方法論記事

2本ボトル選択、ホームケージ飲酒、および微細構造解析を使用したげっ歯類のアルコール消費量のモデリング

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DOI:

10.3791/67486

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2024年11月8日

 ,  , 
1Center for Alcohol Research in Epigenetics, Department of Psychiatry, University of Illinois Chicago

この記事について

サマリー

このプロトコルは、ラットのアルコール消費をモデル化するための標準的な断続的なアクセスの2ボトル選択家庭用ケージ飲用パラダイムを説明しています。さらに、飲酒行動の微細構造分析を可能にするDIYリック検出システムで標準プロトコルを補強するためのステップバイステップの指示を提供します。

要約

2本選択の家庭用ケージの飲酒は、げっ歯類のエタノール消費を研究するために最も広く使用されているパラダイムの1つです。最も単純な形では、動物は2本のボトルを利用でき、1本には通常の水道水が入っており、もう1本にはエタノールが入っており、1日の摂取量は24時間のボトル重量の変化によって測定されます。したがって、このアプローチには特別な実験装置は必要ありません。このような実装の容易さは、前臨床アルコール研究者による広範な採用に最も貢献していると思われますが、このアプローチを使用して取得された飲酒データの解像度は、研究者がボトルの重量を測定する回数(たとえば、1日1回)によって制限されます。しかし、全体的な摂取量、薬理学的介入、およびニューロン操作の文脈で飲酒パターンを調べたいという願望が、個々のリックのレベルでデータを取得できるホームケージリック検出システムの開発を促しました。近年では多くの開発が進んでいますが、オープンソースのLIQ HD(Lick Instance Quantifier Home Cage Device)は、その手頃な価格と使いやすさから、この分野で大きな注目を集めています。このシステムはエキサイティングですが、マウスで使用するように設計されています。ここでは、標準およびリコメーターを装備した2本入りの家庭用ケージの飲用に適した手順を確認します。また、LIQ HDシステムをラットに適応させる方法として、より大きなケージサイズに対応するためのハードウェアの変更や、標準的な既製の飲料ボトルと互換性のある再設計された3Dプリントボトルホルダーなどを紹介しています。このアプローチを使用すると、研究者は、多くのラットの摂取量に加えて、毎日の飲酒パターンを並行して調べることができるため、追加のリソースへの投資を最小限に抑えて、取得したデータの解像度を高めることができます。これらの方法により、研究者は、正確な実験ニーズに応じて、標準的なボトルまたはリコメーターを備えた装置を使用して、アルコール飲酒の根底にある神経生物学的メカニズムを調査する柔軟性を得ることができます。

概要

適度なアルコール摂取は歴史的に中程度の健康上の利点と関連していましたが、最近の大規模な包括的な研究により、アルコール摂取量は安全ではないことが明らかになりました1,2.実際、アルコールの使用は、世界的に死亡と障害の7番目に多い危険因子です1 少量のアルコールを飲む個人は、癌、感染症、および怪我のリスクが高くなります1,3.米国では、2016年から2021年の間にアルコール使用による死亡が約30%増加しました4。重要なのは、死亡や障害のリスクは、消費の増加とともに単調に増加することです1.

ヒトでの研究は、アルコールの使用と誤用の神経生物学に関する貴重な洞察を提供してきましたが、動物モデルによる実験的制御は、飲酒行動の根底にあるメカニズムと大量飲酒のリスクを深く理解するために重要です。これらのモデルは、制御されていない消費を減らすことを目的とした治療法の開発にも役立つツールです。2本入りの家庭用ケージでの飲酒は、げっ歯類のアルコール消費を研究するために最も広く使用されている前臨床パラダイムの1つです。これは、主に、専門的な研究機器や複雑な分析を必要とせずに、自発的なアルコール飲料と嗜好の総測定を可能にするため、実装の容易さによるものです。このアプローチを使用すると、研究者は、飲酒セッションの開始から終了までのボトル重量の変化を計算することにより、希望の間隔(時間、日、週など)で測定値を収集できます。この基本的な方法のバリエーションは、短期間と長期の両方で低から中程度から過量のアルコール摂取を促進するために、この分野の多くの人々によって使用されてきました。例えば、マウス5および<ラットの両方で、それぞれ低レベルおよび中程度のアルコール摂取を促進するために、連続的および断続的な2ボトル選択手順が使用されsup class="xref"6,7,8。同じパラダイムにより、アルコールを好む菌株の高レベルの摂取を促進することができます7,9。あるいは、ダークサイクルの開始から約3時間後から毎日2〜4時間に制限するこの方法の適応は、マウスの大量飲酒(すなわち、暗闇での飲酒)10,11。これらの方法のさらなるバリエーションは、アルコール依存を促進する方法(すなわち、慢性的な断続的なエタノール蒸気曝露)と組み合わせて使用され、離脱中の自発的なアルコール飲酒のエスカレーションを調べるために使用されています12,13,14,15,16,17、18,19.

この分野で広く採用されていますが、ボトルの重量の変化によってアルコール摂取量を測定する標準的なアプローチは、飲酒セッションごとの総消費量に対する解像度が制限されています。その結果、このアプローチでは、アルコール使用障害(AUD)のリスクと重症度の両方に影響を与えることがよく知られている飲酒パターンを捉えることができません20,21,22。実際、個人の経時的な平均摂取量は、いくつかの大量飲酒エピソードまたはそれぞれが比較的低い消費量に関連する多くの飲酒エピソードの結果である可能性があり、これらのニュアンスは、消費が飲酒セッションごとの総摂取量として測定されると検出されません。重要なことは、大規模な飲酒発作(すなわち、飲み込み)に関連する飲酒エピソードは、健康な対照群と比較してAUDの個人で有意に多く観察され23、そしてヒト以外の霊長類のデータは、飲酒履歴の早い段階で大規模な飲酒発作を含むアルコール消費のパターンを確立した個人がAUD22に対して有意なリスクがあることを示唆しています.さらに、大量の消費を含む飲酒エピソードは、AUDの診断21とは無関係に、罹患率と死亡のリスクを大幅に増加させます。全体として、これらのデータは、前臨床モデルにおける全体的な摂取量レベルに加えて飲酒パターンを調べることへの関心の高まりにつながり、個々のリックのレベルで飲酒データをキャプチャできるさまざまな複雑さの多くのシステムの開発を促しました。

最初のものの中には、マウスで使用するために設計されたフォトビームリック検出を備えた2ボトルシステムの開発がありました24。このシステムは、その後、rats25で使用するために別のグループによって適応されました。それ以来、このテーマのバリエーションは、カスタムげっ歯類の飼育に含まれる同様のシステムを開発するために使用されてきました26、社会的に飼育された個々の動物のなめ検出を可能にします27,28、摂食行動と飲酒行動の両方をキャプチャ29。中でも、LIQ HD(Lick Instance Quantifier Home Cage Device)30は、Godnyuckらが開発したシステムの実装の容易さと手頃な価格に匹敵するマウス用システムを提供したとして大きな注目を集めています。24。このシステムは、静電容量式センシングを利用して、フォトビーム検出システムを使用して提供されるシッパーアプローチや相互作用などの間接的な手段とは対照的に、舌と導電性金属シッパーチューブとの間の接触を直接検出します。著者たちは、静電容量式センシングシステムがリック検出の精度と感度が大幅に向上し、リック数とボトル重量の変化との間にはフォトビーム検出よりも強い相関関係が生じることを示すデータを提供しています。著者らはさらに、このシステムを連続アクセスの2ボトル選択式ホームケージ飲用パラダイムと組み合わせて使用し、アルコール飲用微細構造の測定値に加えて、全体的な毎日の摂取量の測定値をキャプチャする能力を示しています30。

ここでは、標準的なアプローチを使用した2本選択式ホームケージアルコールの飲用手順と、リック検出を可能にする方法(図1)について説明します。また、LIQ HD30をラット用に適応させたLIQ HDRの構築と実装の方法も紹介します。これには、より大きなケージサイズに対応するためのハードウェアの変更と、標準の既製ボトルと互換性のある再設計された3Dプリントボトルホルダーが含まれています。これらの方法により、研究者は、実験リソースとデータ収集のニーズに応じて、標準アプローチまたはリコメーター搭載アプローチのいずれかを柔軟に使用できます。

以下は、Simms et al.7から採用された断続的なアクセス2ボトル選択飲酒手順を使用して、家庭用ケージでの飲用をキャプチャするために必要な材料の説明と段階的な指示です。この手順では、ラットは週7日、2本の飲用ボトルに24時間アクセスすることができます。月曜日、水曜日、金曜日(MWF)に、ラットは水(H2O)の入ったボトルとエタノール(EtOH)の入ったボトルを1本受け取ります。これらのボトルは、火曜日、木曜日、土曜日(TRS)に取り外され、2本のボトル入り飲料水と交換されます。ネズミは土曜日と日曜日に同じ2本のボトルの水から水を飲みます。これらの方法は、必要に応じて、エタノールアクセスの代替スケジュール(例えば、連続的、ビンジなど)に対して容易に調整できることに注意してください。標準アプローチとリコメーター装備のアプローチについては、個別の手順が提供されています。

プロトコル

すべての代表的なデータは、イリノイ大学シカゴ校の施設用動物管理および使用委員会の承認を得て、NIHの実験動物の世話と使用に関するガイドラインに従って、単独で飼育された成体のLong-Evansラットを使用して収集されました。各被験者の流体消費量を正確に監視するには、単一のハウジングが必要です。成体の雄(n = 38)および雌(n = 22)のLong-Evansラットは、到着時にP50〜80であり、実験開始の1週間前にビバリウムに順応させることを許された。ラットは、特に明記されていない限り、標準的なチャウ(Teklad 7912、Envigo)と水を自由に利用できました。

1. 実験前の準備

  1. 飲用ボトルにはH2OまたはEtOHのラベルを付けます。次に、各ラットに一意の識別子を付与し、MWF用に1本のH2Oボトルと1本のEtOHボトル、TRS用に2本のH2Oボトルをラベルします
    注:必要に応じて、異なる色のテープを使用してH2OおよびEtOHボトルを識別し、ボトル交換中の潜在的なエラーを回避します。
  2. 実験開始日の1日前にH2Oボトルに飲料水を入れてください。実験開始日の1日前に、190プルーフのEtOHを飲料水(20%v / v)と組み合わせてEtOH溶液を調製します
    注意:変性EtOHは有毒であるため、使用されるEtOHは非変性であることが重要です。
  3. 実験に参加するネズミと同じ棚に空のケージを準備します。このケージは、こぼれの計算に使用されます。
  4. (ステップ3、図2、図3、図4、図5、図6、および補足図1を参照)。
  5. 研究の開始前に、ボトル交換の正確な時刻を決定します。ボトルは、24時間の摂取量の正確な測定値を得るために、毎日同時に交換する必要があります.
    注:以前の研究では、げっ歯類は暗いサイクルの開始後、最も多くの消費を示すことが示されています10,31。したがって、この非常に活発な期間中の摂取量をキャプチャするために(過食症のような飲酒をキャプチャするためのステップ2.3.1を参照)、ボトルの交換はライトが消されてから30〜60分後に行うことをお勧めします。ボトル交換時には赤色のランプを使用して、明暗サイクルを中断することなく視覚化できるようにします。

2. 日常の手続きとメンテナンス

  1. 実験の初日に、次の操作を行います。
    1. ケージから標準的なウォーターボトルを取り出します。
    2. オプション: ネズミは餌を探しているときにケージの上部を押しつぶすことがよくありますが、空のこぼれケージでは修正できないこぼれが発生する可能性があります。ケージ内にフードカップを使用することで、この懸念を軽減できます。使用する場合は、ここでケージの上部から食べ物を取り出し、ケージの内側にフードカップを追加し、チャウを入れます。ラットに割り当てられた床面積が、ラットケージのサイズとフードカップのサイズに基づく機関のガイドラインを満たしていることを確認します。
    3. 必要に応じて、研究担当者が実験期間中、食料と水を提供することを介護および飼育スタッフに示してください。
    4. ケージの変更は、データ収集の中断を招く可能性があります。ケージ交換は、体重測定と並行して行います。これを行うことを選択した研究者は、それに応じてケアスタッフと畜産スタッフに通知する必要があります。
  2. その後の日は、以下に概説する手順に従ってください
    注意: ケージやボトルを動かすと、こぼれる可能性があることに注意してください。したがって、動きに優しく、ネズミのケージに使用されるのと同じ方法でこぼれケージにボトルを取り付けたり取り外したりすることが重要です。
    1. ボトル交換時間より前に部屋に入り、以下の手順を実行するのに十分な時間を確保し、適切なセッション開始時間に新しいボトルをケージに置きます。
    2. フィルタートップをケージから取り外します。MWF の場合は、手順 2.2.3 に進みます。TRS の場合は、ステップ 2.2.4 に進みます。
    3. 月曜日、水曜日、金曜日に、ケージトップからTRSボトルを取り外してください。MWFボトル(1つのEtOHと1つのH2O)を秤量します。今日の飲酒セッションのボトルの開始重量を記録します。必要に応じて、ケージトップまたはフードカップに追加のフードを提供します。指定されたセッション開始時間に、ラットがボトルラベルを噛まないように、テープを上に向けて各ラットのケージトップにボトルを置きます
      注:通常、TRSの水消費量は記録または報告されませんが、研究者は、必要に応じてステップ2.2.3およびステップ2.2.4で後述するように、ボトルのオンとオフの重量を取得することにより、これらのデータをオプションで収集できます。EtOHボトルの側面は、消費データを誤って歪める可能性のある潜在的な側面の好みの発生を避けるために、各飲酒セッションの後に交互にする必要があります。
      1. オプション:以前の研究では、多くのラットが飲酒セッションの開始時に過飲症のような飲酒を示すことが示されています8,32,33。この時間帯に大量飲酒を捕らえているほとんどの研究者は、飲酒セッションの最初の30〜60分間に摂取したと報告しています。この潜在的なビンジエピソード中に摂取データを取得するには、以下に説明する手順に従ってください。
      2. ボトルが最後のケージに適用された後にタイマーを設定します。時間内は邪魔されずに部屋を出てください。
      3. タイマーが鳴ったら部屋に再度入り、EtOHボトルとH2Oボトルを取り外し、ボトルの重量を記録します。EtOHおよびH2Oボトルをケージに戻します.
        注:この手順は、リック検出が装備されているシステムを使用している場合、ビンジエピソードをキャプチャするためには必要ありません。
    4. 火曜日、木曜日、土曜日は、開始時刻から24時間後に対応する指定されたセッション終了時間にMWFボトルをケージから取り出します。各ボトルの重量を量り、MWF飲酒セッションのボトルの最終重量を記録します。各ラットの体重を取得して記録します。必要に応じて、ケージトップまたはフードカップに追加のフードを提供します。ラットがボトルラベルを噛まないように、テープを上にして各ラットのケージトップにTRS H2Oボトルを置きます。.
    5. フィルタートップをケージに戻し、動物室を出ます.
      注:オプションで、蒸発を防ぐためにEtOHボトルシッパーを覆います。ケージ交換が研究担当者によって行われている場合は、TRS業務中にこのタスクを実行するために週に1日を指定してください。体重を得たら、各ラットを清潔なケージに入れます。
  3. 施設の動物の世話と飼育の手順に従って、毎週または隔週でボトルを洗い、水分をリフレッシュしてください。これらの職務は、飲酒の中断を許さないように心がけてください。例えば、TRS H2Oボトルは、MWFで取り外した後、洗浄して補充することができます。同様に、MWF H2OおよびEtOHボトルは、TRSで取り外した後に洗浄して補充できます。

3. 2本選択実験中の舐め検出

注:高解像度の飲酒データを取得することに関心のある研究者は、ボトルにリック検出機能を追加することで、上記の手順を変更できます。LIQ HD30は、マウスでこのタイプのデータ収集を可能にする低コストのDIY(Do-It-Yourself)システムです。以下に概説する手順では、LIQ HDをラットでの使用に適合させるために必要な変更について説明します(LIQ HDRと呼ばれます)。1つのリック検出システムを構築するために必要なすべての商業的に販売およびカスタム3Dプリントされた部品のリストについては、Table of Materialsを参照してください。これにより、最大18匹のラットの2ボトル選択データをキャプチャできます。3Dプリントの.stlファイルと手順は、著者のWebサイト(www.ejgloverlab.com/3dprints)にあります。

  1. 静電容量センサーユニットのセットアップ
    注:各LIQ HDRシステムは、3つの静電容量式センサーユニットで構成されており、18匹のシングルハウスラットに対応する36本のボトルから並列にリックデータをキャプチャします。各センサーユニットは、1つの差動I2C通信ブレークアウトボードと1つの12キー静電容量センサーボードで構成され、各リコメーターごとに色分けされた6組の2ピンケーブルを介して6つの別々のケージからリコメーターに接続します(図2A)。
    1. 図 2B に示すように、3 つの静電容量センサーユニットすべてを構築するために必要な材料 と必要なはんだ付けツールを収集します。
    2. センサーユニットAの構築を開始するには、2ピンのメスコネクタケーブルを7インチの長さの赤い熱収縮チューブで覆い、その赤と黒のワイヤーの端をセンサーボードのピン#0と#1に挿入します(図2C-1)、所定の位置にはんだ付けします(図2C-2)。ケーブルが重なって記録が中断される可能性なしに、ケージをビバリウム内で左から右に番号順に配置するために、ケーブルがセンサーボードの前面にあることを確認してください (ステップ 3.6 および 図 6) を参照してください)。
    3. さらに5本のケーブルをはっきりとした色の熱収縮チューブで覆い、図のようにピン#2-11にはんだ付けします(図2C-3)。すべての赤いワイヤーが偶数番号のピンにはんだ付けされていることを確認して、左側のすべてのボトルに接続し、すべての黒いワイヤーが奇数番号のピンにはんだ付けされていることを確認してください。
    4. はんだ接合部を保護のために、すべての側面をホットグルーで覆います(図2C-4)。コネクタに番号順にラベルを付け、各リコメータに固有のIDを提供します(図2C-4)。
    5. センサーユニットAを組み立てるには、センサーボードAを50mmの4ピンケーブルで通信ブレークアウトエンドポイントに接続し、エンドポイントを5Vから3Vへのレバーシフターの3.3V出力に100mmの4ピンケーブルで接続します(図2D-1)。センサーボードと通信ブレークアウトボードの両方に2つの同一の4ピンコネクタがありますが、3Dプリントされたセンサーケースと推奨されるビバリウムセットアップを使用するためには、配線が示されているとおりであることを確認することが重要です（図2D-1および図2F)））ステップ3.6および図6を参照)。3Dプリントされたケース内のハウスセンサーユニットA（図2D-2)。レベルシフターケーブル(図2D-3)をつぶさないように注意しながら、上部を静かに閉じます。
    6. センサー・ボード B と C の I2C アドレスを変更するには、示されているように ADDR ピンから 3Vo または SDA ピンにジャンパー・ワイヤをハンダ付けします (図 2E)。
    7. 色分けされた6本のメスコネクタケーブルを、ボードAと同じ順序でセンサーボードBとCにはんだ付けし、各コネクタに対応するリコメータID番号をラベル付けします。ボード B を通信ブレークアウト MidPoint に接続し、 C を 50 mm 4 ピンケーブル (図 2F) で EndPoint に接続します。
    8. センサーユニットBとCをそれぞれの3Dプリントケースに収めています。3つのセンサーユニットすべてをイーサネットケーブルでデイジーチェーン接続して、センサーのセットアップを完了します（図2G)。
  2. マイクロコントローラインターフェースの設定
    注:LIQ HDRマイクロコントローラインターフェース(補足図1A)は、LIQ HD30で説明したものと同じですが、非常に小さな変更が加えられています。以下で説明する手順は、手順 3.2.6 と 3.2.8 で説明した変更を使用してインターフェイスを設定するために必要な手順の一般的な概要を示しています。研究者は、著者のGitHubページで提供されているオリジナルのプロトコルとビデオチュートリアルを参照し、より詳細なステップバイステップの手順を参照してください30。
    1. マイクロコントローラインターフェースの構築に必要な材料とはんだ付けツールを収集します(補足図1B)。タッチシールドの裏側(補足図1C-1)で、バックライトはんだ付けパッド(補足図1C-2)を横切ってはんだジャンパーを作成します。
    2. データロギングシールドの裏側で、CSピンのジャンパパッドトレースを切断します(補足図1D-1)。データロガーの前面で、CSピンからピン#7に短いジャンパー線をはんだ付けします(補足図1D-2)。
    3. シールドスタッキングヘッダーを取り付けるには、まずタッチスクリーンシールドの背面にヘッダーを積み重ねます(補足図1E-1)。データロガーをタッチスクリーンに積み重ね、テープを使用して安定させ、すべてのヘッダーピンをデータロガーにはんだ付けします(補足図1E-2)。次に、タッチスクリーンを取り外します。
    4. 残りの2 x 3ヘッダをマイクロコントローラにスタックし(補足図1F-1)、次にデータロガーをマイクロコントローラにスタックしてから、ヘッダピンを所定の位置にはんだ付けします(補足図1F-2)。
    5. コイン電池をデータロガーに挿入します(補足図1G-1)。タッチスクリーンをデータロガーに積み重ねます(補足図1G-1)。microSDカードとそのアダプターをデータロガーに挿入します(補足図1G-2)。
    6. 追加のアース線を作成するには、ジャンパー線から 1 つのオス コネクタを切り取り、端を ~1/4 インチに剥がします (補足図 1H-1)。被覆を剥がした単芯線のストランドをジャンパー線にはんだ付けし、はんだ接合部を熱収縮チューブで覆います(補足図1H-2)。
    7. 4ピンジャンパー線と追加の接地線をマイクロコントローラ(黒-GND、赤-5V、黄-ピン#21、青-ピン#20、補足図1I-1)に差し込みます。ホットグルーで接続を固定します(補足図1I-2)。必要に応じて、ジャンパー ワイヤを熱収縮チューブで包みます (補足図 1I-2)。
    8. 完全に組み立てられたマイクロコントローラインターフェースを3Dプリントケースに収納し、上部の開口部に4ピンジャンパ線とアース線を通します(補足図1J)。
    9. マイクロコントローラインタフェースソフトウェアのインストール30の元のプロトコルに従ってください。
  3. LIQ HDRリコメーターの構築
    注:ボトルを保持するカスタム3Dプリントは、シッパーチューブの直径が8mmの標準的なげっ歯類の飲料ボトルで使用するように設計されています(材料の表、図3Aを参照)。このボトルホルダーは、同様のボトルやシッパーチューブでの使用に容易に適合させることができますが、わずかな変更または変更を加えません。
    1. 1つのリコメーターを作るのに必要な材料、3Dプリント、はんだ付けツールを集めます。これは図3Bで示されています。各LIQ HDRシステムは、36本のボトルに対して最大18個のリコメーターを収容できることに注意してください。
    2. オスコネクタケーブルを延長するには、両端を~1/4インチの長さに剥がし、延長する黒と赤のワイヤ(図3C-1)も剥がします。
    3. 延長線をコネクタケーブルにはんだ付けし(図3C-2)、はんだ接合部を熱収縮チューブで覆います(図3C-3)。オスコネクタケーブルを、センサーユニットの対応するメスコネクタケーブル(図3C-4)と色が一致した熱収縮チューブで覆います。
    4. センサーボードの配線(図2)と一貫性を保つために、赤と黒のワイヤーをボトルホルダーの左右の内部ケーブル通路にそれぞれ通します(図3D-1)。
    5. 各ワイヤを1 3/4インチの導電性銅テープ(図3D-2)の最後まではんだ付けし、銅テープを半分に折ります(図3D-3)。
    6. 銅テープをはがし、一対の鉗子を使用してシッパーブラケット(図3E-1)内で慎重に操作してから、シッパーブラケットの内壁にしっかりと接着します(図3E-2)。示されているように、銅テープのはんだ面がボトルホルダーの正中線に近い壁に接着されていることを確認してください（図3E-2)。シッパーチューブをブラケットに押し込み、テープを壁にしっかりと押し付け、ブラケットを下塗りします。
    7. 銅テープのはんだ面を補強するために、 これは接着性が低く、剥がれやすいので、 はんだ接合部にホットグルーを少し塗布します (図 3E-3)。接着剤を塗って、銅テープと3Dプリントの隣接する露出部分の両方を覆います（図3E-4)。
    8. ケーブルをケーブルプロテクターの内部通路に通します(図3F)。推奨されるビバリウム設定を使用するためには、各リコメーターに適切なケーブルプロテクター (左向きまたは右向き) を選択してください (ステップ 3.6 と 図 6) を参照してください。"注: リコメーター 5-6、11-12、17-18 は、現在のセットアップでは青色または紫色のケーブルで示されていますが、左向きのケーブルプロテクター (図 4D-1) が必要です。 一方、他のすべてのリコメータは、右向きのケーブルプロテクタを必要とします（図4D-2)。
    9. ケーブルクリップを取り付けるには、まずケーブルクリップの半分の溝に1本のワイヤーをはめ込みます(図3G-1))、次に残りの半分を2番目のワイヤーに取り付けてから、ナットで両方の半分をしっかりと閉じます(図3G-2)。
    10. オスコネクタに対応するリコメーターID番号(図3H)をラベル付けします。18個のリコメーターがすべて構築されるまで、これらの手順を繰り返します。
  4. LIQ HDRリコメーターのインストール
    注意: LIQ HDRは、金属線の上部(図4A-1)を備えた標準のシューボックスラットケージに取り付けるように設計されています。
    1. ボトルホルダーを収容するために、ワイヤーケージの上部に中心間距離が~75mmの2対のロッドを特定します。ペンチを使用して、シッパーの開口部の周りの金属棒を少し開きます。シッパーとケージトップとの間の金属同士の接触を防ぐために、これらのロッドを電気テープで絶縁します（図4A-2).
      注:電気テープはラットがアクセスできないため、噛むことはありませんが、研究の終了時に廃棄し、研究間で再利用しないことをお勧めします。
    2. lickometerと1/8インチの厚さのレーザーアクリルパネルをケージの上部に2セットのM5ネジとナット(図4B)で取り付けます。リコメーターとアクリルパネルのシッパー開口部が揃っていること、およびシッパーがケージトップのどの部分にも接触していないことを確認してください。
    3. ケーブルクリップをワイヤーケージトップの最も外側のロッド(直径~4 mm)に固定します(図4C)。必要に応じてケーブルクリップを調整して、ケージの上部がケージの下部にぴったりと収まっていること、および過度の張力でケーブルが引っ張られたり曲がったりしていないことを確認します。各リコメーターに正しいケーブルプロテクタが使用されていることを確認してください（図4Dおよびステップ3.8.8を参照)。
    4. 必要に応じてシッパーチューブを調整して、シッパーがキャップから~2cmだけ伸びるようにします（図4E-1)。ボトルを取り付けるには、シッパーチューブをボトルホルダーのシッパーブラケットに通して止まるまで挿入します(図4E-2)。シッパーチューブの先端だけがアクリルパネルを超えて伸びている必要があります（図4E-3)です。ラットがシッパーチューブに触れたり遊んだりするなど、非完全な行動による偽陽性の舐めを避けるためには、シッパーチューブの他の部分が露出していないことが重要です。フィルタートップは、ケーブル自体を邪魔することなく、ワイヤーケージトップとケーブルクリップにぴったりと置くことができる必要があります（図4F).
      注:より厚いアクリルパネルまたは複数の1/8インチパネルのスタックを使用して、シッパーチューブがケージ内にさらに伸びる必要がある実験のために、より長い長さのシッパーチューブを完全に囲むことができます。
  5. シッパーブロッカーのインストールと使用
    注:シッパーブロッカー(図5A)は、ボトル交換中のラットによるシッパーへのアクセスを制限し、各飲酒セッションの開始時に正確なリコメーターのキャリブレーションを確保するように設計されています。
    1. 3D プリントされた部品と M5 ネジ、ナット、ワッシャーを 1 つのシッパーブロッカーに集めます (図 5B に示すように)。
    2. SIPPER_GearをSIPPER_Baseに挿入します (図 5C-1)。SIPPER_Gearが 3D レンダリング インセットに示されているとおりに向き合っていることを確認します。SIPPER_Base上部の開口部にSIPPER_Wormを挿入します。ヘッドがベースと同じ高さになるまで挿入しながら、ウォームを時計回りに回します(図5C-2)。
    3. SIPPER_Nutをベースの底からワームの端にねじ込みます (図 5C-3)。鉗子を使用してナットを締めながら、ウォームダイヤルを回します。SIPPER_Blockersの丸くて細いネックをギアのスロットに挿入します(図5C-4)。
    4. 組み立てたシッパーブロッカーをM5ネジセット(図5D)を使用してケージの上部に取り付けます。両方のシッパーブロッカーがシッパーの開口部と揃っていることを確認してください。
    5. シッパーへのアクセスをブロックするには、ワームダイヤルを時計回りに回して、ブロッカーがシッパーの開口部を完全に覆うまでブロッカーを下げます (図 5E)。
    6. シッパーにアクセスできるようにするには、ブロッカーがケージの上部に対して垂直な位置に来るまでダイヤルを反時計回りに回します (図 5F-1)。ヘッドがワイヤーケージの上部のすぐ下に来るまで、各ブロッカーアームを手動で引き上げます。ブロッカーを90°回転させて、ヘッドがケージ上部の金属棒と平行になり、アームが所定の位置に固定されるようにします（図5F-2)。両方のブロッカーがケージの上部より上に上がり (図 5F-3)、シッパーが完全にアクセス可能になるまで (図 5F-4) まで、ダイヤルを反時計回りに回し続けます。
  6. vivarium
    でのLIQ HDRシステムの使用 注:次のビバリウムセットアップは、18の標準シューボックスラットケージに接続された単一のマイクロコントローラーインターフェースを使用して、2本のボトル選択の飲酒をキャプチャするように最適化されています。マイクロコントローラインターフェース、センサユニット、および各種ケーブルを含むすべての電子部品は、ケージを保持する壁に取り付けられた金属ワイヤシェルフに固定されています（図6A)。動物施設やユーザーのニーズに適応するために、いくつかの変更が必要になる場合があります。
    1. カスタム3Dプリントされた取り付けネジ(図6B)を使用して、各センサーユニットをビバリウムシェルフに取り付けます。不必要なケーブル張力を避けるために、各センサーユニットが黄色のリコメーターでケージの真下に取り付けられていることを確認してください（図6A)。
    2. 各メス・コネクター・ケーブルは、互いに重なったり、はんだ端で過度に曲がったりしないように配置して固定します。これにより、リック検出が不十分になる可能性があります (図 6B)。金属棒の棚付けが使用されれば、これは図のように棚の別の棒にコネクター ケーブルをケーブルで結ぶことによって容易に達成することができる。
    3. 同じ3Dプリント取り付けネジを使用してセンサーユニットAの隣にマイクロコントローラインターフェースを取り付け、その4ピンコネクタをセンサーユニットAに接続された5Vから3Vへのレベルシフターの5V入力ポートに差し込みます(図6C)。
    4. 電気テープを使用して、追加のアース線を金属製のシェルフなどのアース源に固定します (図 6D)。
    5. ケーブルのオーバーラップと張力を最小限に抑えるために、Figure 6A の描写に従って、取り付けられたリコメーターの色と ID に基づいて各ケージを配置します。
    6. すべてのオス型リコメータコネクタケーブルを、対応するメス型センサコネクタケーブル(図6E)にしっかりと接続します。電源を接続して、マイクロコントローラインターフェースをオンにします(図6F)。
    7. メインの GUI (グラフィック・ユーザー・インターフェース) ページ (図 6G) で、設定記号をタップして設定ページを開きます。ユーザーは、照明のオンとオフの時間を変更して、ダーク・サイクルが始まるとインターフェースの表示が自動的に暗くなるようにすることができます (図 6H-1)。
    8. 「センサー設定の編集」(図6H-1))をタップして、「タッチしきい値」を8に、「リリースしきい値」を2に調整します。これにより、現在の設定(図6H-2)を使用すると、ラットに対して最も一貫したリック検出が可能になることがわかっています。ただし、現在のシステムに何らかの変更が加えられた場合は、ユーザーが別の設定を試す必要があることに注意してください。
    9. データが 24 時間以下の期間でのみ収集される場合は、自動キャリブレーション のチェックを外します (図 6H-2)。

4. 舐め検出を使用した2本選択家庭用ケージ飲酒の日常手順

  1. 標準的な2本ボトル選択手順のステップ2で概説した手順に従って、以下の変更を加えます。
  2. 月曜日、水曜日、金曜日に、MWFボトルを装着する前に、シッパーブロッカーを使用してすべてのケージのシッパー開口部を覆います(ステップ3.5.5および図5Eを参照)。
  3. 記録する前に、メイン GUI ページで正しい Experimental Side を選択し、 これはその日の EtOH ボトルの側面になります (図 6G)。
  4. すべてのMWFボトルを取り付けた後、メインページ(図6G)でSTART!をタップしてセンサーのキャリブレーションを開始します。その間、ユーザーはシステムから一歩離れて、ネズミがシッパーを舐めていないことを確認することをお勧めします（図6I-1)を確認してください。キャリブレーションは完了するまでに数秒かかり、その後、システムはメインの記録ページに入り、各リコメーターの各ボトルの累積リック数が表示されます（図6I-2)が表示されます。
  5. すべてのシッパーブロッカーをケージトップより上に上げて、シッパーにアクセスできるようにします (ステップ 3.5.6 と 図 5F を参照)、説明に従ってすべてのフィルタートップを静かに戻し (ステップ 3.4.4 と 図 4F を参照)。
  6. 「更新」をタップすると、画面上のリック番号が更新されますが、これはそれ自体ではリアルタイムで更新されません (図 6I-2)。
  7. 火曜日、木曜日、および土曜日には、「保存して終了」をタップして録音を停止し、MWFボトルを取り出す前にメインページ(図6I-2)に戻ります。
  8. データ転送のためにSDカードを取り外すには、SDカードを抜く前にSDの取り出しをタップします（図6G)）。SDカードを任意のコンピュータに挿入し、ボトルのON日付にちなんで名付けられた.csvデータファイルをコピーしてそのコンピュータに貼り付けます（図6K)に貼り付けたりします。次の録音のためにSDカードを再マウントするには、カードをインターフェースに挿入し、SDのマウントをタップします(図6J).
    注:データファイルは毎日バックアップすることをお勧めします。
  9. 体重測定は、動物モデルおよび動物使用プロトコルと互換性がある場合は週に1回に制限し、リコメーターとセンサーへの不必要な妨害を最小限に抑えるために、ケージ交換に指定された日にこのタスクを実行することをお勧めします。ケージを移動する前に、対応するメスセンサーケーブルからすべてのオス型リコメーターケーブルを抜いてください。各ラットの体重を量った後、ラットを清潔なケージに戻します。リコメーターを新しいケージトップに移し、必要に応じて各リコメーターを対応するセンサーに再接続します。
  10. 介入の効果をテストする実験の場合(例:.、薬物注射)EtOHの摂取と飲酒の微細構造に対して、可能な限り飲酒セッションの開始前にそのような介入をスケジュールします。.これが不可能な場合、研究者は Pause (<strong class="xfig">図 6I-2) をタップして Lick 検出を中断し、介入が完了した後に Resume をタップしてデータキャプチャを再開することができます。介入前後のEtOH摂取量の変化を捉えるため、またケージトップを取り外して動物にアクセスするときに発生する可能性のあるこぼれを説明するために、飲酒セッションの各一時停止中にボトルの重量を収集することをお勧めします。
  11. 研究の最後には、動物間の汚染物質の感染を制限するために、新しい動物に使用する前に、ケージ内のすべてのコンポーネントを徹底的に消毒する必要があります。リコメーターに70%EtOH溶液を優しくスプレーして拭き取り、内部の電気部品を壊さないようにすることをお勧めします。シッパーブロッカーとアクリルパネルは温かい石鹸水で洗うことができます。

5. データ分析

  1. 依存的な測定値を評価する前に、毎日ボトルを交換した結果として必然的に発生するこぼれの正しい摂取データを確認してください。これを行うには、研究期間全体にわたって、こぼれケージ上のEtOHおよびH2Oボトルのボトル重量の変化を平均
    2. 化します。
  2. 各ボトルの平均から 2 標準偏差より大きい値を除外します。これらの外れ値を除外した後、動物を含むケージのボトルから得られたEtOHおよびH2Oボトル重量の変化から計算された平均を差し引きます。この量を差し引くことにより、研究者は、特定の溶液の流出に起因する平均損失が消費量の尺度で考慮されていないことを確信できます。平均こぼれ量を差し引くと、場合によっては一部の動物にとってマイナスの値になる場合があります。これらをゼロに変換し、そのソリューションの摂取量がないと解釈します。
  3. 2本選択飲酒実験の主な依存性尺度は、EtOH摂取量(g / kg)と好み(%)です。.EtOHボトル重量(g)の変化から摂取量を計算し、次の手順で体重(kg)に正規化します。
    1. ボトルの重量 (g) の変化を容量 (mL) の変化に換算するには、次の式を使用します :
      figure-protocol-1
      純粋なエタノールの密度は0.789 g / mLです。したがって、20% EtOHの寄与密度は0.1578 g/mLです。H2Oの重量は1 g / mLです。したがって、寄与密度は80%H2O = 0.80 g / mLです。したがって、20% EtOH 溶液 (v/v) の各 mL は、0.1578 (EtOH) + 0.80 (H2O) = 0.9578 g/mL で構成されます。したがって、20%(v / v)のEtOH濃度を使用した場合の最終式は次のとおりです:
      figure-protocol-2
    2. 以下の式を使用して、消費されるエタノールの投与量を計算します。摂取量データと同じ週に得られた体重を使用して、動物の体重で消費されたエタノールを計算します.
      figure-protocol-3
    3. 次の式を使用して選好を計算します:
      figure-protocol-4
  4. マウスの対応物30と同様に、LIQ HDRは、リック時間、試合番号、試合時間、試合リック数、試合リック時間など、さまざまな飲酒微細構造変数をキャプチャします(図6K)。飲酒試合は、1秒未満で少なくとも3回の舐めから始まり、追加の舐めなしで3秒が経過した後に終了する一連の舐めとして定義されます。これらの測定値は、その後、平均個々のリック時間、平均個々の試合時間、試合ごとの平均リック数、平均リック頻度、推定インターリックインターバル、および推定インターバウトインターバルを計算するために使用できます
    注:マイクロコントローラインターフェースは、これらの微細構造データを1分間の分解能で.csvファイル(図6K)で提供します。研究者は、オリジナルのLIQ HDプロトコル30または好みの後処理プラットフォームに付属の分析アプリを使用して、研究ニーズに応じてデータを照合および要約できます。微細構造データは通常、マクロレベルで平均差を比較するために24時間全体にわたって合計されるか、明暗サイクル全体で飲酒パターンの変動を調べるために30分から1時間のビンで合計されます。

結果

標準的な断続的2本ボトル選択法によるホームケージ内エタノール摂取データ
標準的手順（図7A）を用いることで、研究者は24時間の摂取量（図7B–D）を記録できるほか、飲酒セッション開始直後にボトルの重量を測定すれば、一気に大量飲酒のような行動も捉えることができる（図7E–F）。エタノール摂取量を水の摂取量に対して相対的に計算することにより、測定したすべての時点における嗜好性データも得られる（図 7D、F）。図7Cに示されているように、ラットは2本ボトル選択法による摂取開始後数日間にわたり、エタノール摂取量が増加する傾向を示すことが多い。その後、摂取量が比較的安定したプラトー期に入る。このパターンは雄ラットでは一貫して観察されるが7、32、33、34、35、36、雌ラットでは必ずしも見られない。代わりに、いくつかの研究では雌ラットにおいて実験期間を通じてエタノール摂取量が安定していると報告している37、38。さらに、アクセス期間が長期にわたると、エタノール摂取量がさらに増加する可能性を示唆する研究もある36、39。個体間での1日の摂取量は大きく変動する可能性がある。しかし、アルコール研究で最も一般的に用いられる系統については、平均的な1日あたりの摂取量がよく特徴づけられており、群としてのデータを評価する際の成功のベンチマークとして利用できる7、8、33、34、35、39。

図7Eに示すように、多くのラットは飲酒セッション開始直後に1日あたりのエタノール摂取量の著しい部分を消費する。8,33 このような一時的な大量飲酒様のエタノール摂取パターンは、水に対するエタノールの著しい好嗜性とよく関連している（図7F）。しかし、24時間の好嗜性が50%を超えない場合でも、研究者は驚くべきではない。これは特に系統が多様なラットやエタノールを好まないげっ歯類系統、および2本ボトル選択法による摂取期間が比較的短い研究において当てはまる7,32,33,35,37。

2本ボトル選択飲水マイクロ構造解析におけるLIQ HDRの検証
LIQ HDRシステムを標準的なラットの2本ボトル選択パラダイムに追加することで、研究者は取得した飲水データを用いて摂取量を正確かつ精密に予測できるようになる。これは、エタノール（EtOH）（R2 = 0.7789、F(1,113) = 398.1、p < 0.0001）および水（H2O）のボトル（R2 = 0.7910、F(1,117) = 442.9、p < 0.0001）について、24時間にわたる検出された累積なめ回数とボトルの重量変化との間に強い有意な相関が存在することによって確認された（図8A）。これは、ラットが2本のH2O入りボトルを与えられた日についても同様に成り立つ（R2 = 0.8875、F(1,188) = 1484、p < 0.0001；図8B）。

LIQ HDRは、標準的な2本ボトル選択パラダイムでは得られない高い時間分解能で飲水パターンを正確に解析することを可能にする。この手法を用いることで、研究者は異なる溶液間、明暗サイクルを通じて、性別間、薬物群間などにおける飲水パターンの差異を検討する機会を得る。たとえば、平均ライクスを30分間隔でビニングすれば、24時間の平均飲水パターンを容易に解析できる。予想される通り、この解析により、エタノール（EtOH）およびH2Oは、ラットが通常睡眠している明期よりも、ラットが起 awake している暗期に多く観察される（図8C）。同様のアプローチを用いることで、研究者は飲酒様式における群間の差異を検討することができる。例えば、エタノール（EtOH）摂取時の平均ライクス数を比較することにより、雄と雌のラット間での飲酒マイクロ構造を比較できる（図8D）または水（図8E）を24時間の期間にわたって測定する。フロントローディングおよび／または乱飲様飲酒行動を検討するため、研究者は解析の分解能を高め、セッション開始直後に発生する飲酒行動に注目するために、より小さな時間区間（bin）を用いてデータを要約することができる。この方法により、24時間の期間内に複数回のボトル重量測定を行うことなく、乱飲様の飲酒期間を検討することが可能となる。図に示すように、 図8C （内挿図）この解析により、セッション開始後30分時点でボトルの重量測定によって得られた飲酒量の大部分が、30分間の期間全体にわたり均等に分散しているのではなく、最初の5分間に集中して発生していることが明らかになった。このようなデータは、血液中エタノール濃度（BEC）を測定するための採血に最適な時間点を特定する際に役立つ。実際、別の飲酒日においても同様の初期集中型飲酒パターンが観察されており、その際には15分という短時間間隔で高分解能の飲酒パターンが記録された。図8F）。このセッション中に記録された平均舔舌回数は、ボトルの重量変化を確実に予測した（EtOH：R2 = 0.6316、F(1,10) = 17.15、p = 0.0020；H2O：R2 = 0.8601、F(1,10) = 61.47、p < 0.0001; 図8G）。さらに、セッション開始後15分で採取した血液サンプルから得られたBECは、検出された舌舐め回数と良好な相関を示した（R2 = 0.4327、F(1,10) = 7.627、p = 0.0201； 図8H）エタノール（EtOH）の摂取量が比較的少ない場合でも。

LIQ HDRは、飲酒セッション中にリアルタイムで検出および計算される飲酒マイクロ構造のさまざまな測定値を記録し、1分間隔のビンにlick検出と同様に保存する図6K）。これらの測定法は手順5.4で簡単に概説されており、以前に定義されている。30研究者は、個々の飲水マイクロ構造の変化について詳細な解析を行い、飲水パターンが全体の摂取量の差異にどの程度、どのような形で寄与しているかを検討することができる。たとえば、雄と雌のラットは、舌舐め回数、飲水エピソード数、およびエピソード持続時間において類似していることがわかった（図9A-Ｃ）飲料水を与えた場合、全体的な摂取量（g/kg）は、女性の方が男性よりも高かった（t検定；t=2.882、df=10、p=0.0163； 図9D）。これは体重に性差があるためであり、同数の舐め取り回数では、雄よりも雌の方が体重比の摂取量が高くなることを促進する。興味深いことに、これはエタノール（EtOH）摂取の微細構造パターンにおける性差の比較とは対照的である。後者の比較では、同程度のEtOH摂取量に伴って、類似した飲酒微細構造が示された。図9E-Ｈ）。これらのデータは、水に対するしゃっかん量は両性で類似しているものの、エタノール（EtOH）に対するしゃっかん量は雄に比べて雌ラットで小さいことを示している。以上の微細構造的データは、家庭ケージ環境下での自発的飲水戦略が、摂取する液体の種類に応じて雄ラットと雌ラットとで異なる可能性があるという考えを支持している。これまでの研究でも、液体の種類に依存した飲水戦略における性差が報告されている。40,41ただし、これらの研究で観察された差異は水分摂取量に限られるものではなかった。飲酒歴の長さが研究間の差異に影響を与える可能性があり、本データセットでは2本瓶選択法による飲酒期間が5週間に限定されていたのに対し、先行研究では12週間を超えていた。40,41.

figure-results-1
図1：二本瓶選択法によるホームケージ内飲水測定。（A）研究者は、ボトルの重量変化に基づいてエタノール摂取量および水に対する嗜好性（相対的選好）を、標準的な手法を用いてホームケージ内で自発的に測定することができる。（B）LIQ HDRを用いることで、ラット用に設計された低コストのDIYホームケージ内リック検出システムにより、標準的な二本瓶選択法と同様の測定値を得ることができると同時に、記録期間全体にわたり高分解能の飲水マイクロ構造を取得することが可能になる。この図の拡大版をご覧になるには、こちらをクリックしてください。

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図2：容量性センサー・ユニットの構築。（A）電子部品と配線図。（B）1台のLIQ HDRシステムを構築するために必要な、3つの容量性センサー・ユニットの作成材料。（C）ケージ#1～6用の2ピンメスコネクターケーブルを基板Aのピン#0～11に半田付けし、ホットグルーで半田接合部を固定する。カラーコードケーブルには色付きの熱収縮チューブを使用し、それぞれに一意のリコメーターID番号をラベル付けする。（D）基板Aと5Vから3Vへのレベルシフターを、4ピンケーブル（1）で差動I2C通信ブレークアウトエンドポイントに接続し、基板Aと通信ブレークアウトを3Dプリントされたケース（2～3）に収める。（E）基板BとCのI2Cアドレスを変更するために、それぞれADDRピンから3VoピンおよびSDAピンへジャンパーワイヤーを半田付けする。（F）2ピンメスコネクターケーブルをセンサー基板BおよびCに半田付けし、対応するリコメーターIDでラベル付けした後、基板Bを通信ブレークアウトミッドポイントに、基板Cをエンドポイントに4ピンケーブルで接続する。（G）センサー・ユニットBおよびCをそれぞれの3Dプリントされたケースに収め、イーサネットケーブルで3つのユニットをデイジーチェーン接続する。この図の拡大版をご覧になるには、こちらをクリックしてください。

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図3：LIQ HDR リッコメーターの構築。（A） ケージ内部品の3Dレンダリング図。（B） 1台の2本ボトル式リッコメーターをセットアップするための材料。1台のLIQ HDRシステムは18台の2本ボトル式リッコメーターに対応できることに注意。（C） 2ピンメスコネクターケーブルの長さを黒と赤のワイヤーで延長し、ヒートシュリンクチューブで色分けする。（D） 黒と赤のワイヤーをボトルホルダーの左（L）および右（R）の開口部（1）を通して通し、その端を銅テープ（2-3）に半田付けする。（E） 銅テープをストロー金具の内壁（1-2）に貼り付け、ホットグルー（3-4）で補強する。（F） ケーブルをケーブルプロテクターを通して通す。（G） ケーブルクリップを取り付ける。（H） コネクターに該当するリッコメーターのID番号をラベル付けする。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図4：リクタメーターの設置。（A） メタルケージの天板にあるスポウト開口部周囲の金属棒を、電気テープで絶縁する。（B） M5ネジとナット2組を使用して、リクタメーターとアクリル製パネルをケージの天板に取り付ける。（C） ケーブルクリップをワイヤー製ケージ天板の最も外側の棒に固定する。（D） 各ケージには、対応するケーブルプロテクター（左用Lまたは右用R）を使用する必要がある。（E） スポウトのボトル部分は約2 cmだけ露出させる（1）ようにし、ボトルをケージに設置したとき（2）、スポウトの先端部分のみがアクリルパネルからわずかに突き出て、ラットがアクセスできるようにする。（F） フィルターの上部は、ケーブル自体を乱すことなくケーブルクリップの上にぴったりと収まるべきである。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図5：シッパーブロッカーの取り付けと使用方法。（A）シッパーブロッカーの3Dレンダリング図。（B）1つのシッパーブロッカー用にカスタム設計された3Dプリント部品。（C）3Dプリント部品を組み立てる。（D）M5ネジ＋ナット＋ワッシャーを使用して、組み立てたシッパーブロッカーをケージの上部に取り付ける。（E）ダイヤルを時計回りに回して、シッパーへのアクセスを遮断する。（F）ダイヤルを反時計回りに回して、シッパーからブロッカーを取り外す（1）、ブロッカーを持ち上げて90°回転させる（2）、その後もダイヤルを反時計回りに回し続け、ブロッカーがケージの上部から完全に離れるまで移動させる（3-4）。この図の拡大版をご覧になるには、こちらをクリックしてください。

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図6：飼育環境の設定とGUI操作。(A) 推奨される動物飼育室のセットアップおよび配線図 （B） 各センサー・ユニットを棚に取り付け、センサー・ケーブルを棚に配線して安定化する。 （C） マイクロコントローラーインターフェースを棚に取り付け、その4ピンジャンパーをセンサー単位Aに接続された5Vから3Vへのレベルシフターに接続する。 （D） 余分なアース線を電気テープで固定する。 (E) センサーのケーブルを対応するリコメーターのケーブルに接続する。 （F） 電源を接続してマイコンインターフェースをオンにします。 (G) GUIインタフェースのメインページ (H) タップ 設定 照明のON/OFF時間を動物飼育室の照明スケジュールに合わせる（1）し、タップしてください センサー設定 ラットの接触および離脱閾値を調整するため（2）。 （I） データを記録するには、「記録」を選択します。 エタノール瓶の側面 メインページで, タップ 開始！ センサーをキャリブレーションし（1）、記録を開始する（2）。タップしてください。 更新 画面上に表示される舐め回数を更新し、タップしてください 保存 & 終了 記録を停止する。 (J) タップ SDカードを取り出す SDカードを取り外してデータを転送するには、メインページでタップしてください。 SDラットを固定する SDカードを挿入した後。 (K) スクリーンショットの画像 マイクロコントローラーインターフェースによってマイクロ構造データが1分間隔で保存される様子を示す代表的な生データファイル。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図7：標準手順を用いて取得した代表的な2本ボトル選択飲水データ。 間欠的アクセスを伴う2本ボトル選択法による自発的飲水実験では、(A) ラットは月曜日、水曜日、金曜日（MWF）に20％（v/v）のEtOH溶液（オレンジ）とH2O（青）を提供され、火曜日、木曜日および週末にはH2Oを含む2本のボトルが提供される。(B) 毎日の液体摂取量の測定結果から、ラットは実験期間を通じて比較的一定の総液体摂取量（mL）を維持していることがわかる。(C) しかし、EtOHの摂取量は最初の数回の飲水セッションにかけて増加傾向を示し、その後は一定レベルに達して頭打ちになる。(D) この増加および維持のパターンは、EtOHに対する嗜好性にも同様に見られる。研究者はまた、(E) セッション開始後30〜60分でボトルの重量を測定することにより、一過性の大量飲酒（binge-like）に相当するEtOH摂取も記録できる。(F) これは通常、H2OよりもEtOHに対する高い嗜好性と関連している。影付きの誤差範囲は±SEMを示す（雄n = 32、雌n = 16）。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図8LIQ HDRは、高時間分解能で消費量を正確に捉える。 LIQ HDRシステムの精度と正確さは、その存在によって部分的に確認される。 ラットが受ける日におけるlick回数とボトルの重量変化との間に有意な正の相関関係が存在する （A） H2OおよびEtOHならびに （B） 両方のボトルにHが含まれている日2O. （C） H群間の飲酒パターンの違い224時間の飲水期間中のO（青）およびEtOH（オレンジ）は、平均ライクスを30分間隔のビンに分類することで容易に評価できる。内挿図は、ボトル使用可能時間の最初の30分間（灰色で強調表示）における5分間隔の平均ライクスを示しており、この期間にラットはしばしば顕著なフロントローディング行動を示す。群間の飲水パターンの差異についても、ライクミクロ構造の例に示されるのと同様のアプローチを用いて検討することができる。 （D） EtOHおよび (E) H2雄および雌のラットにおける24時間周期にわたるOの変動を示している。F飲酒パターンは、より短い試験期間にわたって高い時間分解能で評価することもできる。 （G） この間、LIQ HDRは摂取量を正確に追跡し続けます。 （H） 比較的少量のエタノール摂取時であっても血液中エタノール濃度（BEC）を予測する。影付きの誤差範囲は ± SEM（各性別n = 6）。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図9：代表的な飲水マイクロ構造データ。 LIQ HDRを用いることで、飲水マイクロ構造の測定が可能であり、（A）舌の出し回数、（B）飲水エピソード数、および（C）エピソードの持続時間に加えて、（D）ボトルの重量変化による総水分摂取量の測定も行える。(E-H) エタノールについても同様の測定が可能である。これらの測定値の群間比較により、摂取する溶液に基づく飲水戦略における性差など、異なる飲水パターンを明らかにすることができる。実線は中央値を示し、点線は四分位範囲を示す（各性別n = 6）；対応のないt検定；*p < 0.05。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

補足図1：マイクロコントローラーインターフェースのセットアップ。（A）電子部品と配線図。（B）1台のLIQ HDRシステムに必要なマイクロコントローラーインターフェースの製作材料。（C）容量性タッチシールドの裏面で、バックライト用の半田パッド間にジャンパを半田付けする。（D）データ記録シールドの裏面で、CSピンのジャンパパッドの配線を切断する（1）。CSピンからピン#7までジャンパ線を半田付けする（2）。（E）タッチシールドをベースとして、データロガーにヘッダーピンを半田付けする。（F）マイクロコントローラーに残りの2x4ヘッダーをスタックし（1）、データロガーをマイクロコントローラー上にスタックして、ヘッダーを半田付けで固定する（2）。（G）データロガーにコイン電池を挿入する（1）、タッチスクリーンをデータロガー上にスタックし、SDカードをデータロガーに挿入する（2）。（H）余分なグラウンド線を作成するために、ジャンパ線の片方のメスコネクタを切り取り、その端を剥いた固体芯線に半田付けする。（I）4ピンのジャンパ線と余分なグラウンド線をマイクロコントローラーに接続し（1）、ホットグルーで固定する（2）。（J）マイクロコントローラーインターフェースをカスタムの3Dプリント製ケースに収める。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

現在のプロトコルは、断続的なアクセスの 2 ボトル選択ホームケージ手順を使用してエタノール飲用データを取得するための段階的な手順を提供します。この方法は比較的簡単に実装でき、コストや特殊な研究機器をほとんどまたはまったく必要としません。ラットで使用する舐め検出システムであるLIQ HDRの構築と実装にここで提供する手順を使用すると、研究者は、摂取量と好みの標準的な測定値に加えて、高解像度の飲酒微細構造データを取得できます。

現在のプロトコルに記載されている断続的アクセス スケジュールは、エタノール アクセスの多くの代替スケジュールよりも高いレベルのエタノール摂取を引き起こすことがよく知られているため、広く使用されている手順です。実際、以前の研究では、断続的なスケジュールでアクセスするラットは、連続して24時間アクセスするラットよりも1日の平均エタノール摂取量が高いことが示されています6,7。それにもかかわらず、研究課題やその他の実験計画パラメータに応じて、エタノールアクセスの異なるスケジュールが望ましい場合があります。研究者は、ボトルのオン/オフの時間と曜日を変更するだけで、さまざまなスケジュール(継続的なアクセス、暗闇での飲酒など)に対応するために現在のプロトコルを非常に簡単に変更できます。

2 本入りの飲酒は比較的簡単に実装できるパラダイムですが、データ収集を損なう可能性のある問題が発生する可能性があります。したがって、潜在的な問題を迅速に特定するために、実験者が日常的にデータを検査することが重要です。特に、研究者は、シッパーの漏れや詰まりを示す可能性のあるボトル重量の非常に大きな変化または非常に小さな変化に細心の注意を払う必要があります。これらの問題の兆候を早期に発見することで、特定のサブジェクトからすべてのデータが分析から除外されるのを防ぐことができます。実際、研究者が24時間にわたってボトルの重量に劇的な変化(または変化がない)に気付いた場合、新しいボトルに切り替えるだけで、特定のボトルを流通から取り除く必要があるかどうかを確認するのに役立ちます。これらの理由から、余分なボトルとシッパーを手元に用意しておくのが賢明です。ただし、一部のラットは自然に非常に低いレベルのエタノール摂取を示すことに注意する必要があります35。これは、特定の系統のラットに特に当てはまります、レビューについては8 を参照してください。したがって、特定の実験で少数の動物集団がエタノール消費量が少ないかまったくない場合、研究者は心配する必要はありません。同様に、一部の動物は、こぼれを促進する可能性のある方法でシッパー/ボトルで遊ぶ傾向があります。まれではありますが、消費に関連しないボトル重量の大きな変化が繰り返される場合は、特定の動物を実験から除外する必要がある場合があります。

私たちの詳細なステップバイステップのプロトコルは、ラット用のLIQ HDRシステムの実装と使用の容易さを示しています。マイクロコントローラーの電子工学とプログラミングに関する予備知識やスキルがない研究者は、ほとんどまたはまったく変更を加えることなく、このシステムを実験のニーズに容易に適合させることができます。私たちの代表的なデータは、ラットの家庭用ケージ飲酒研究への応用に成功していることと、高い時間分解能で多数の飲酒微細構造測定値をキャプチャする強力な能力をさらに実証しています。LIQ HDRには、マウスの前身30と比較して、いくつかの設計変更が含まれています。これは、ラットでの使用への適応を成功させるために必要なだけでなく、機能とユーザーエクスペリエンスを向上させるためにも行われました。3D プリントされたボトル ホルダー、シッパー ブロッカー、電子部品などのケージ内のコンポーネントは、噛むのを防ぐためにケージ上部に再配置され、頻繁かつ重大なデータ損失やハードウェアの回転が発生する可能性があります。レーザーカットされたアクリルパネルを追加すると、これらの脆弱なコンポーネントの破壊がさらに防止されます。標準的な靴箱のネズミケージと同じ素材であるアクリルパネルを除き、他のすべてのLIQ HDRコンポーネントは、ケージ内から動物がアクセスできないか、ボトル交換中のほんの一瞬しかアクセスできません。この設計により、デバイスコンポーネントが破壊される可能性や、非食品の摂取による動物へのリスクが制限されます。LIQ HD 設計で使用される比較的労働集約的なカスタムメイドのボトルとは対照的に、LIQ HDR の 3D プリント ボトル ホルダーは、市販の既製のげっ歯類の飲料ボトルと互換性があるように設計されています。ボトルはケージの上部に設置され、標準的なケアや飼育中に飲料ボトルが適用されるのとほぼ同じ方法でラットがアクセスできます。シッパーブロッカーの追加は、システムの信頼性を向上させ、ブロッカーがない場合、Arduinoインターフェースでのデータキャプチャを開始する前に発生する飲酒や、毎日のキャリブレーション中にラットがシッパーと相互作用したときに発生する誤った舐め測定によって生じる可能性のある貴重なデータ損失を防ぐ、シンプルだが効果的なソリューションです。ラットケージがかなり大きいため、元のハードウェア設計のサイズをスケールアップする必要がありますが、大幅に長いケーブルを使用すると、干渉による静電容量式センシングの感度と精度、およびデイジーチェーン接続されたセンサーボードとArduinoインターフェイス間のI2C通信の完全性に悪影響を与える可能性があります。この問題を回避するには、差動I2C通信方式を採用し、Ethernetケーブルによる超長距離・ほぼロスレスの信号伝送を実現しています。ケージ内コンポーネントに使用されている素材により、使用の合間に簡単に洗浄および消毒できます。リコメーターは避妊して 70% EtOH 溶液で拭くことができますが、導電性銅テープなどの電気部品が無傷であることを確認するように注意する必要があります。シッパーブロッカーやアクリルパネルなど、動物と直接接触する非電気機器は、温かい石鹸水でよく洗うことができます。

舐め検出システムの信頼性と有効性には、適切な構築と設置、広範なテスト、入念なエラー監視、効果的なトラブルシューティングが必要です。すべての DIY コンポーネントは、スキルと注意を持って作成および組み立てる必要があります。これは、初心者には練習が必要なはんだ付けを伴うステップでは特に重要です。いずれにせよ、実際の実験で使用する前に、すべてのリッコメーターの広範なテストが必要です。個々の実験ニーズに適応するためにシステムを変更する必要がある場合は、正確な舐め検出のためにセンサー設定 (タッチとリリースのしきい値など) をさらに微調整する必要がある場合があります。初めて使用する場合は、高レベルの飲酒を引き起こす非常に口当たりの良いソリューションを使用して、簡単な少量のサンプルパイロット研究でシステムをテストすることをお勧めします。舐めが登録されるたびにLEDが点滅するため、センサーボードを目視で検査することで、舐め検出をリアルタイムで検証できます。舐め回数とボトル重量の変化との間に強力で有意かつ一貫した相関関係があることは、適切なハードウェアおよびソフトウェアセットアップのベンチマークとして使用する必要があります。セットアップが完了した後でも、実験の開始時に明らかになる可能性のある機器の問題をトラブルシューティングするために、ラットが水の入ったボトルを2本受け取った日に、特定の実験の記録を開始することをお勧めします。また、ケージ交換に関連する水の日にリコメーターの機能をテストすることも、リコメーターを取り外してセンサーに再接続する必要があるため、有利な場合があります。個々のリコメーターまたはセンサーのランダムな故障により、同じリコメーターに対して一貫して非常に明らかな外れ値データ(たとえば、ボトルの重量が大幅に変化したにもかかわらず、リックが検出されない、またはほとんど検出されない)が生じる場合は、コンポーネントに欠陥があることを示しています。必要に応じて簡単に交換できるように、リッコメーターシステムの各要素に追加のコンポーネントを事前に準備することをお勧めします。最後に、センサーケーブルが過度に重なったり曲がったりしないようにすることの重要性は、どれだけ強調してもしすぎることはありません。そうすると、ボトルの重量が変化した場合の舐め回数が不当に少なかったり、舐め時間が数分または数時間にわたって極端に長い(1分間のビンで60,000ミリ秒近く)ことなど、なめの検出が不十分になることがあります。それにもかかわらず、標準またはリコメーターを備えたアプローチのいずれかを使用して、多くの動物について何日にもわたって24時間にわたってデータを収集する研究では、データの小さな損失は避けられません。研究者は、ボトルの重量や舐めが明らかに摂取量を反映していない場合(シッパーの詰まり、校正エラーなど)に、まれな飲酒セッションの誤ったデータを除外できます。このような場合、その特定の被験者の研究期間にわたる特定の測定値 (たとえば、摂取量 (g/kg)、舐めなど) の平均値を、データ分析中に欠損値に置き換えることができます。混合効果分散分析は、欠損データポイントに対応するための代替手段としても使用できます。

2本選択飲酒パラダイムの利点の1つは、エタノール摂取の自発的な側面です。これは、特に実験者が投与したアルコールが自発的に自己投与されたアルコールと比較して脳の機能と行動に有意に異なる効果をもたらす可能性があることを示す結果に照らして、優れた顔の妥当性を提供します42。さらに、パラダイムの自発的な性質により、研究者は、人間で観察されるアルコールの好みや飲酒パターンのばらつきと同様に、摂取量の個人差を捉えることができます。これらの個人差は、研究者が摂取量(摂取量および/またはパターン)を観察された病理学的影響の大きさと相関させる強力な機会を提供する可能性があります。

それにもかかわらず、2 本の家庭用ケージ飲用パラダイムにはいくつかの制限を考慮する必要があります。たとえば、エタノール摂取量の個人差は、一部の実験では有利である可能性がありますが、一定レベルの中毒またはエタノール曝露が望ましい他の実験では不利になる可能性があります。これは、慢性的なエタノール曝露による依存と離脱の結果を調べる実験に特に当てはまります。重要なことに、2本入りの飲酒は、エタノールに長期間アクセスしているラットであっても、依存症のモデルとして特徴付けられていません。したがって、離脱症状が伴わない場合、研究者はエタノールの長期摂取の結果を依存症および/または離脱症状の影響として解釈する際に注意する必要があります。実際、もっともらしいとは言わないまでも、2本選択手順中に比較的大量のエタノールを飲んだラットが離脱症状を示す可能性がありますが、特定の24時間でより少ない総量を飲んだラットは同様の依存の兆候を示さない可能性があります。24時間にわたって同じ量を飲む2匹の動物は、エタノール摂取のパターンに応じて、大きく異なるレベルの中毒(すなわち、BEC)を経験する可能性があるため、飲酒パターンもこの考慮において重要な役割を果たす可能性があります22。これは、特定の用量のエタノールを速い速度(つまり、ゴクゴク)で消費するラットと、同じ用量をはるかに遅い速度で消費するラット(つまり、一口)を容易に識別できるため、2本ボトル選択手順におけるLIQ HDRの有用性を強調しています。制御された用量のエタノールの影響を調査する研究には潜在的に望ましくない可能性がありますが、特定の実験的介入後の飲酒パターンの変化 (たとえば、過食症エピソードの減少) の検出は、臨床でますます追求されているハーム リダクション アプローチを考えると、重要な翻訳価値があります。最後に、ここで説明されているものを含む、家庭用ケージ飲酒パラダイムで動物がエタノールにアクセスするために努力は必要ありません。したがって、このパラダイムの有用性は飲酒のみの分析に限定されますが、研究者がAUDの重要な機能であるアルコールを求める調査に関心がある場合、オペラント法が好まれます。

要約すると、ここで説明するプロトコルは、自宅ケージ環境でラットのエタノール摂取量を測定するために必要なすべての情報とリソースを研究者に提供します。比較的低解像度と高解像度のアプローチのオプションを提示し、研究者が研究ニーズに最も適した方法を柔軟に選択できるようにします。

開示事項

すべての著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

著者は、LIQ HDR開発中の技術支援を提供してくれたJoseph Pitock氏とKatie Przybysz博士に感謝します。また、LIQ HDRの開発中に多くの有益な会話をしてくれたNicholas Petersen氏とMarie Doyle博士にも感謝します。この研究は、国立衛生研究所の国立アルコール乱用およびアルコール依存症研究所(P50 AA022538およびR01 AA029130 EJGの支援を受けました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
<強力>市販のコンポーネント<強力>数量
12キー静電容量式タッチセンサーブレークアウト(MPR121)Adafruit19823
2ピンケーブルマッチングペア(JST XH 2.5mmピッチ)Adafruit487218
4ピンブレッドボードジャンパー(Qwiic)SparkFunPRT-179121
4ピンケーブル(100mmケーブル)SparkFunPRT-172591
4ピンケーブル(50mmケーブル)SparkFunPRT-172603
5V-to-3VレベルシフターブレークアウトAdafruit56371
式タッチシールド(2.8インチ)Adafruit19471
導電性テープ(1/4インチ)DigiKey4393-CFT-1/4-ND1
データロギングシールドAdafruit11411
差動I2C通信ブレークアウトキット(QwiicBus)SparkFunKIT-172501
電気テープDigiKey3M156004-ND1 熱
収縮チューブ(3/16インチ各種色)ケーブルタイなどHS357-S106
熱収縮チューブキット(4インチ黒)Jameco20959631
コイン型リチウム電池(3V 12.5mm)DigiKey1908-CR1220JAUCHSB-ND1
M5平ワッシャーグレインジャー54FN661
M5六角ナットグレインジャー6CA721
M5小ネジ(12mm)グレインジャー6GU88M5
小ネジ1本(25mm)グレインジャー 6GU912
オス/オスジャンパ線Adafruit19571
マイクロコントローラボード(Arduino Mega 2560 Rev3)DigiKey1050-1018-ND1
PETGフィラメント(2.85mm銀)MatterHackersM-DDH-UZR22
PLAフィラメント(2.85mm黒)MatterHackersM-SEW-RUAW2
PLAフィラメント(2.85mm銀)MatterHackersM-66P-6CLE1
電源 (DC 9V 1A)Newegg9SIBPPKJYR59911
SD / microSDメモリーカード (8GB)Adafruit12941
シールドスタッキングヘッダーAdafruit851
ソリッドコアワイヤ (22AWG赤)Adafruit2881
撚り線 (22AWG黒)Adafruit29761
撚り線(22AWG赤)Adafruit30681
ツイストキャップシッパーチューブボール付き代替デザインTCCN8.5-ST2.5SB38
ボトル(8オンス)代替デザインWB8FS38
カスタム3Dプリントコンポーネントstrong>数量
3DプリントArduinoケースの底N/AARDUINO_Bottom.stl1
3DプリントArduinoケーストップN/AARDUINO_Top.stl1
3Dプリントケーブルクリップ LN/ACLIP_L.stl18
3DプリントケーブルクリップナットN/ACLIP_Nut.stl18
3Dプリントケーブルクリップ RN/ACLIP_R.stl18
3DプリントリッチメーターボトルホルダーN/ALICKOMETER_Bottle Holder.stl19
3Dプリント lickometer ケーブル プロテクター LN/ALICKOMETER_Cable Protector_L.stl6
3Dプリント lickometer ケーブル プロテクター RN/ALICKOMETER_Cable Protector_R.stl12
3Dプリント lickometer lettersN/ALICKOMETER_Letters.stl19
3Dプリント マウント ネジN/Aマウント Screw.stl4
3Dプリントセンサーケース A底部 N/ASENSOR_A_Bottom.stl1
3Dプリントセンサーケース AトップN/ASENSOR_A_Top.stl1
3Dプリントセンサーケース B底部 N/ASENSOR_B_Bottom.stl1
3Dプリントセンサーケース BトップN/ASENSOR_B_Top.stl1
3Dプリントセンサーケース C底部 N/ASENSOR_C_Bottom.stl1
3DプリントされたセンサーケースCトップN / ASENSOR_B_Top.stl1
3Dプリントされたセンサーケースの文字N / ASENSOR_Letters.stl1
3DプリントシッパーブロッカーN/ ASIPPER_Blocker.stl36 3D
プリントシッパーブロッカーベースN / ASIPPER_Base.stl18
3DプリントシッパーブロッカーギアN / ASIPPER_Gear.stl18
3DプリントされたシッパーブロッカーナットN / ASIPPER_Nut.stl18
3DプリントされたシッパーブロッカーウォームN / ASIPPER_Worm.stl18
カットされたリコメーターアクリルパネルN / ALICKOMETER_Acrylic Panel_Sketch.dxf19
静電容量銅ウォーターレーザー

参考文献

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