ウサギの腰椎椎間板変性症モデリングのための経腹膜後腹膜アクセスと経皮的穿刺の比較

サマリー

このプロトコルでは、ウサギ椎間板変性症 (IVDD) モデルにおける経皮的および経後腹膜穿刺を比較しました。どちらの方法もIVDDを誘発しました。しかし、経後腹膜アプローチでは、より広範な変化と死亡率の低下がもたらされました。

要約

この研究では、ウサギで椎間板変性症 (IVDD) を誘発する 2 つの方法の有効性を比較します: 線維輪の経皮的および経後腹膜穿刺。15匹の健康なオスのニュージーランドシロウサギを、偽穿刺、経皮的穿刺、経後腹膜穿刺の3つのグループにランダムに割り付けました。死亡率、形態学的および組織学的評価、放射線画像、バイオマーカー分析を含む包括的な評価が行われ、2つの方法が正確かつ詳細に比較されました。この結果は、両方の穿刺技術がウサギモデルでIVDDを成功裏に誘導したことを示しています。しかし、経後腹膜アプローチでは、経皮的方法と比較して有意に低い死亡率を維持しながら、椎間板の変性変化がより顕著になりました。これらの知見は、IVDDモデリングにおける経後腹膜アプローチの利点を強調しています。この研究は、IVDDモデルの確立に関する貴重な洞察を提供し、腰痛の効果的な治療戦略に関する将来の研究の基礎を築き、最終的に患者の転帰を改善します。

概要

過去数十年にわたって、腰痛 (LBP) は、生活の質に影響を与える最も重要な筋骨格系障害として浮上してきました¹.LBPはますます重要な公衆衛生上の懸念事項となっており、労働力の損失や追加の医療費により、社会に大きな経済的負担を強いています^2,3。米国だけでも、LBPに関連する直接的および間接的なコストは、医療費、収入損失、労働損失など、年間1,000億ドルを超えています⁴。LBPは、椎間板変性症(IVDD)5,6,7,8によって引き起こされることが多い。LBPの罹患率が高く、経済的影響が大きいことを考えると、IVDDを正確にモデル化することは、治療戦略を探求するために非常に重要です。

IVDDの病態生理学を理解し、治療戦略を評価するために、さまざまな前臨床 in vivo 動物モデルが開発され、利用されている⁹。これらのモデルでは、外科的または化学的椎間板損傷、非侵襲的な機械的ストレス、遺伝子組み換え、および自然発生¹⁰を含む、椎間板変性を誘発するために複数の方法が採用されています。これらの方法の中で、外科的損傷はIVDD導入の最大64.9%を占め、針穿刺が主要な外科的技術^である11。針穿刺モデルは、確立が容易で、実験動物へのダメージが少ないのが特徴です。一般的な針穿刺アプローチには、腰椎椎間板腔への開放後腹膜アクセスと経皮的後外側穿刺が含まれます。挿入の深さは、X線写真によるモニタリングまたは針の長さを使用して決定できます。特に、経皮的アプローチは、開腹手術法と比較して医原性組織の損傷を減らす可能性がありますが、後腹膜アクセスは、以前の文献で定量的に比較されていない直接的な視覚化機能の利点を提供します。IVDD導入に対する異なる直径の針¹² を使用し、異なる椎間板¹⁰ に穴を開けることの効果が研究によって調査されている一方で、異なる針穿刺アプローチに焦点を当てた比較研究は依然として限られている。選択されたウサギモデルは、ヒトの椎間板との解剖学的類似性や、サイズと構造の点でげっ歯類モデルよりも優れていることから、頻繁な画像評価を伴う費用対効果の高い縦断的研究を必要とする研究者にとって特に有用である¹³。

この研究では、腰椎椎間板腔を穿刺するための開放後腹膜アクセスと経皮的後外側穿刺の2つの方法を使用して、腰椎IVDDのウサギモデルを確立しました。形態学的、組織学的、および放射線学的変化を含む包括的な一連のアウトカム指標が分析されました。

プロトコル

動物実験手順は、国立衛生研究所が発行した「実験動物の世話と使用に関するガイド」を厳格に遵守し、成都中国伝統医学大学の実験動物倫理委員会によって承認されました(倫理承認番号:2021-23)。生後4か月の健康な清潔なグレードのニュージーランドシロウサギ(2.25 kg±0.25 kg)15匹(オス7匹、メス8匹)を使用しました。動物は、室温が23°C±3°C、湿度が約60%±10%の環境で1週間の適応期間を過ごし、水と餌を自由に摂取することができました。実験に先立ち、15匹のウサギを偽グループ(グループA)、経皮的線維輪穿刺グループ(グループB)、経後腹膜腔輪線維症穿刺グループ(グループC)の3つのグループのいずれかにランダムに割り当て、各グループに5匹のウサギを配置しました。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1. 経皮的線維輪穿刺 による ウサギIVDDモデルの確立

注: ウサギ IVDD モデルは、経皮的線維輪穿刺法を使用して確立されました。この手順は、Luo TD et ^al.14 によって記述された穿刺モデリング法に従い、X 線ガイドの下で実施されました (図 1)。

1. ウサギを準備します。
   1. 手術の24時間前にウサギを絶食し、水へのアクセスを確保します。
   2. 耳の静脈に 3% ペントバルビタールナトリウム (1.3 mL/kg) を静脈内注射 して 麻酔を投与します (施設で承認されたプロトコルに従います)。
   3. 不動、筋肉の弛緩、角膜反射の欠如、および痛み反応の欠如をチェックすることにより、麻酔の成功を確認します。
2. ウサギを配置してマークします。
   1. ウサギを固定ボードの上で腹臥位に固定します。
   2. 手術部位を剃って準備し、骨のランドマークを触診します。
   3. ウサギの腰椎の背中にある骨のランドマークを触診します。ウサギの最も低い肋骨(通常はL1棘突起のすぐ上の椎骨に対応します)を見つけます。
   4. この椎骨のすぐ下にある棘突起を特定し、L1棘突起を決定します。
   5. 腸骨稜の最高点を、L6椎骨とほぼ同じ高さに配置します。
   6. L1棘突起から逐次追跡し、各棘突起をL7まで順次同定します。
   7. マーキングペンを使用して、ウサギの背中にL1棘突起をはっきりとマークします。
   8. 次の棘突起に移動し、L2としてマークします。
   9. 後続の各棘突起をL3、L4、L5、L6、およびL7としてマークし続けます。各マークが明確で、明確に識別できるように順番に並んでいることを確認してください。
3. 穿刺部位を見つけてマークします。
   1. 横突起を触診し、L5とL6の遠位端の間の中点を見つけます。
   2. このポイントに印を付け、その約1cm上に穿刺針を挿入する準備をします。
4. 穿刺針を挿入します。
   1. 穿刺針を水平に持ち、地面に向けて挿入すると、皮膚が壊れます。
   2. 針をL4椎体に到達するまで進め、X線ガイドの下で正しい位置を確認します。
   3. 針をL4-5椎間板に向かって約20°の角度でわずかに傾けます。.ディスクに穴を開け、X線検査で穴の正確さを確認します。
5. ディスクパンクを実行します。
   1. 必要に応じてX線ガイドを使用して、線維輪に正確に穴を開けます。
   2. L2-3とL3-4の椎間板に穿刺プロセスを繰り返し、それぞれに1回穿刺します。
   3. 穿刺深さを約5 mmに維持し、各ディスクの滞留時間を5秒にします。
6. 施術後のケア
   1. 穿刺部位を消毒し、包帯を巻く。
   2. ペニシリンを大殿筋に筋肉内注射し、ウサギあたり毎日40,000Uの投与量で3日間。.
      注意: 針が硬組織に接触した場合は、アプローチを調整してください。X線ガイドを使用して、正確な穿刺を行います。ウサギの回復を監視し、適切なケアを提供します。

2. 経後腹膜腔輪線維症穿刺 による ウサギIVDDモデルの確立

注:ウサギIVDDモデルは、経後腹膜腔輪線維症穿刺法¹² を使用して確立されました(図2)。

1. 手術の24時間前にウサギを絶食し、水にアクセスできるようにします。
2. 耳の静脈に3%ペントバルビタールナトリウム(1.3 mL / kg)を静脈内注射することにより、ウサギに麻酔をかけます(施設で承認されたプロトコルに従います)。
3. ウサギが動かず、筋肉が弛緩し、角膜反射がなく、圧力に対する痛みの反応がないことを確認して、麻酔が成功したことを確認します。
4. ウサギを固定ボードの上で腹臥位に固定します。
5. 手術部位を剃り、準備します。
6. 骨のランドマークを触診し、ウサギの腰椎の背中にあるL1-L7腰椎棘突起をマーキングペンでマークします。
7. ウサギの横突起を再触診して、外科的切開位置を決定します。
8. 滅菌ドレープを配置し、局所的な皮膚を消毒して無菌状態を確保します。
9. 後後腹膜アプローチを使用して、筋膜と筋肉を層ごとに解剖し、腰椎椎間板の外側の側面を露出させます。
10. 穿刺針で線維輪を約5mmの深さと5秒の滞留時間で穿刺します。
11. L3-4、L4-5、およびL5-6椎間板を順番に穿刺し、各椎間板が一度だけ穿刺されるようにします。
12. 直径0.25mmの縫合糸を使用して、組織を層ごとに縫合します。
13. モデリング後、穿刺部位を消毒して包帯を巻いてください。
14. ペニシリンをウサギの最大殿筋に毎日、ウサギあたり40,000Uの用量で3日間筋肉内に注射します。.
    注:800,000ユニット/バイアルの仕様と承認番号の獣医医薬品140051251のペニシリンを使用してください。

3. IVDDモデルの選択とアウトカム評価

1. ウサギの死亡率と全身状態の評価
   1. ウサギを毎週観察して生存を判断し、精神状態、活動パターン、食物と水の摂取量、糞便と尿の量など、一般的な状態を記録します。
   2. 観察結果を正確に記録し、状態の変化に注意してください。
2. ウサギの体重モニタリング
   1. モデル確立前とモデル確立後、および組織採取前のウサギの体重を記録します。
   2. 正確な重量記録を確保し、重要な変更に注意してください。
3. 放射線評価
   1. モデル確立前とモデル確立後 4 週間後に、各白ウサギの腰椎外植片配列全体の矢状 1.5T T2 強調磁気共鳴画像法を取得します。
   2. 椎間板変性の程度を観察します。
   3. Griffith et ^al.15 によって提案された修正された Pfirrmann グレーディング システムを使用して、椎間板変性の定量的評価を実行します。3 人の独立した盲検放射線科医に、確立された基準 (椎間板の高さ、髄核の信号強度、および線維輪の完全性) に従って T2 強調 MRI シーケンスを評価してもらいます。
   4. 不一致が1つの学年レベルを超える場合は、コンセンサスを通じて最終的な成績を決定します。すべての評価は、校正されたディスプレイ設定を備えた標準化されたDICOM表示ソフトウェアを使用して実施します。
4. 病理組織学的評価とスコアリング
   1. ペントバルビタールナトリウムの静脈内過剰投与を使用してモデリングの4週間後にウサギを安楽死させ(施設で承認されたプロトコルに従って)、その後、氷上でL2-L3、L3-L4、およびL4-L5椎間板を迅速に収穫します¹⁵。
   2. L2-L3ディスクを4%パラホルムアルデヒドで固定し、残りのサンプルを-80°Cで保存します。
   3. 固定ディスクを10% EDTAなどの脱灰溶液に浸し、完全な水没を確保します。効果を維持するために、2〜3日ごとに脱灰液を交換してください。
   4. 完全な脱灰が達成されるまで、脱灰プロセスを定期的に監視します(ディスクのサイズと厚さによっては、数日から1週間かかる場合があります)。
   5. 脱灰したディスクを流水で十分にすすぎ、脱灰溶液の痕跡を取り除きます。
   6. ディスクを一連の等級付けされたエタノール溶液に浸すことにより、ディスクを脱水します。これは、70%エタノールから始まり、徐々に100%エタノールまで増加します。各脱水ステップをグレードごとに1〜2時間実施します。
   7. 脱水ディスクにパラフィンワックス(融点56-58°C)を最低2時間浸潤させ、完全な浸透を確保します。
   8. 浸潤したディスクをワックスブロックに埋め込み、切片化のために配置します。ワックスブロックが冷まされ、完全に固まるのを待ちます。
   9. 埋め込まれたディスクを、ミクロトームを使用して薄く均一なスライス(5〜10μm)に切片付けします。切片をスライドガラスに取り付けて、組織学的染色や免疫組織化学^12,13などのさらなる分析を行います。
   10. ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色を行い、光学顕微鏡で画像を撮影し、IVD組織病理学的グレーディングスケール¹²を使用してHE染色スコアを割り当てます。
5. TUNELアッセイ
   1. 椎間板組織切片を脱ワックスして再水和し、抗原賦活化と膜透過化を行います。
   2. 試薬1(TdT)と試薬2(dUTP)の混合物を1:9の割合で加え、加湿チャンバー内でインキュベートします。
   3. 切片をPBSバッファーで洗浄し、DAPI染色剤を塗布し、室温で10分間暗所でインキュベートします。
   4. 全自動のパノラマスキャナーと処理ソフトウェアを使用して画像をキャプチャします。
6. サイトカイン検出
   1. 実験ウサギを安楽死させ(ステップ3.4.1)、腹部大動脈から血液サンプルを採取します。
   2. ウサギの血液サンプルを2000 × g 、25°Cで10分間遠心分離し、血清を血液細胞から分離します。上清(血清)を慎重に収集し、細胞の破片が含まれていないことを確認します。
   3. ELISAキットに記載されている指示に従って、血清サンプル中のTGF-βの発現を検出します。
   4. ELISAキットの指示に従って試薬と標準液を調製します。
   5. 血清サンプルをELISAプレートの適切なウェルに加えます。
   6. キットの指示に従って、推奨温度と推奨時間でプレートをインキュベートします。
   7. 指示に従ってプレートを洗浄し、結合していない試薬を取り除きます。
   8. キットのプロトコルに従って、検出抗体とその他の必要な試薬を添加します。
   9. プレートを指定された時間と温度で再度インキュベートします。
   10. プレートをよく洗って余分な試薬を取り除きます。
   11. 基質溶液をウェルに加え、推奨期間インキュベートして発色を可能にします。
   12. 分光光度計を使用して、キットの説明書に指定されている波長で光学密度(OD)を測定します。
   13. 提供された式にOD値を代入するか、標準の既知の濃度から生成された標準曲線を使用して、サンプル濃度を計算します。

4. 統計解析

1. 市販のソフトウェアを使用して統計分析を行います。
2. 連続変数を平均±標準偏差として表します。
3. 一元配置分散分析を使用して、グループ間の違いを検定します。
4. ペアワイズ比較にLSDテストを適用します。
5. 反復測定ANOVAを使用して、反復測定データを分析します。
6. スピアマン相関分析を実行して、変数間の相関を評価します。
7. 有意水準を α = 0.05 に設定し、0.05 未満の P 値を統計的に有意な値と見なします。

結果

外科的処置は合併症なく行われました。グループB(経皮的穿刺グループ)のウサギ1匹が手術後に死亡しました。他のすべての動物は、術後に正常な摂食と活動パターンを再開し、実験期間中は生存しました。手術部位では長期にわたる出血や感染は観察されませんでした。

死亡率と全身状態の評価
死亡率は、グループA、グループCともに0%であったのに対し、グループBは20%であった(表1)。グループAのウサギは、通常の一般的な状態を示しました。モデリングする前は、グループBのウサギは偽グループのウサギと同様の条件を示しました。しかし、モデリング後2日目に、グループBのウサギは、活力の低下、活動の低下、ケージの隅で身を寄せ合うことを好むこと、食物摂取量の大幅な減少、水分摂取量が比較的変化しないこと、毛皮が鈍いこと、糞便量の増加、便が緩いことを示しました。時間が経つにつれて、グループBのウサギ1匹が死亡しましたが、残りのウサギは徐々に食物摂取量をモデリング前のレベルに戻しました。しかし、その活力、活動性、毛皮の状態、便の粘稠度は、モデリ...

ディスカッション

この研究の結果は、ウサギモデルにおける椎間板変性症(IVDD)の誘導に経皮的および経後腹膜穿刺アプローチの両方が有効であることを示しています。特に、全身状態、死亡率、病理組織学的評価、TUNELアッセイ、および血清TGF-βレベルの包括的な評価に基づいて、経後腹膜穿刺モデルは、死亡率を低く保ちながら、椎間板のより広範な変性変化をもたらしました。

外科的損傷は、IVDDモデルを確立するために最も一般的に使用される方法です。Lipson and Muir(1981)が外科的メス弁輪切開^術16を使用してウサギのIVDDモデルを成功裏に開発して以来、針穿刺12,14,17、輪線維切開¹⁸、全椎間板切除術、部分的および全核切開

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.3 T 獣医学 Maenetic Resonance lmaging(MRI)	NINGBO CHUANSHANJIA	CSJ-MR
アルコール 医療	LIRCON	20230107
ベンジルペニシリン カリウム	江西 Keda 動物 医薬品	140051251
止血鉗子	SHINVA	20211239
注射器	CONPUVON	20153151307
ナイフ刃Hons	Medincal	20210615
Medical吸収性コットンボール	Cofoe	20210006
Medical縫合針	Shanghai Xiaoyi Medical Devices
髄質穿刺針	揚州江州医療機器	20190902	腰椎椎間板
生理生理食塩水	NeilMed を
ポビドンヨウ素溶液	四川IJIS Medical Technology
20221209 準ミクロ天びん	エクスプローラー
ラビット解剖手術台	Zhenhua Biomedical	ZH-BXT-3Z
Shaver	AUX
統計分析 softeare	IBM	SPSS
滅菌ガーゼ	Cofoe	20202140675
手術用手袋	DR.LERSH	20172140028
サージカルナイフ	Hons Medinca	20210019
外科用ピンセット	SHINVA	20210233
USB-Cデータ伝送ライン	KINI
白色光写真顕微鏡	ニコン	エクリプス CI-L