたはリコメーターを備えた装置を使用して、アルコール飲酒の根底にある神経生物学的メカニズムを調査する柔軟性を得ることができます。

概要

適度なアルコール摂取は歴史的に中程度の健康上の利点と関連していましたが、最近の大規模な包括的な研究により、アルコール摂取量は安全ではないことが明らかになりました1,2.実際、アルコールの使用は、世界的に死亡と障害の7番目に多い危険因子です1 少量のアルコールを飲む個人は、癌、感染症、および怪我のリスクが高くなります1,3.米国では、2016年から2021年の間にアルコール使用による死亡が約30%増加しました4。重要なのは、死亡や障害のリスクは、消費の増加とともに単調に増加することです1.

ヒトでの研究は、アルコールの使用と誤用の神経生物学に関する貴重な洞察を提供してきましたが、動物モデルによる実験的制御は、飲酒行動の根底にあるメカニズムと大量飲酒のリスクを深く理解するために重要です。これらのモデルは、制御されていない消費を減らすことを目的とした治療法の開発にも役立つツールです。2本入りの家庭用ケージでの飲酒は、げっ歯類のアルコール消費を研究するために最も広く使用されている前臨床パラダイムの1つです。これは、主に、専門的な研究機器や複雑な分析を必要とせずに、自発的なアルコール飲料と嗜好の総測定を可能にするため、実装の容易さによるものです。このアプローチを使用すると、研究者は、飲酒セッションの開始から終了までのボトル重量の変化を計算することにより、希望の間隔(時間、日、週など)で測定値を収集できます。この基本的な方法のバリエーションは、短期間と長期の両方で低から中程度から過量のアルコール摂取を促進するために、この分野の多くの人々によって使用されてきました。例えば、マウス5および<ラットの両方で、それぞれ低レベルおよび中程度のアルコール摂取を促進するために、連続的および断続的な2ボトル選択手順が使用されsup class="xref"6,7,8。同じパラダイムにより、アルコールを好む菌株の高レベルの摂取を促進することができます7,9。あるいは、ダークサイクルの開始から約3時間後から毎日2〜4時間に制限するこの方法の適応は、マウスの大量飲酒(すなわち、暗闇での飲酒)10,11。これらの方法のさらなるバリエーションは、アルコール依存を促進する方法(すなわち、慢性的な断続的なエタノール蒸気曝露)と組み合わせて使用され、離脱中の自発的なアルコール飲酒のエスカレーションを調べるために使用されています12,13,14,15,16,17、18,19.

この分野で広く採用されていますが、ボトルの重量の変化によってアルコール摂取量を測定する標準的なアプローチは、飲酒セッションごとの総消費量に対する解像度が制限されています。その結果、このアプローチでは、アルコール使用障害(AUD)のリスクと重症度の両方に影響を与えることがよく知られている飲酒パターンを捉えることができません20,21,22。実際、個人の経時的な平均摂取量は、いくつかの大量飲酒エピソードまたはそれぞれが比較的低い消費量に関連する多くの飲酒エピソードの結果である可能性があり、これらのニュアンスは、消費が飲酒セッションごとの総摂取量として測定されると検出されません。重要なことは、大規模な飲酒発作(すなわち、飲み込み)に関連する飲酒エピソードは、健康な対照群と比較してAUDの個人で有意に多く観察され23、そしてヒト以外の霊長類のデータは、飲酒履歴の早い段階で大規模な飲酒発作を含むアルコール消費のパターンを確立した個人がAUD22に対して有意なリスクがあることを示唆しています.さらに、大量の消費を含む飲酒エピソードは、AUDの診断21とは無関係に、罹患率と死亡のリスクを大幅に増加させます。全体として、これらのデータは、前臨床モデルにおける全体的な摂取量レベルに加えて飲酒パターンを調べることへの関心の高まりにつながり、個々のリックのレベルで飲酒データをキャプチャできるさまざまな複雑さの多くのシステムの開発を促しました。

最初のものの中には、マウスで使用するために設計されたフォトビームリック検出を備えた2ボトルシステムの開発がありました24。このシステムは、その後、rats25で使用するために別のグループによって適応されました。それ以来、このテーマのバリエーションは、カスタムげっ歯類の飼育に含まれる同様のシステムを開発するために使用されてきました26、社会的に飼育された個々の動物のなめ検出を可能にします27,28、摂食行動と飲酒行動の両方をキャプチャ29。中でも、LIQ HD(Lick Instance Quantifier Home Cage Device)30は、Godnyuckらが開発したシステムの実装の容易さと手頃な価格に匹敵するマウス用システムを提供したとして大きな注目を集めています。24。このシステムは、静電容量式センシングを利用して、フォトビーム検出システムを使用して提供されるシッパーアプローチや相互作用などの間接的な手段とは対照的に、舌と導電性金属シッパーチューブとの間の接触を直接検出します。著者たちは、静電容量式センシングシステムがリック検出の精度と感度が大幅に向上し、リック数とボトル重量の変化との間にはフォトビーム検出よりも強い相関関係が生じることを示すデータを提供しています。著者らはさらに、このシステムを連続アクセスの2ボトル選択式ホームケージ飲用パラダイムと組み合わせて使用し、アルコール飲用微細構造の測定値に加えて、全体的な毎日の摂取量の測定値をキャプチャする能力を示しています30。

ここでは、標準的なアプローチを使用した2本選択式ホームケージアルコールの飲用手順と、リック検出を可能にする方法(図1)について説明します。また、LIQ HD30をラット用に適応させたLIQ HDRの構築と実装の方法も紹介します。これには、より大きなケージサイズに対応するためのハードウェアの変更と、標準の既製ボトルと互換性のある再設計された3Dプリントボトルホルダーが含まれています。これらの方法により、研究者は、実験リソースとデータ収集のニーズに応じて、標準アプローチまたはリコメーター搭載アプローチのいずれかを柔軟に使用できます。

以下は、Simms et al.7から採用された断続的なアクセス2ボトル選択飲酒手順を使用して、家庭用ケージでの飲用をキャプチャするために必要な材料の説明と段階的な指示です。この手順では、ラットは週7日、2本の飲用ボトルに24時間アクセスすることができます。月曜日、水曜日、金曜日(MWF)に、ラットは水(H2O)の入ったボトルとエタノール(EtOH)の入ったボトルを1本受け取ります。これらのボトルは、火曜日、木曜日、土曜日(TRS)に取り外され、2本のボトル入り飲料水と交換されます。ネズミは土曜日と日曜日に同じ2本のボトルの水から水を飲みます。これらの方法は、必要に応じて、エタノールアクセスの代替スケジュール(例えば、連続的、ビンジなど)に対して容易に調整できることに注意してください。標準アプローチとリコメーター装備のアプローチについては、個別の手順が提供されています。

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プロトコル

すべての代表データは、イリノイ大学シカゴ校の動物ケアおよび使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）の承認を得て、NIHの実験動物のケアおよび使用に関するガイドラインに従い、個別に飼育した成体のLong-Evansラットを用いて収集されました。各個体の水分摂取量を正確にモニターするため、個別飼育が必要となります。到着時に生後50〜80日（P50-80）であった成体オス（n = 38）およびメス（n = 22）のLong-Evansラットを、実験開始前に1週間飼育室に順化させました。特に記載がない限り、ラットには標準飼料（Teklad 7912, Envigo）と水をad libitum（自由）に与えました。

1. 実験前の準備

  1. 飲料ボトルにHとラベルを貼る2OまたはEtOH。その後、各ラットに固有の識別子を付与する。2OおよびEtOHボトル1本をMWF用に、さらに2本のHを2TRS用ボトルO本。
    注：必要に応じて、異なる色のテープを使用してHを識別してください。2ボトル交換時の潜在的なエラーを回避するため、水（$\text{H}_2\text{O}$）とエタノール（$\text{EtOH}$）のボトルに識別表示を付ける。
  2. Hを満たす2実験開始日の1日前に、飲料水をボトルに充填しておく。また、190 proof EtOHと飲料水を混合し、EtOH溶液（20% v/v）を実験開始日の1日前に調製する。
    注意：変性エタノールは毒性があるため、必ず非変性エタノールを使用してください。
  3. 実験に参加するラットと同じ棚に、空のケージを用意する。このケージは、こぼれ落ちた餌の量を算出するために使用する。
  4. LIQ HDRシステムを使用する場合は、ケージにシステムを設置してください（ステップ3を参照）。 図2, 図3, 図4, 図 5, 図6および 補足図 1).
  5. 研究開始前に、ボトル交換を行う正確な時刻を決定してください。24時間摂取量を正確に測定するため、ボトルは毎日同じ時刻に交換する必要があります。
    注：先行研究により、げっ歯類は暗期開始直後に最も高い摂取量を示すことが明らかになっている。10,31したがって、この非常に活動的な期間中の摂取量を捕捉するため（ドカ食いのような飲酒行動の捕捉についてはステップ2.3.1を参照）、消灯後30〜60分にボトル交換を行うことが推奨されます。明暗サイクルを乱さずに視認できるよう、ボトル交換時は赤色灯を使用してください。

2. 日常の手順とメンテナンス

  1. 実験の初日に、以下を実施する。
    1. ケージから標準の水ボトルを取り除く。
    2. 任意：ラットは餌を探している際にケージ上部を揺らすことが多く、これにより、流出用ケージでは補正できないこぼれが発生する場合がある。ケージ内にフードカップを使用することで、この懸念を軽減できる。使用する場合は、この時点でケージ上部の餌を取り除き、ケージ内にフードカップを設置して飼料を充填する。ラットに割り当てられた床面積が、ラットケージのサイズとフードカップのサイズに基づいた施設ガイドラインに依然として適合していることを確認する。
    3. 該当する場合、実験期間中は研究者が餌と水を提供することを、飼育管理スタッフに通知する。
    4. ケージ交換はデータ収集の妨げとなる可能性がある。ケージ交換は体重測定と同時に行う。これを選択した研究者は、飼育管理スタッフに適切に通知する必要がある。
  2. 2日目以降は、以下に概説する手順に従う。
    注：ケージやボトルの移動は、こぼれの原因となる可能性があることを留意すること。したがって、動作は慎重に行い、流出用ケージへのボトルの取り付けおよび取り外しには、ラットケージに使用するものと同じ方法を用いることが重要である。
    1. ボトル交換時間の前に室内に立ち、以下のステップを実行するのに十分な時間を確保し、適切なセッション開始時間に新しいボトルをケージに設置する。
    2. ケージからフィルタートップを取り除く。MWFの場合はステップ2.2.3へ進む。TRSの場合はステップ2.2.4へ進む。
    3. 月曜日、水曜日、金曜日（MWF）は、ケージ上部からTRSボトルを取り除く。MWFボトル（EtOH 1本とH2O 1本）を量る。本日の飲水セッションのボトルの開始重量を記録する。必要に応じて、ケージ上部またはフードカップに餌を追加する。指定されたセッション開始時間に、ラットがボトルラベルをかじらないよう、テープを上にした状態で各ラットのケージ上部にボトルを設置する。
      注：通常、TRSでの水消費量は記録または報告されないが、研究者が希望する場合は、後述のステップ2.2.3および2.2.4に従ってボトルの開始重量と終了重量を測定することで、任意でこれらのデータを収集できる。潜在的な側好性の形成を避け、消費データが不当に歪むのを防ぐため、EtOHボトルの設置側は飲水セッションごとに交互に変更する必要がある。
      1. 任意：先行研究により、多くのラットが飲水セッションの開始時にビンジ様（過剰）飲水を示すことが示されている8,32,33。この時間帯のビンジ飲水を捉えるほとんどの研究者は、飲水セッションの最初の30-60分間の摂取量を報告している。この潜在的なビンジエピソード中の摂取量データを取得するには、以下のステップに従う。
      2. 最後のケージにボトルを設置した後、タイマーをセットする。タイマーが作動するまで、室内に誰も入らず静かにさせる。
      3. タイマーが鳴ったら室内に再入室する。EtOHボトルとH2Oボトルを取り除き、ボトルの重量を記録する。EtOHボトルとH2Oボトルをケージに戻す。
        注：舐め取り検知（lick detection）システムを備えた装置を使用する場合、ビンジエピソードを捉えるためにこのステップを行う必要はない。
    4. 火曜日、木曜日、土曜日（TRS）は、開始から24時間後の指定されたセッション終了時間に、ケージからMWFボトルを取り除く。各ボトルの重量を量り、MWF飲水セッションのボトルの終了重量を記録する。各ラットの体重を測定し記録する。必要に応じて、ケージ上部またはフードカップに餌を追加する。ラットがボトルラベルをかじらないよう、テープを上にした状態でTRS H2Oボトルを各ラットのケージ上部に設置する。
    5. フィルタートップをケージに戻し、動物室から出る。
      注：任意で、蒸発を防ぐためにEtOHボトルのシッパーをカバーする。ケージ交換を研究者が行う場合は、TRS業務中の週に1日をこの作業に充てる。体重測定後、各ラットを清潔なケージに移す。
  3. 施設の動物ケアおよび飼育手順に従い、定期的（週1回または2週に1回）にボトルを洗浄し、液体を更新する。これらの作業は、飲水セッションを妨げないように注意して行う。例えば、TRS H2OボトルはMWFに取り除いた後に洗浄および再充填できる。同様に、MWF H2OおよびEtOHボトルはTRSに取り除いた後に洗浄および再充填できる。

3. 2ボトル選択実験における舐め取り検出

注：高解像度の飲水量データの取得に関心がある研究者は、ボトルに舐め検知機能を備えさせることで、上記の手順を変更することができます。LIQ HD30は、マウスでこの種のデータ収集を可能にする低コストのDIYシステムです。以下に概説する手順は、LIQ HDをラットで使用するために必要な変更点（LIQ HDRと呼ぶ）について説明したものです。最大18匹のラットで2ボトル選択データを取得可能な、舐め検知システム1台の構築に必要なすべての市販部品およびカスタム3Dプリント部品のリストについては、材料表を参照してください。3Dプリント用の.stlファイルと手順書は、著者のウェブサイト（www.ejgloverlab.com/3dprints）で入手可能です。

  1. 静電容量式センサーユニットのセットアップ
    注：各LIQ HDRシステムは3つの静電容量式センサーユニットで構成されており、これらが連携して、個別に飼育されたラット18匹に対応する36本のボトルからの舐めデータを並列に取得します。各センサーユニットは、1つの差動I2C通信ブレイクアウトボード1枚と12キー静電容量式センサーボード1枚。これらは、6組の2ピンケーブル（各リックメーターごとに色分けされている）を介して、6つの個別のケージに設置されたリックメーターに接続されます（図2A).
    1. 3つの静電容量式センサーユニットすべてを構築するために必要な材料を、以下に示す通りに揃えます。 図2Bおよび、必要なはんだ付け工具。
    2. センサーユニットAの製作を開始するには、2ピンのメス端子ケーブルを7インチの長さの赤色熱収縮チューブで覆い、赤色と黒色のワイヤー端子をセンサーボードのピン#0および#1に挿入します（図2C-1）、そしてはんだ付けして固定する（図2C-2）。ケーブルが重なって記録を妨げる可能性があるため、ケーブルがセンサーボードの前方にあることを確認し、動物飼育室でケージを左から右へ番号順に配置してください（ステップ3.6およびを参照）。 図6).
    3. さらに5本のケーブルをそれぞれ異なる色の熱収縮チューブで覆い、図のようにピン#2-11にハンダ付けします（図2C-3すべての赤色の電線を偶数番のピンに、すべての黒色の電線を奇数番のピンにハンダ付けしてください。これにより、赤色の電線は左側のすべてのボトルに、黒色の電線は右側のすべてのボトルに接続されます。
    4. 保護のため、はんだ接合部の全周囲をホットメルト接着剤で覆います（図2C-4). コネクタに番号順にラベルを貼り、各リクトメーターに固有のIDを割り当てます（図2C-4).
    5. センサーユニットAを組み立てるには、50 mmの4ピンケーブルを使用してセンサーボードAを通信ブレイクアウトエンドポイントに接続し、さらに100 mmの4ピンケーブルを使用して、そのエンドポイントを5V-3Vレベルシフターの3.3 V出力に接続します。図 2D-1）。センサーボードと通信ブレイクアウトボードの両方に同一の4ピンコネクタが2つありますが、配線が図に示されている通りに正確になされているかを確認することが重要です（図 2D-1 および 図2F3Dプリントされたセンサーケースおよび推奨されるビバリウムのセットアップを使用するために（ステップ3.6および...を参照） 図6）。3Dプリントしたケース内にセンサーユニットAを収納します（図2D-2）。レベルシフターケーブルを潰さないように注意しながら、上部を静かに閉じます（図2D-3).
    6. Iを修正してください2指示通りに、ADDRピンから3VoまたはSDAピンへジャンパー線をはんだ付けすることにより、センサーボードBおよびCのCアドレスを設定します（図2E).
    7. ボードAで使用したのと同じ順序で、色分けされた6本のメスコネクタケーブルをセンサーボードBおよびCにはんだ付けします。各コネクタに、対応するリックメーターID番号のラベルを貼ります。50 mmの4ピンケーブルを用いて、ボードBを通信ブレイクアウトのMidPointに、ボードCをEndPointに接続します。図2F).
    8. センサーユニットBとCを、それぞれ3Dプリントされたケースに収納します。3つのセンサーユニットすべてをイーサネットケーブルでデイジーチェーン接続し、センサーのセットアップを完了させます（図 2G).
  2. マイクロコントローラインターフェースのセットアップ
    注：LIQ HDRマイクロコントローラインターフェース（補足図1A）は、LIQ HDについて記述されている内容と同様である。30 ごくわずかな変更を加えています。以下に概説する手順は、インターフェースを構築するために必要なステップの全般的な概要であり、ステップ3.2.6および3.2.8で述べる変更が含まれています。より詳細なステップごとの手順については、元のプロトコルおよび著者のGitHubページで提供されているビデオチュートリアルを参照してください。30.
    1. マイクロコントローラ・インターフェースの構築に必要な材料およびはんだ付け工具を準備します（付随図1B). タッチシールドの背面（補足図1C-1）、バックライトはんだパッド間にはんだジャンパーを作成します（補完図 1C-2).
    2. データロギングシールドの裏面で、CSピンのジャンパーパッドトレースを切断します（補足図1D-1). データロガーの前面で、CSピンから7番ピンへ短いジャンパー線をはんだ付けします（付随図1D-2).
    3. シールドスタッキングヘッダーを装着するには、まずタッチスクリーンシールドの背面（補足図 1E-1データロガーをタッチスクリーンに重ねて配置し、テープで固定して、すべてのヘッダーピンをデータロガーにハンダ付けします（補足図 1E-2）。その後、タッチスクリーンを取り外します。
    4. 残りの2 x 3ヘッダーをマイクロコントローラーにスタックします（付随図 1F-1）、次に、ヘッダーピンをはんだ付けする前に、データロガーをマイコンの上に積み重ねます（補足図1F-2).
    5. ボタン電池をデータロガーに挿入します（補足図1G-1）。タッチスクリーンをデータロガーの上に積み重ねます（付随図1G-1). microSDカードをアダプターに挿入し、データロガーに差し込みます（補完図 1G-2).
    6. 追加のアース線を作成するには、ジャンパー線からオス端子を1つ切り取り、端部を約1/4インチ（付随図 1H-1）。被覆を剥いた単線の一本をジャンパー線にハンダ付けし、ハンダ接合部を熱収縮チューブで覆います（補足図1H-2).
    7. 4ピンのジャンパーワイヤと追加の接地線をマイクロコントローラに接続します（黒：GND、赤：5V、黄：ピン#21、青：ピン#20）。 付随図 1I-1）。ホットグルーで接続箇所を固定します（補足図 1I-2）。必要に応じて、ジャンパー線を熱収縮チューブで巻いてください（補足図 1I-2).
    8. 完全に組み立てられたマイクロコントローラインターフェースを3Dプリントしたケースに収納し、4ピンジャンパーワイヤと接地線を上部の開口部から通します（付録図1J).
    9. マイクロコントローラー・インターフェース・ソフトウェアのインストールに関する元のプロトコルに従ってください。30.
  3. LIQ HDRリックメーターの作製
    注：ボトルを固定するためのカスタム3Dプリント製ホルダーは、シッパーチューブの直径が8 mmの標準的なげっ歯類用飲水ボトルでの使用に合わせて設計されています（参照 材料一覧 図3Aこのボトルホルダーは、わずかな修正または修正なしで、同様のボトルやシッパーチューブへの転用が容易に可能です。
    1. リコメーターを1台製作するために必要な材料、3Dプリントパーツ、およびはんだ付けツールを、以下の通りに準備します。 図3Bなお、LIQ HDRシステム1台あたり、最大18台のリコメーターで36本のボトルに対応しています。
    2. オスコネクタケーブルを延長するには、ケーブルの両端を約1/4インチの長さに剥離し、同様に延長用の赤色および黒色の電線も剥離します（図 3C-1).
    3. 延長線をコネクタケーブルにはんだ付けします（図3C-2)とし、はんだ接合部を熱収縮チューブで覆います（図3C-3）。オス端子ケーブルを、センサーユニット上の対応するメス端子ケーブルと同色の熱収縮チューブで覆います（図3C-4).
    4. センサーボードの配線と整合させるため（図2）、赤と黒の電線を、それぞれボトルホルダーの左側と右側の内部ケーブル通路に通します（図3D-1).
    5. 各ワイヤーを1 ¾ インチの導電性銅テープの最端部にはんだ付けします（図3D-2) 銅テープを半分に折ります（図3D-3).
    6. 銅テープを剥がし、ピンセットを用いてシッパーブラケット内に慎重に配置します（図3E-1）した後、シッパーブラケットの内壁にしっかりと密着させます（図3E-2）。指示通り、銅テープのはんだ付け面がボトルホルダーの中心線に近い側の壁面に密着していることを確認してください（図 3E-2）。ブラケットにシッパーチューブを押し込み、テープを壁面にしっかりと密着させて、ブラケットをプライミングします。
    7. 接着力が弱く剥がれやすい銅テープのはんだ付け側を補強するため、はんだ接合部にホットメルト接着剤を少量塗布します（図3E-3）。銅テープと、それに隣接する3Dプリントの露出部分の両方を覆うように接着剤を塗布します（図3E-4).
    8. ケーブルプロテクターの内部通路にケーブルを通します（図3F）。推奨される飼育室のセットアップを使用するためには、各リックメーターに対して適切なケーブルプロテクター（左向きまたは右向き）を必ず選択してください（ステップ3.6および 図6注：現在のセットアップにおいて青色または紫色のケーブルで示されているリックメーター5-6、11-12、および17-18には、左向きのケーブルプロテクターが必要です（図4D-1）、一方で、他のすべてのリックメーターには右向きのケーブルプロテクターが必要である（図 4D-2).
    9. ケーブルクリップを取り付けるには、まずケーブルクリップの片側の溝にワイヤを1本はめ込みます（図3G-1）、次に残りの半分を2本目のワイヤーに被せ、ナットで両半分をしっかりと締め付けます（図3G-2).
    10. オスコネクタに、対応するリックオメーターのID番号を記入してください（図 3H）。すべてのリックメーター（計18台）が完成するまで、これらの手順を繰り返します。
  4. LIQ HDRリコメーターの設置
    注：LIQ HDRは、金属ワイヤー製のトップを備えた標準的な靴箱型ラットケージへの設置用に設計されています（図 4A-1).
    1. ボトルホルダーを設置するため、ワイヤーケージ上部で中心間距離が約75 mmとなるロッドを2ペア特定します。プライヤーを使用して、シッパーの開口部付近にある金属ロッドをわずかに広げます。シッパーとケージ上部の金属同士が接触するのを防ぐため、これらのロッドを電気絶縁テープで絶縁します。図4A-2).
      注：電気テープはラットの手が届かない場所にあるため、かじられる心配はありませんが、研究終了時に廃棄し、異なる研究間で再利用しないことを推奨します。
    2. 2組のM5ネジとナットを用いて、リコメーターと厚さ1/8インチのレーザーアクリルパネルをケージ上部に取り付ける（図4B）。リコメーターとアクリルパネルのシッパー開口部が一致していること、およびシッパーがケージ上部のどの部分にも接触していないことを確認してください。
    3. ケーブルクリップを、ワイヤーケージ上部の最も外側のロッド（直径約4 mm）に固定します（図4C）。必要に応じてケーブルクリップを調整し、ケージ上部がケージ下部にぴったりと密着していること、およびケーブルが過度な張力で引っ張られたり曲がったりしていないことを確認してください。各リコメーターに適切なケーブルプロテクターが使用されていることを確認してください（図 4D （ステップ 3.8.8 を参照）。
    4. 必要に応じてシッパーチューブを調整し、キャップから突き出ているシッパーの長さが約2 cmになるようにします（図 4E-1）。ボトルを設置するには、ボトルホルダーのシッパーブラケットにシッパーチューブを、止まるまで挿入します（図4E-2）。シッパーチューブの先端のみがアクリルパネルから突き出るようにします（図4E-3）。ラットがシッパーチューブに触れたり、それで遊んだりするといった非消費的行動による偽陽性の舐め動作を避けるため、シッパーチューブの他の部分が露出していないことが極めて重要である。フィルタートップは、ケーブル自体を妨げることなく、ワイヤーケージの天面およびケーブルクリップの上にぴったりと収まる必要がある（図 4F).
      注：より厚いアクリルパネル、または1/8インチのパネルを複数枚重ねたものを使用することで、より長い長さのシッパーチューブを完全に囲むことができます。これは、短いシッパーに届くのが困難な可能性のある若齢ラットの飲水量を測定する場合など、シッパーチューブをケージ内により深く伸ばす必要がある実験に有効です。
  5. シッパーブロッカーの設置と使用
    注意：シッパーブロッカー（図5A）は、ボトル交換時にラットがシッパーにアクセスするのを制限し、各飲水セッションの開始時にリックメーターの正確な校正を確実に行うために設計されています。
    1. 図に示されているように、1個のシッパーブロッカー用の3Dプリントパーツと、M5ネジ、ナット、ワッシャーを用意します。 図5B.
    2. SIPPER_GearをSIPPER_Baseに挿入します（図5C-1）。SIPPER_Gearが3Dレンダリングの挿入図に示されている通りに配置されていることを確認してください。SIPPER_WormをSIPPER_Base上部の開口部に挿入します。挿入しながらウォームを時計回りに回し、ヘッドがベースと面一（つらいち）になるまで締め付けます（図 5C-2).
    3. ベースの下側から、SIPPER_Nutをワームの端にねじ込みます（図 5C-3）。ウォームダイヤルを回しながら、ピンセットでナットを締める。SIPPER_Blockersの円形で細いネック部分をギアのスロットに挿入する（図5C-4).
    4. 組み立てたシッパーブロッカーを、M5ネジセットを用いてケージトップに取り付けます（図 5D）。両方のシッパーブロッカーがシッパー開口部と一致していることを確認してください。
    5. シッパーへのアクセスを遮断するには、ウォームダイヤルを時計回りに回してブロッカーを下げ、シッパーの開口部を完全に覆います（図 5E).
    6. シッパーにアクセスできるようにするため、ブロッカーがケージ上部に対して垂直な位置にくるまで、ダイヤルを反時計回りに回します（図5F-1）。各ブロッカーアームを手で上に引き上げ、ヘッドがワイヤーケージの最上部にかかる直前まで移動させます。ブロッカーを回転させます。 90° したがって、ヘッドをケージ上部の金属棒と平行にし、アームを固定します（図 5F-2）。両方のブロッカーがケージの上端より上に上がるまで、ダイヤルを反時計回りに回し続けてください（図5F-3) および給水嘴に完全にアクセスできる（図5F-4).
  6. 動物飼育施設におけるLIQ HDRシステムの利用
    注：以下のビバリウムの設定は、18個の標準的なシューズボックス型ラットケージに接続された単一のマイコンインターフェースを用いて、2ボトル選択飲水量を記録するように最適化されています。マイコンインターフェース、センサーユニット、および各種ケーブルを含むすべての電子部品は、ケージを設置した壁掛け式の金属製ワイヤーシェルフに固定されています（図6A）。動物施設やユーザーのニーズに合わせて、一部修正が必要な場合があります。
    1. カスタム3Dプリント製マウントネジを使用して、各センサーユニットをビバリウムの棚に固定します（図6B不要なケーブルの張力を避けるため、各センサーユニットが黄色いリックオメーターを備えたケージの直下に設置されていることを確認してください。図6A).
    2. 各メスコネクタケーブルを、互いに重なり合わないよう、またはんだ付け端部で過度に曲がらないように配置して固定します。端部が過度に曲がると、漏液検知の感度低下を招く恐れがあります（図6B）。金属製のロッド棚を使用している場合は、図に示すように、コネクタケーブルを棚の別々のロッドにケーブルタイで固定することで、簡単に実現できます。
    3. 3Dプリントされた同一の固定用ネジを使用して、マイクロコントローラインターフェースをセンサーユニットAの隣に固定し、その4ピンコネクタをセンサーユニットAに接続されている5V-3Vレベルシフタの5V入力ポートに差し込みます（図6C).
    4. 電気テープを使用して、予備の接地線を金属棚などの接地源に固定します（図6D).
    5. 設置されたリコメーターの色とIDに基づき、各ケージを以下のように配置してください。 図6A ケーブルの重なりと張力を最小限に抑えるための描写。
    6. すべてのオス側リコメーターコネクタケーブルを、対応するメス側センサーコネクタケーブルに確実に接続します（図6E）。電源を接続し、マイクロコントローラ・インターフェースをオンにします（図6F).
    7. メインGUI（グラフィカルユーザーインターフェース）ページで（図 6G）、～をタップします 設定シンボル 設定ページを開きます。ユーザーは、暗周期の開始時にインターフェース表示が自動的に暗くなるよう、飼育施設のスケジュールに基づいて点灯および消灯時間を変更できます（図6H-1).
    8. タップ センサー設定の編集 (図6H-1) Touch Threshold（接触しきい値）を8に、Release Threshold（離脱しきい値）を2に調整します。これにより、現在のセットアップにおいてラットの舐め動作を最も一貫して検出できることが判明しています（図6H-2）。ただし、現在のシステムに変更を加えた場合は、ユーザーがさまざまな設定を試行する必要がある場合があることに注意してください。
    9. チェックを外す 自動校正 データ収集期間が24時間以下である場合（図 6H-2).

4. リック検出を用いた2ボトル選択式ホームケージ飲水における日常の手順

  1. 標準的な2ボトル選択手順について、ステップ2に記載された手順を以下の修正に従って実施する。
  2. 月曜日、水曜日、金曜日は、MWFボトルを設置する前に、すべてのケージのシッパー開口部をシッパーブロッカーで覆う（ステップ3.5.5および図5Eを参照）。
  3. 記録を開始する前に、メインGUIページで正しいExperimental Sideを選択する。これは、その日のEtOHボトルの設置側となる（図6G）。
  4. すべてのMWFボトルを設置した後、メインページのSTART!をタップしてセンサーの校正を開始する（図6G）。校正中は、システムから少し離れ、ラットがシッパーを舐めていないことを確認することが推奨される（図6I-1）。校正は数秒で完了し、その後システムはメイン記録ページに移行し、各リコメーターの各ボトルにおける累積舐め回数が表示される（図6I-2）。
  5. シッパーにアクセスできるよう、すべてのシッパーブロッカーをケージ上部より上に上げ（ステップ3.5.6および図5Fを参照）、説明通りにすべてのフィルタートップを静かに戻す（ステップ3.4.4および図4Fを参照）。
  6. 画面上の舐め回数を更新するためにRefreshをタップする。数値は自動的にリアルタイムで更新されない（図6I-2）。
  7. 火曜日、木曜日、土曜日は、MWFボトルを取り外す前にSave & Quitをタップして記録を停止し、メインページに戻る（図6I-2）。
  8. データ転送のためにSDカードを取り出す場合は、SDカードを抜く前にEject SDをタップする（図6G）。SDカードをコンピュータに挿入し、ボトルの設置日に基づいて命名された.csvデータファイルをそのコンピュータにコピー＆ペーストする（図6K）。次回の記録のためにSDカードを再マウントするには、カードをインターフェースに挿入し、Mount SDをタップする（図6J）。
    注：データファイルは毎日バックアップすることを推奨する。
  9. 動物モデルおよび動物使用プロトコルと整合する場合、体重測定は週1回に制限することが望ましい。また、リコメーターやセンサーへの不必要な妨げを最小限にするため、この作業はケージ交換の指定日に行う。ケージを移動する前に、すべてのリコメーターのオス側ケーブルを対応するセンサーのメス側ケーブルから抜く。各ラットの計量後、ラットを清潔なケージに戻す。リコメーターを新しいケージ上部に移し、必要に応じて各リコメーターを対応するセンサーに再接続する。
  10. 介入（例：薬剤投与）がEtOH摂取量および飲水微細構造に及ぼす影響を試験する実験では、可能な限り飲水セッションの開始前に介入をスケジュールする。それが不可能な場合は、Pauseをタップして舐め検出を中断し（図6I-2）、介入完了後にResumeをタップしてデータキャプチャを再開することができる。介入前後のEtOH摂取量の変化を把握し、また動物にアクセスするためにケージ上部を取り外す際に発生し得るこぼれを考慮するため、飲水セッション中の各休止時にボトル重量を測定することを推奨する。
  11. 研究終了後、動物間の汚染物質の伝播を制限するため、すべてのケージ内コンポーネントは新しい動物に使用する前に徹底的に消毒する必要がある。リコメーターは、内部の電気部品を損なわないように注意しながら、70% EtOH溶液で軽くスプレーして拭き取ることを推奨する。シッパーブロッカーとアクリルパネルは、温 soapy water（温石鹸水）で洗浄できる。

5. データ解析

  1. 従属変数を評価する前に、毎日のボトルの交換に伴い不可避的に発生する漏出（spillage）について、摂取データを補正します。補正を行うため、研究期間全体を通じて、漏出確認用ケージ（spillage cage）内のEtOHボトルおよびH2Oボトルの重量変化の平均を算出します。
  2. 各ボトルについて、平均から2標準偏差を超える値を除外します。これらの外れ値を除外した後、動物を飼育しているケージのEtOHおよびH2Oボトルの重量変化から、算出された平均値を差し引きます。この量を差し引くことで、特定の溶液の漏出による平均損失が摂取量の測定に含まれないようにします。平均漏出量を差し引いた結果、一部の動物で時折負の値となる場合がありますが、これらはゼロに変換し、その溶液の摂取がなかったものとして解釈します。
  3. 2ボトル選択飲水実験における主要な従属変数は、EtOH摂取量（g/kg）および嗜好性（%）です。EtOHボトルの重量変化（g）から摂取量を算出し、以下の手順を用いて体重（kg）あたりで正規化します。
    1. 次の式を用いて、ボトルの重量変化（g）を体積変化（mL）に変換します。
      体積変化の式。公式：ΔVolume (mL) = ΔWeight (g) / Density EtOH (g/mL)。
      純エタノールの密度は0.789 g/mLです。したがって、20% EtOHの寄与密度は0.1578 g/mLとなります。H2Oの重量は1 g/mLであるため、80% H2Oの寄与密度 = 0.80 g/mLとなります。その結果、20% EtOH溶液（v/v）の1 mLあたりは、0.1578 (EtOH) + 0.80 (H2O) = 0.9578 g/mLで構成されます。したがって、20% (v/v) EtOH濃度を使用する場合の最終式は以下の通りです。
      体積変化の計算。公式：体積変化 (mL) = 重量変化 (g) / 0.9578 (g/mL)。
    2. 以下の式を用いて、消費されたエタノールの用量を計算します。動物の体重あたりのエタノール消費量を算出するため、摂取データと同じ週に測定した体重を使用してください。
      用量計算式。濃度 × 体積 × 比重 / 体重。方程式。
    3. 次の式を用いて嗜好性を計算します。
      溶媒混合の嗜好性計算式。図中の20% EtOH体積比。
  4. マウスでの例30と同様に、LIQ HDRは、舐め持続時間（lick duration）、バウト数（bout number）、バウト持続時間（bout duration）、バウト内舐め回数（bout lick number）、およびバウト内舐め持続時間（bout lick duration）を含む、さまざまな飲水マイクロストラクチャー変数を捕捉します（Figure 6K）。飲水バウト（drinking bout）は、1秒以内に少なくとも3回の舐め動作で始まり、その後3秒間追加の舐め動作がなかった時点で終了する一連の動作と定義されます。これらの測定値を用いて、平均個々の舐め持続時間、平均個々のバウト持続時間、バウトあたり平均舐め回数、平均舐め頻度、推定舐め間隔（inter-lick interval）、および推定バウト間隔（inter-bout interval）を算出できます。
    注：マイクロコントローラ・インターフェースにより、これらのマイクロストラクチャーデータが1分解像度で.csvファイルとして提供されます（Figure 6K）。研究者は、元のLIQ HDプロトコル30で提供されている解析アプリ、または好みの後処理プラットフォームを使用して、研究ニーズに応じてデータを集計および要約することができます。マイクロストラクチャーデータは通常、マクロレベルでの平均的な差を比較するために24時間全期間で合算されるか、明暗サイクルを通じた飲水パターンの変動を調べるために30分から1時間のビン（bin）に分けて集計されます。

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結果

標準的な断続的2本ボトル選択法によるホームケージ内エタノール摂取データ
標準的手順（図7A）を用いることで、研究者は24時間の摂取量（図7B–D）を記録できるほか、飲酒セッション開始直後にボトルの重量を測定すれば、一気に大量飲酒のような行動も捉えることができる（図7E–F）。エタノール摂取量を水の摂取量に対して相対的に計算することにより、測定したすべての時点における嗜好性データも得られる（図 7D、F）。図7Cに示されているように、ラットは2本ボトル選択法による摂取開始後数日間にわたり、エタノール摂取量が増加する傾向を示すことが多い。その後、摂取量が比較的安定したプラトー期に入る。このパ...

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ディスカッション

現在のプロトコルは、断続的なアクセスの 2 ボトル選択ホームケージ手順を使用してエタノール飲用データを取得するための段階的な手順を提供します。この方法は比較的簡単に実装でき、コストや特殊な研究機器をほとんどまたはまったく必要としません。ラットで使用する舐め検出システムであるLIQ HDRの構築と実装にここで提供する手順を使用すると、研究者は、摂取量と好みの標準的な測定値に加えて、高解像度の飲酒微細構造データを取得できます。

現在のプロトコルに記載されている断続的アクセス スケジュールは、エタノール アクセスの多くの代替スケジュールよりも高いレベルのエタノール摂取を引き起こすことがよく知られているため、広く使用されている手順です。実際、以前の研究では、断続的なスケジュールでアクセスするラットは、連続して24時間アクセスするラットよりも1日の平均エタノール摂取量が高いことが示されています6,7。それにもかかわらず、研究課題やその他の実験計画パラメータに応じて、エタノール...

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開示事項

すべての著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

著者は、LIQ HDR開発中の技術支援を提供してくれたJoseph Pitock氏とKatie Przybysz博士に感謝します。また、LIQ HDRの開発中に多くの有益な会話をしてくれたNicholas Petersen氏とMarie Doyle博士にも感謝します。この研究は、国立衛生研究所の国立アルコール乱用およびアルコール依存症研究所(P50 AA022538およびR01 AA029130 EJGの支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
<強力>市販のコンポーネント<強力>数量
12キー静電容量式タッチセンサーブレークアウト(MPR121)Adafruit19823
2ピンケーブルマッチングペア(JST XH 2.5mmピッチ)Adafruit487218
4ピンブレッドボードジャンパー(Qwiic)SparkFunPRT-179121
4ピンケーブル(100mmケーブル)SparkFunPRT-172591
4ピンケーブル(50mmケーブル)SparkFunPRT-172603
5V-to-3VレベルシフターブレークアウトAdafruit56371
式タッチシールド(2.8インチ)Adafruit19471
導電性テープ(1/4インチ)DigiKey4393-CFT-1/4-ND1
データロギングシールドAdafruit11411
差動I2C通信ブレークアウトキット(QwiicBus)SparkFunKIT-172501
電気テープDigiKey3M156004-ND1 熱
収縮チューブ(3/16インチ各種色)ケーブルタイなどHS357-S106
熱収縮チューブキット(4インチ黒)Jameco20959631
コイン型リチウム電池(3V 12.5mm)DigiKey1908-CR1220JAUCHSB-ND1
M5平ワッシャーグレインジャー54FN661
M5六角ナットグレインジャー6CA721
M5小ネジ(12mm)グレインジャー6GU88M5
小ネジ1本(25mm)グレインジャー 6GU912
オス/オスジャンパ線Adafruit19571
マイクロコントローラボード(Arduino Mega 2560 Rev3)DigiKey1050-1018-ND1
PETGフィラメント(2.85mm銀)MatterHackersM-DDH-UZR22
PLAフィラメント(2.85mm黒)MatterHackersM-SEW-RUAW2
PLAフィラメント(2.85mm銀)MatterHackersM-66P-6CLE1
電源 (DC 9V 1A)Newegg9SIBPPKJYR59911
SD / microSDメモリーカード (8GB)Adafruit12941
シールドスタッキングヘッダーAdafruit851
ソリッドコアワイヤ (22AWG赤)Adafruit2881
撚り線 (22AWG黒)Adafruit29761
撚り線(22AWG赤)Adafruit30681
ツイストキャップシッパーチューブボール付き代替デザインTCCN8.5-ST2.5SB38
ボトル(8オンス)代替デザインWB8FS38
カスタム3Dプリントコンポーネントstrong>数量
3DプリントArduinoケースの底N/AARDUINO_Bottom.stl1
3DプリントArduinoケーストップN/AARDUINO_Top.stl1
3Dプリントケーブルクリップ LN/ACLIP_L.stl18
3DプリントケーブルクリップナットN/ACLIP_Nut.stl18
3Dプリントケーブルクリップ RN/ACLIP_R.stl18
3DプリントリッチメーターボトルホルダーN/ALICKOMETER_Bottle Holder.stl19
3Dプリント lickometer ケーブル プロテクター LN/ALICKOMETER_Cable Protector_L.stl6
3Dプリント lickometer ケーブル プロテクター RN/ALICKOMETER_Cable Protector_R.stl12
3Dプリント lickometer lettersN/ALICKOMETER_Letters.stl19
3Dプリント マウント ネジN/Aマウント Screw.stl4
3Dプリントセンサーケース A底部 N/ASENSOR_A_Bottom.stl1
3Dプリントセンサーケース AトップN/ASENSOR_A_Top.stl1
3Dプリントセンサーケース B底部 N/ASENSOR_B_Bottom.stl1
3Dプリントセンサーケース BトップN/ASENSOR_B_Top.stl1
3Dプリントセンサーケース C底部 N/ASENSOR_C_Bottom.stl1
3DプリントされたセンサーケースCトップN / ASENSOR_B_Top.stl1
3Dプリントされたセンサーケースの文字N / ASENSOR_Letters.stl1
3DプリントシッパーブロッカーN/ ASIPPER_Blocker.stl36 3D
プリントシッパーブロッカーベースN / ASIPPER_Base.stl18
3DプリントシッパーブロッカーギアN / ASIPPER_Gear.stl18
3DプリントされたシッパーブロッカーナットN / ASIPPER_Nut.stl18
3DプリントされたシッパーブロッカーウォームN / ASIPPER_Worm.stl18
カットされたリコメーターアクリルパネルN / ALICKOMETER_Acrylic Panel_Sketch.dxf19
静電容量銅ウォーターレーザー

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