方法論記事

In Vitroでの宿主-病原体相互作用の研究のための器官型組織モデルシステム

DOI：

10.3791/67487

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2025年3月28日

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1Oral Sciences Research Group, Glasgow Dental School, School of Medicine, College of Medical, Veterinary and Life Sciences, University of Glasgow, 2Glasgow Biofilm Research Network, 3Department of Restorative Dental Sciences, College of Dentistry, Jouf University, 4Department of Biological and Biomedical Sciences, Glasgow Caledonian University, 5Safeguarding Health through Infection Prevention Research Group, Glasgow Caledonian University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本プロトコールは、 in vitroでの宿主-病原体相互作用を調査するための器官型組織モデルの適用を概説しています。具体的には、記載されているモデルシステムは、口腔の健康と病気の文脈で、バイオフィルム(歯垢)に関連する微生物にさらされた多層の口腔上皮を使用します。

要約

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in vitroで上皮または粘膜関門における宿主-病原体界面を再現することは、感染生物学者にとって依然として困難な課題です。自社で成長させた2D上皮単分子膜は、in vivoの状況を正確に表現していませんが、市販の組織モデルは、そのコストと実用性のために見過ごされがちです。しかし、慎重な計画を立てれば、このようなモデルは、さまざまなアプリケーションに対して再現性のあるプラットフォームを提供します。本稿では、口腔、皮膚、膣粘膜など様々な生態学的ニッチにおける宿主と病原体の相互作用を調べるために、様々な実験目的に利用できる上皮モデルを用いたことを報告します。単純なプランクトン細胞から複雑なバイオフィルム共培養まで、上皮モデルを使用して微生物の付着と侵入を評価し、転写レベルやタンパク質レベルでの宿主応答を評価し、さまざまなオミクスアプローチを使用したより詳細なプロファイリングが可能です。さらに、これらの生物学的システムは、in vitroで複雑な宿主病原体微小環境における従来型および新規の抗菌活性を評価するためのより正確なテストベッドとして使用できます。本明細書に記載されているプロトコルは、到着時にモデルがどのように扱われ、バイオフィルムコミュニティとの共培養刺激のために実験室で調製されるかを文書化しています。この手法では、組織の処理、共培養のセットアップ、データ生成など、モデルシステムからの実験出力がどのように達成されるかについて詳しく説明します。これらの実験には、シングルおよびマルチプレックスqPCR解析による宿主遺伝子発現、ELISAを使用した炎症性タンパク質検出が含まれます。結論として、上皮モデルは、単純または複雑な宿主-病原体相互作用の前臨床研究に有用なin vitroシステムを提供します。

概要

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in vitroモデルシステムは、宿主と病原体の相互作用を調査するための優れた試験ベッドを提供します。これらの器官型システムは、微生物の摂動を起こしやすいさまざまな生態学的ニッチの微小環境を再現することを目的としています。EpiSkin(旧SkinEthic)組織モデルを利用して、口腔内1,2,3,4,5、皮膚バリア6,7,8,9,10,11、および膣粘膜5,12,13における宿主と病原体の相互作用を評価するための多くの研究論文が発表されています、とりわけ14,15。微生物に曝露された上皮細胞株の単層の使用に依存する「二次元」または「2D」細胞培養とは異なり、これらの市販のモデルは、気液界面で増殖した分化細胞の多層で構成されています。安価で再現性が高いとよく考えられていますが、2D培養システムは微生物と一緒に培養すると細胞が損傷を受けやすく、これは必ずしもin vivoでの上皮または粘膜の障壁を正確に表しているわけではありません16,17。

最近の証拠は、「3次元」または「3D」培養技術が、癌科学、幹細胞研究、創薬など、さまざまな科学分野で人気が高まっていることを示しています16,18。感染生物学の文脈では、3D組織モデルは、in vitroで制御された微小環境内の上皮または粘膜バリア界面における宿主細菌、真菌、または混合種の相互作用の研究に利用できます。これらのモデルは、2D培養システムに対して多くの利点を有しており、病原性生物または複雑なバイオフィルムコミュニティによる組織のコロニー形成および/または浸潤の評価を可能にし17、2Dモデルが転写プロファイルまたはプロテオミクスプロファイル16,17,18によって制限されることがあるさまざまなバイオマーカーの多成分レベルでの宿主応答の評価を可能にする.結局のところ、このような3Dシステムの前臨床応用は膨大であり、in vivoモデルや臨床研究に進めることができる重要な探索的データを提供します。

口腔の健康と疾患の文脈では、口腔粘膜表面に関与する炎症経路を理解することは、治療方法を決定する可能性があるため、臨床医にとって重要です。以前の研究では、「健康関連」バイオフィルムが最小限の炎症反応を誘発できることが示されています3,19,20,21。これは、口腔の健康に関連する微生物のバイオバーデンが低いこと、または免疫調節剤と広く考えられているストレプトコッカス属のバイオフィルムの組成に起因する可能性があります22,23。一方、Fusobacterium nucleatumやPorphyromonas gingivalisなどの疾患関連微生物で構成されるバイオフィルムは、本質的に炎症誘発性です3,20,24,25,26,27。2020年のMountcastleらによるレビューでは、口腔微小環境17について当時存在していたすべての関連する共培養モデルが説明されました。このような器官型モデルは豊富にあり、28,29年以降にいくつかが作成されていますが、そのような3Dモデルの作成に関連する多くの困難な障害が残っています。いくつか例を挙げると、これらのモデルには大幅な最適化が必要であり、作成には非常に労力とリソースがかかります。再現性は、慎重に制御されない限り、非常に変動する可能性があります16,17。市販のモデルは、このような問題を回避し、口腔内および人体の他の生態学的ニッチにおける宿主と病原体の相互作用を調査するためのプラットフォームを提供します。

要約すると、現在のプロトコルは、口腔の健康と疾患の文脈で in vitro で宿主と病原体の相互作用を調査するための器官型組織モデルの応用を概説することを目的としています。具体的には、記載されているモデルシステムは、口腔炎症性疾患である歯肉炎を代表する明確なバイオフィルムコミュニティに曝露された多層の市販の口腔上皮を使用します。

プロトコル

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以下のプロトコルは、歯肉炎を代表する多種バイオフィルムの調製を含み、合計7種(属)7,30を含む。3つの連鎖球菌属、連鎖球菌咽散臭性遺伝学(NCTC 12261)、連鎖球菌中間球菌(DSM 20753)、および口腔連鎖球菌(NTCC 11427)は、口腔の健康を模倣するために含まれており、唾液ペリクルの最初のコロニー形成者として機能します。次に、口腔の健康から疾患への移行に関連する4つの嫌気性微生物、Veillonella dispar(NCTC 11831)、Actinomyces naeslundii(DSM 17233)、および2つのFusobacterium spp. Fusobacterium nucleatum(ATCC 10953)およびFusobacterium nucleatum亜種(subspp.)を追加します。ヴィンセンティ(DSM 19507)。関連するすべてのステップは、炎またはクラスIIの安全キャビネットで無菌的に行われます。微生物学的製剤に使用されるすべての培地およびリン酸緩衝生理食塩水(PBS)は、使用前にオートクレーブ滅菌され、プロトコール中に定期的に無菌性が評価されます。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、材料表に記載されています。

1. 共培養のための微生物群集の作製

注:このプロトコルは、歯肉組織の炎症(歯肉炎としても知られる)に関連するコンソーシアムを代表する多種バイオフィルムの生成を示しています。このようなモデルは、前述のように、口腔の健康および疾患における宿主応答の評価に使用されてきた3。

  1. -80°Cで保存された微生物を含む多孔質ビーズ(市販品)の凍結ストックから、血液寒天プレート(5%の滅菌除細動馬の血液を含むコロンビア血液寒天培地)で3つの連鎖球菌種すべてを復活させます。これは、接種ループとストリークプレート技術を使用して実現されます。
    1. 37°C、5%CO2で24時間インキュベートし、次に3〜4コロニーを分離して10 mLのTryptone Soya Broth培地に増殖させます。培養液を37°C、5%CO2で16〜18時間培養します。
  2. 中間病原体については、 V. dispar、 A. naeslundii、 F. nucleatum 、 および F. nucleatum subspp. vincentii は、5%の滅菌除細動馬の血液を含む気難しい嫌気性寒天培地で37°Cで48時間、同じ条件下でさらに24〜48時間Schaedlerのブロスで培養する前に嫌気的に。
  3. 増殖後、ペレット細胞懸濁液を5分間、20°C、3000 x gで遠心分離し、次いでペレットを10 mLの滅菌PBS(pH 7.2-7.6)で洗浄します。ペレット細胞懸濁液を再び遠心分離 し 、5分間、20°C、3000 x gで行い、その後、2回目の洗浄ステップを繰り返します。洗浄した細胞を10 mLの滅菌PBSに再懸濁して標準化します。
  4. 550 nmの分光光度計を使用して、3つのStreptococcus属すべてを個別に標準化します。0.50の吸光度値(0.45〜0.55の範囲)は、Miles and Misra細胞カウント技術31を用いて以前に決定されたように、細胞数が~1 x 108細胞/mLであることを示している。この吸光度を読み取るには、洗浄した細胞懸濁液10 mLを滅菌PBSでさらに希釈します。
  5. 標準化後、すべての 連鎖球菌 属を1:10から1 x 107 細胞/mLに希釈し、Todd Hewitt Broth(THB)とRoswell Park Memorial Institute(RPMI)培地の1:1ミックスで溶解します。直径13 mmのハイドロキシアパタイトディスクを含む24ウェルマイクロタイター組織培養プレートにピペッティングして、500 μLの細胞懸濁液を添加します。バイオフィルムを37°C、5%CO2で24時間熟成させます。
    注:多種バイオフィルムは、エナメル質、象牙質32、およびポリ(メタクリル酸メチル)義歯表面33,34などの異なる口腔関連基質上に成長させることができる。これらのモデルには、人工唾液や合成唾液などの代替培地も使用できますが、使用する微生物のコンソーシアムに応じて慎重に検討する必要があります:研究によると、成長培地の選択は混合コミュニティバイオフィルムの成長に重要な影響を与えることが示されています35,36。
  6. 翌日、上記と同様の方法で4つの嫌気性微生物を標準化します(ステップ1.2-1.4)。ペレット細胞懸濁液を2回洗浄し、 V.dispar を0.50吸光度(0.45〜0.55の範囲)に、残りの3つの微生物を0.20吸光度(0.18〜0.22の範囲)に標準化します。標準化したら、すべての懸濁液をTHBとRPMIの1:1ミックスで1:10〜1 x 107 細胞/mLにさらに希釈します。
  7. 付着していない細胞や使用済み培地を慎重に取り除き、ピペッティングで 連鎖球菌 のバイオフィルムから廃棄します。マイクロタイタープレートウェルを、4つの嫌気性菌の標準化された1 x 107 細胞/mL懸濁液500 μLと交換します。バイオフィルムを37°Cの嫌気性条件下で24時間培養します。
  8. 24時間後、7種のバイオフィルムから接着していない細胞と使用済み培地を取り除き、500 μLの滅菌済み1:1混合液THB:RPMI培地と交換します。バイオフィルムは、37°Cで4日間嫌気的に成熟させ、培地を毎日除去して補充します(合計4回の培地交換)。
  9. 7日目には、マルチスピーシーズバイオフィルムは完全に成熟し、下流の実験の準備が整います。バイオフィルムを500 μLの滅菌PBSで2回洗浄し、共培養に使用します。
    注:バイオフィルムは、qPCR(組成評価用)や、前述のように共焦点顕微鏡または電子顕微鏡による顕微鏡プロファイリングなど、さまざまな生物学的方法論を使用してプロファイリングできます3。

2. 器官型組織の取り扱いと実験のセットアップ

注:以下に説明する実験セットアップには、不活性ポリカーボネートメンブレンフィルターで培養されたTR146細胞で構成されるヒト口腔上皮(HOE)組織が含まれます。表皮モデル、膀胱、食道、角膜、歯肉、膣上皮など、他のモデルも存在します。すべてのモデルは、宿主と病原体の相互作用を調査するために、以下で説明するのと同様の方法で取り扱い、準備されます。

  1. 到着したら、HOEティッシュとメディアを開梱し、クラスIIの安全キャビネットに移します。組織に付属の合計1 mLのメンテナンス培地を12ウェルプレートに加えます。
  2. 滅菌ピンセットでHOEを含むポリカーボネートインサートを、輸送に使用した24ウェルプレートと栄養寒天から取り出し、培地を含む12ウェルプレートに移し、組織の下に気泡が残らないようにします。インサートの側面または底に付着している余分な寒天は、追加のピンセットまたはティッシュペーパーを使用して慎重に取り除いてください。
  3. 組織モデルを37°C、5%CO2 で24時間インキュベートしてから実験セットアップを行い、出荷後の実験室条件に順応させます。注目すべきは、組織モデルの長期維持またはさらなる成熟のために、追加の維持培地または増殖培地が利用可能であることです。
  4. 共培養実験ができるようになりました。ここで示す例では、上記のように作成された7種のバイオフィルム(ステップ1.1〜1.9)を超音波処理によってそれらの基質から除去します。これを達成するには、19 G の針とピンセットを使用して 24 ウェルプレートの底からバイオフィルムを含む HA ディスクを取り出し、1 mL の滅菌ダルベッコ PBS を含むビジューを移します。35 kHzで10分間、超音波処理水浴中で超音波処理します。
  5. 一晩の順応からピンセットを使用して組織モデルを含むインサートを慎重に取り出し、ピペッティングによって組織に直接100μLのバイオフィルム超音波処理懸濁液を添加します。比較目的で刺激を受けていない対照組織を使用してください。これらのコントロール組織インサートには、バイオフィルム懸濁液を含まない滅菌ダルベッコPBS100μLを添加します。
    注:プランクトン細胞、分散細胞を含む使用済みバイオフィルム上清、または全バイオフィルムは、バイオフィルム超音波処理の代わりに共培養モデルに利用できます。異なる微生物刺激剤を用いたこれらの宿主病原体モデルの異なる適用は、他の場所で文書化されているように図1に図式化されている3,5,6,8,13,37,38。
  6. 添加後、インサートを1 mLの新鮮なメンテナンス培地が入った別の12ウェルプレートに移し、インサートの下に気泡が存在しないことを確認します。組織モデルを含むプレートを37°C、5%CO2 で24時間インキュベートしてから、下流のアプリケーションのための組織処理を行います。
    注:組織供給者は、超音波処理された凝集体またはバイオフィルムへの曝露後の組織の継続的な培養をサポートするための追加の培地を提供することができます。この目的のために、長期の組織バイオフィルム接種を調査したいくつかの以前のモデルが発表されています21,28,39。現在の器官型モデルを用いて同様の結果を得るためには、組織を超音波処理し(上記のようにステップ2.6)、微生物を24時間付着させる。残っている微生物懸濁液を廃棄し、必要な実験時間経過の間、気液界面で培養を続けます。

3. 実験成果のための組織処理

注:共培養後、組織モデルは実験出力のために処理されます。次の手順では、転写プロファイリングのために組織からRNAを抽出する方法と、使用済み組織培地をタンパク質検出に使用する方法を文書化します。組織はまた、前述の3,6のように、組織学的評価のためにホルマリン、パラホルムアルデヒド、または同様の固定剤で固定されてもよい。

  1. まず、1% の β-メルカプトエタノールと 0.5 mm 酸洗浄ガラスビーズ ~100 μL 相当の 2.0 mL スクリューキャップ O リングチューブに 350 μL の RLT 溶解バッファーを調製します。
  2. ピンセットを使用して組織を含むインサートを培地から取り出し、インサートから残っている微生物懸濁液を廃棄します。次に、目の高さで保持し、反転させます。19Gの針を使用して、インサートの底から組織とメンブレンを慎重にスライスし、RLTバッファーに移します。
    1. ベンチトップビーズビーターホモジナイザーを使用して30秒で組織をホモジナイズし、RNA抽出キットの製造元の指示に従ってライセートからRNAを抽出します( 材料の表を参照)。
      注:抽出されたRNAは、定量的PCR(qPCR)またはRNAシーケンシングを使用して、炎症のマーカーとしてのサイトカインおよびケモカイン遺伝子の発現をプロファイリングするためのcDNA合成に使用されます。qPCRは、特定の遺伝子の既製のプライマーを含むウェルを含むRT2 PCRプロファイラーアレイや、自社設計のプライマー配列とヌクレアーゼフリーのddH2O3を備えたSYBRグリーンベースの試薬などのマルチプレックスアレイを使用して達成されます。
  3. ELISA、マルチプレックスイムノアッセイ、マルチプレックスタンパク質バイオマーカー分析7などのロースループットおよびハイスループットの方法論を使用して、プロテオミクス分析のために残りの使用済み組織培地(~850-900 μL)を回収します。
  4. 使用済みの組織培地を使用して、炎症に関連するさまざまなマーカーをタンパク質レベルで評価します。使用済み培地は、上記の方法(ステップ3.3)に直接使用することも、-20°Cまたは-80°Cで保存することもできます。 このような分析では、媒体の複数回の凍結融解サイクルを避けてください。
    注:ELISAを使用した正確なプロテオミクスプロファイリングのために、組織刺激剤によっては培地を1:10に希釈する必要がある場合があります。

結果

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この実験では、HOEは、口腔の健康から歯茎の炎症(歯肉炎として知られる)への移行の生物の代表である7種のバイオフィルムソニケートに曝露されました。この病気は、歯の表面に蓄積する歯垢からの微生物の摂動による歯肉または口腔上皮組織の炎症から生じます。刺激後、組織、および使用済み培地は、上述したように転写およびプロテオミクス解析に利用されます。この実験では、炎症性バイオマーカーのパネルの遺伝子発現が、バイオフィルム超音波処理による刺激後の組織で検出されました(図2)。これは、16 種類の遺伝子を含むカスタムメイドの RT2 PCR プロファイラーアレイを使用して達成され、ハウスキーピング遺伝子 GAPDH への標準化後の遺伝子発現は、刺激を受けていない組織に対する倍率変化として示されました。微生物刺激は、CXCL5を除くすべての遺伝子の発現を増加させ、NFKB、CCL2、CXCL1、CXCL3、CSF2、CSF3、TNF、IL1A、IL1B、およびTLR4に統計的な差が見られました(図2A)。最も大きな倍率変化が観察されたのはCCL2、CXCL1、およびCSF3で、それぞれ16.9、10.3、および15.1の増加でした(図2B)。

使用済みHOE培地は、刺激後に組織によって産生および放出されるタンパク質を検出するためのプロテオミクス分析に利用されました。これは、遺伝子発現がタンパク質産生と相関しているかどうかを判断するのに役立ちます。これを行うために、 IL8 遺伝子発現およびIL-8タンパク質放出を対照組織およびバイオフィルム超音波刺激組織で評価した(図3)。遺伝子発現は、前述の3に示すように、IL8およびGAPDHのプライマーを用いたSYBR-greenベースのqPCRを用いて評価した。HOEにおける IL8 mRNAの発現は、バイオフィルムソニケートによる刺激後に8.67倍に増加しました(図3A)。タンパク質レベルでは、IL-8 ELISAキットを使用してIL-8レベルを定量しました。使用済み培地中のIL-8の濃度は、対照組織における~1.005ng/mLからバイオフィルム超音波刺激組織における~4.245ng/mLに増加した(図3B)。

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図1:器官型組織共培養モデルのさまざまなアプリケーション。 微生物の標準化された懸濁液を組織に直接適用して、種と宿主の相互作用を調査します(A)。これらは、短期間(例:<24時間)の微生物のコロニー形成を評価するためによく使用されます。複雑なバイオフィルムは、分散した細胞またはバイオフィルム凝集体が組織に及ぼす影響を調べるために超音波処理されます(B)。これは重要ですが、以前には、そのような細胞はプランクトン性またはバイオフィルムの対応物と比較して独特の表現型を持っていることが示されています。この目的のために、無傷のバイオフィルムを、追加の小さなインサートを使用して組織に直接追加し、宿主との隣接露光を作り出すことができます(C)。最後に、プランクトン性細胞を適切な培地で組織に添加し、微生物のコロニー形成、バイオフィルム形成、および組織上の成長ダイナミクスを評価します(D)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:7種バイオフィルムソニケートによる刺激後のHOE組織の遺伝子発現 mRNA発現は、ハウスキーピング遺伝子GAPDHに正規化された合計15の炎症性遺伝子の倍率変化を、制御中のHOE組織で、刺激せずに、100μLの7種バイオフィルムソニケート(A)に曝露した。(B)は、mRNA発現の変化が最も大きい3つの遺伝子(CCL2、CXCL1、CSF3)を示しています。統計分析は、パラメトリック対応のないT検定を用いて実施され、有意な変化はそれぞれ*p < 0.05、**p < 0.01、***p は0.001<示されました。データは、統計ソフトウェアとグラフ作成ソフトウェアを使用してプロットおよび分析されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:HOE組織によって産生されるIL8遺伝子発現とIL-8タンパク質レベル。 SYBR-greenベースのqPCR(A)およびELISA法を使用して使用済み組織培地から定量されたIL-8タンパク質レベルによって決定されたHOE組織におけるIL8のmRNA発現倍率変化(B)。統計分析は、パラメトリックな対応のない T 検定を使用して実施され、有意な変化は *p < 0.05 および ****p < 0.0001 として示されました。データは、統計ソフトウェアとグラフ作成ソフトウェアを使用してプロットおよび分析されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

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ここでは、微生物刺激後の宿主応答を評価するために、HOE組織と共培養するための歯肉炎を代表する複雑な多種バイオフィルムモデルを作成するための方法論について説明します。このプロトコルは、プランクトン細胞、単一、二重、または混合種のバイオフィルム、または人体の異なる生態学的ニッチからの上皮組織を持つバイオフィルム分散細胞との間の宿主病原体相互作用の調査に使用するために適合させることができます。宿主と病原体の相互作用を調査するための組織モデルの使用は、上皮組織が複数の細胞層を含むというin vivoの状況を必ずしも真に再現するわけではない2D単層に限定されていた以前の共培養システムに重要な進歩をもたらす16,17,18。さらに、多層組織モデルのin vitro増殖に関連する課題は多く、複数の細胞株を使用したり、汚染されやすい気液界面での細胞層の増殖を行ったりします。市販の組織は、以前の出版物3,7で示されているように、反復とバッチ間で同等である一貫して高品質のモデルを備えた再現性のあるプラットホームを提供します。

「共培養のための微生物群集の準備」のセクションでは、これらの微生物を7種の歯肉炎モデルに含めるかどうかは、口腔の健康から疾患への移行に関連する一般的に同定された共生動物と病原体に基づいて選択されました。 in vitroのすべての複雑なバイオフィルムモデルシステムと同様に、微生物の包含は、特定の健康または病気の生態学的ニッチに関連するマイクロバイオーム研究によって指示されます。この目的のために、私たちと他の人々は、共生微生物(例えば、 Streptococcus および Rothia spp.)を含む口腔健康関連バイオフィルムモデルの使用を報告しています。3、40、41。さらに、これらのモデルに病原体を追加して、他の疾患に関連するバイオフィルムを作成することもできます。例えば、ここで述べた7種に3つの微生物を添加して、歯周炎に関連する疾患モデルを作り出すことができる3、一方、真菌病原体である カンジダ・アルビカンス を添加して、多微生物性を高めるとともに、王国間の複雑さの層を追加することができる33。実際、真菌と細菌の相互作用を促進することは、細菌のみのバイオフィルムと比較した場合、 in vitro でそのようなバイオフィルムモデルを使用したさまざまな実験結果に大きな影響を与える可能性があります42。最終的には、そのような研究のための新しい多種バイオフィルムモデルを作成する際には、慎重に検討することを強くお勧めします。含まれる微生物は、広範な文献検索から簡単に識別できるはずですが、ほとんどのニッチや疾患では、さまざまな理由でin vitro で複雑なモデルにうまく統合できない場合があります。次に、考慮すべきその他の考慮事項を示します。

バイオフィルム形成ダイナミクス
生体内でのバイオフィルム形成には、多くの場合、特定の微生物による早期、中期、および後期のコロニー形成が関与します。歯肉上および歯肉下の歯垢形成は、先駆的な種(例えば、連鎖球菌種)によるエナメル質上の唾液ペリクルの初期付着によって大きく特徴付けられ、これらをコロニー形成の足場として必要とする中間および後期の病原体がある43。同様の現象が細菌性膣炎中の膣環境でも提案されており、それにより、Gardnerella vaginalisが最初のコロニー形成者であり、その後に嫌気性菌が続くと考えられています44。ただし、これは他の生態学的ニッチの他の病気には当てはまらない可能性があることに注意することが重要です。

各微生物の播種密度
微生物は、in vitroで培養すると、サイズや成長ダイナミクスが異なります。したがって、標準化プロセスではこれを考慮することが重要です。例えば、C. albicansは、細菌細胞の100〜150倍の大きさである45,46、したがって、そのようなバイオフィルムモデルに対して、低濃度、例えば、1×106細胞/mLで添加することが正当化され得る。

種の拮抗作用
これらのモデルに利用されるいくつかの微生物(同じ種であるが異なる分離株、実験室および/または臨床株を含む)は、バイオフィルム形成中に他の微生物と競合する可能性があり、一部の微生物種47の増殖を阻害する可能性がある。Sadiqらによる研究では、微生物のさまざまな組み合わせが、微生物の相乗効果(または拮抗作用)から生じるバイオフィルムバイオマスにどのように影響するかが強調されました48。バイオフィルムモデル内でのこのような相互作用の調査は、研究グループにとって興味深いかもしれませんが(例えば、プレバイオティクスまたはプロバイオティクス治療のテスト)、他の人はそのような拮抗作用を考慮していない可能性があり、モデルを作成する際に多種種の複雑さに影響を与える可能性があります。

バイオフィルムの成熟期間
バイオフィルムの成熟タイムフレームを最適化することは、含まれる微生物の成長ダイナミクスと培養に使用されるモデルシステム(基層を含む)に依存する可能性があるため、非常に重要です。成熟時間が長くなると、後の病原体ではコロニー形成が改善する可能性がありますが、モデル内では、特に初期のコロニー形成者の細胞死が多くなります。逆に、未成熟なバイオフィルムモデルが宿主に及ぼす影響を調査したい場合は、インキュベーション時間を短縮することが重要になる可能性があります。Brownらによる研究では、同じ10種の創傷バイオフィルムモデルが、24時間、48時間、および72時間成熟したときにヒトTHP-1細胞で異なる炎症プロファイルを示したことが説明されており、バイオフィルムの成熟度が低いほど、炎症誘発性が高いことが示唆されています7。同様の結果は、多層組織モデルでも観察できます。また、バイオフィルム中の細胞死を最小限に抑えるためには、定期的な毎日の培地交換が必要であることに注意することも重要ですが、これは進行中の治療レジメンに応じて修正することができます。例えば、長期にわたる抗菌薬介入の影響を評価する場合などです。

「器官型組織の取り扱い、実験セットアップ、および組織プロセシング」のセクションでは、研究者のニーズに応じてインキュベーションの時間枠を調整できます。宿主と病原体の相互作用は、研究課題に応じて、1〜12時間などの早い時点から48時間および72時間の後の時点まで調査できます。第二に、抗生物質を含むすべての維持培地が供給されます。したがって、実験計画によっては、これらを削除するように注文する際に会社に要求する必要があります。インサートの下の培地は組織の上周縁と直接接触しませんが、モデル6,8に傷が加えられていない限り、組織への微生物の侵入を調査する場合は、抗生物質の除去を検討する価値があるかもしれません。

共培養刺激に使用される微生物材料は、上述したように、プランクトン性、使用済みバイオフィルム上清(ろ過済みおよび非ろ過済み)、バイオフィルム全体、またはバイオフィルムが組織とインキュベーションを超音波処理する範囲に変更することもできる。例えば、以前の証拠では、EpiSkinが提供するような組織モデルが、プランクトン性真菌と宿主の相互作用を調査するための有用なモデルを提供することが示されています:C. albicans、Candida auris、Malassezia furfur、およびTrichophyton rubrum細胞は、HOE、再建ヒト表皮(RHE)、またはヒト膣上皮の末梢組織層に付着して相互作用することが示されており、これらの研究のいくつかは宿主応答の刺激を示しています真菌感染後1,5,6,11,12,49。細菌と宿主の相互作用についても同様の論文が存在し、例えば、フケの頭皮微生物叢に関連する一般的な病原体であるCutibacterium acnesのバイオフィルム形成は、単独で培養した場合、および真菌性皮膚生物であるMalassezia restrictaと培養した場合に、RHEの表面で研究されています10。他の研究者は、ブドウ球菌属のRHEへの付着能力を調査し、この細菌-宿主相互作用の物理化学的および微生物学的特性を測定した50。今回、N'Diayeたちは、ヒト由来の神経ペプチドであるカルシトニン遺伝子関連ペプチドが、RHE組織モデル51の黄色ブドウ球菌の病原性にどのように影響したかを調べた。他の研究者は、ヒト角膜上皮の緑膿菌感染に対するプロバイオティクス介入の保護効果を調査しています14。一方、ポリマイクロビカルの観点からは、さまざまなグループが混合種のバイオフィルムがさまざまな組織基質に及ぼす影響を研究してきました2,3,7,13。

全体として、上記で参照したこれらのプロトコルと研究は、宿主と病原体の相互作用を調査するための器官型組織モデルの膨大な範囲のアプリケーションを文書化しています。研究は、EpiSkinモデル、特にRHEスキンモデルが、腐食/刺激52,53,54,55について化粧品をテストするための良好な適用性を有することを示しているが、これらと現実世界のex vivo組織外植片または市販の組織の他の供給者との間には、いくつかの制限が存在する56,57.1つの明らかな制限は、すべての市販の組織モデルが無菌の「無菌」環境の細胞株から生成され、つまり、組織が微生物の摂動にさらされたことがないということである:これは、生体内で見られるものやex vivo組織外植片の刺激後に見られるものをはるかに超えて、宿主の炎症反応を悪化させる可能性がある57.逆に、これらの実験室モデルシステムには、in vivo組織に関連する結合層や血管系、ex vivo組織摘出中に保存できる特性、および炎症反応に影響を与える特徴は含まれていません。実際、最近の系統的レビューでは、生体材料58を含むさまざまな工学技術を使用して作成された適切な血管系を持つ組織モデルを利用するために、慎重な検討がなされるべきであることが強調されています。たとえば、最近の研究では、歯肉線維芽細胞と微小血管内皮細胞を埋め込んだフィブリンベースのマトリックスを使用して、血管新生歯肉組織同等物を作成しました。著者らは、健康または疾患関連微生物への曝露後のモデルにおける異なる炎症反応について説明した59。商業的な観点からは、現在では、表皮に線維芽細胞が重なった真皮からなる全層組織を含む「T-Skinモデル」など、より複雑なモデルが存在します。このような複雑なモデルが表皮のみのシステムとどのように比較されるかを見るのは興味深いでしょう。

完璧なモデルはありませんが、器官型組織モデルは、動物研究を行う際の3つのR(Replacement、Reduction、Refinement)で概説されているフレームワークに沿って、前臨床試験の有望な代替手段を表しています。この目的のために、動物モデルはバイオフィルム関連のヒト疾患の複雑な病態生理学的性質に関する重要な洞察を提供しますが、明らかな欠点があります。これらの3Dモデルは簡単に操作できるため、倫理的な承認なしに調査に大規模で微妙な変更を加えることができます。これらのモデルを上記の既存の複雑なバイオフィルムシステムと組み合わせることで、宿主と病原体の相互作用の理解が大幅に向上し、 in vivo 研究に先立って新しい治療法の成功をより正確に予測できます。

開示事項

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著者は何も開示していません。

謝辞

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著者らは、Saeed Alqahtaniが記載されている組織モデルに関連する関連プロジェクトを実行するための資金援助を提供してくれたHaleonと、Muhanna Alshehriの博士課程への資金提供を提供してくれたサウジアラビア教育省に感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
13 mmハイドロキシアパタイト(HA)ディスクPlasmaBiotalLimited n / a(受注生産)歯の表面を模倣した口腔バイオフィルム形成用基板
19 G針(40 mm) VWR613-2028プレートからのHAディスクの取り外しや、
蓋付き24ウェルTC処理平底マイクロタイタープレート科学研究所用品3524 (100個入り)バイオフィルムおよび組織共培養実験の培養用プレート
酸洗浄ガラスビーズ (425-600 μm)メルク:Sigma-AldrichG8772RNA抽出の収量を改善するための組織溶解用  
Actinomyces naeslundii DSM 17233 ライプニッツ研究所DSMZn / a複雑なバイオフィルムモデルに使用された微生物の1つ
ビーズミル24ホモジナイザー(または同等品) Fisher Scientific15-340-163RNA抽出の収量を改善するための組織溶解  
ビジュー (7mL)Greiner Bio-One189170 (700個/袋)バイオフィルムの超音波処理に使用  
cDNA合成キット(大容量)サーモフィッシャーサイエンティフィック4368814(200反応用)組織RNAコロンビア
血液寒天培地(CBA)塩基サーモフィッシャーサイエンティフィCM0331B(500グラム用)好気性微生物を培養するためのCBAプレートの調製に使用されます
細動馬の血液E&O LaboratoriesDHB好気性および嫌気性微生物を培養するためのCBAおよびFAAプレートを補うために使用されます
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(dPBS:CaClなし<>sub2およびMgCl2)Merck:バイオフィルム超音波処理剤DB537
ATCC 10953American Type Culture Collectionn/a複雑なバイオフィルムモデルに使用された微生物の一つ
Fusobacterium nucleatum 亜種 (subspp.) vincentii DSM 19507ライプニッツ研究所 DSMZn/a複雑なバイオフィルムモデルに使用された微生物の一つ
GraphPad Prism (Version 10)GraphPad Software, Incn/aグラフ作成およびデータ分析用 
ヒトIL-8 ELISAキット(プレート付きコーティングされていないELISAキット)Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)88-8086-86 (10 x 96 tests用)使用済み組織培地のタンパク質評価用ELISAキットおよびプレート
Human Oral Epithelium (HOE) エピスキンn/a (受注生産品)共培養モデルシステムに利用される上皮組織
接種ループ (使い捨て、10 µL、または同等) Fisher Scientific12870155 (1000個入り)固体および液体培地での微生物学的培養用
MicroAmp Fast Reaction 96-well qPCR plates (0.1 mL) サーモフィッシャーサイエンティフィック4346907(10プレート用)組織マイクロバンクビーズのqPCR遺伝子発現プロファイリング用
Pro-Lab DiagnosticsPL.170微生物の保管とcyropreservation  
ヌクレアーゼフリー水Thermo Fisher ScientificAM9935 (10 x 1.5 mL)RT-PCR grade water for qPCR experiments 
シャーレ(90mm)フィッシャーサイエンティフィック(ステリリン) 11309283(500個入り)微生物培養用寒天プレートの調製に使用
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)サーモフィッシャーサイエンティフィック 18912014(100錠入り)微生物の標準化とバイオフィルム洗浄ステップのためのPBS
RneasyミニキットQiagen74106(250反応用)組織用カラムベースのRNA抽出キット 
ロズウェルパークメモリアルインスティテュート1640ミディアムメルク:シグマアルドリッチR7755-10L(10リットル用) バイオフィルム培養用メディア 
RT2プロファイラーアレイQiagen330171 (カスタムメイド)遺伝子発現プロファイリング用の既製プライマーを含むqPCRアレイ
Schaedler anaerobe 寒天塩基Merck: Sigma-Aldrich (Millipore)91019 (for 500 g)Fastdious Anaerobic Agar platesの調製に使用 
Schaedler 嫌気性菌ブロス CM0497B(500g用)嫌気性微生物増殖用液剤
スクリューキャップ ビーズバグOリングチューブ 科学研究所用品Z763837-1000EA (1000個入り)ビーズミル 24 ホモジナイザーで使用し、組織を溶解する
超音波処理バスフィッシャー サイエンティフィック (フィッシャーブランド)該当なしHA ディスクからのバイオフィルムの超音波処理用 
Streptococcus intermedius DSM 20753 ライプニッツ研究所 DSMZn/a複合体バイオフィルムモデルに使用された微生物の1つ
Streptococcus mitis NCTC 12261National Collection of Type Culturesn/a複雑なバイオフィルムモデルに使用された微生物の1つ
Streptococcus oralis NTCC 11427 National Collection of Type Culturesn/a複雑なバイオフィルムモデルに使用された微生物の1つ
SYBR-green (qPCRBIO SyGreen Mix Hi-ROX)PCR BiosystemsPB20.12SYBR-green mix for qPCR 
トッド・ヒューイット・ブロス・メルク:シグマ・アルドリッチT1438 バイオフィルム培養用メディア 
トリプトン大豆ブロス(TSB)培地メルク:Sigma-Aldrich22092(500 g用)好気性微生物の増殖用液体培地
セット(150 mm、ステンレス鋼、鋸歯状)RS-Pro 545-187HAディスクおよび組織インサート/組織抽出物の移動に使用
ユニバーサルチューブ (30mL)Greiner Bio-One201150 (400個/袋)液体培養中の微生物培養用容器 
Veillonella dispar NCTC 11831National Collection of Type Culturesn/a'Oneof the microorganisms used for the complex biofilm model
β-metacapthoethanolMerck: Sigma-AldrichM3148RNase deactivation in tissue samples(組織サンプル中の
のインサートから組織を切り出すために使用されます からのcDNA合成 ック 除Fusobacterium nucleatumとの細胞共培養のためのSigma-Aldrich dPBS. ピンSigma-Aldrich M3148 RNase deactivation)

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