単一エンドリソソーム小胞分析のためのパッチクランプ技術

Summary

このプロトコールでは、手動のエンドリソソームパッチクランプシステムを使用して、細胞内小胞のイオンチャネル活性を直接測定する方法を詳しく説明しています。エンドリソソームを拡大し、これらの小胞を手動で単離する方法を説明します。このアプローチにより、研究者は手順を正確に再現して適用することができます。

Abstract

エンドリソソームイオンチャネルは、エンドリソソームイオンとpHの恒常性、膜電位調節、および小胞輸送に重要です。しかし、小さな細胞内小胞内のこれらのチャネルに電気生理学的にアクセスすることは困難でした。エンドリソソームパッチクランプ技術の開発は、この障壁を克服するのに役立ち、エンドリソソーム膜のイオンチャネル活性の直接測定を可能にしました。

既存の平面パッチクランプ技術と比較して、エンドリソソームパッチクランプは複数の細胞を同時に記録し、他の測定方法と簡単に組み合わせることができます。手動操作には、標的となる小胞を視覚化できるという利点があります。また、エンドリソソーム膜の片側にCa²⁺ が不可欠に存在するという制限にも対処し、実験デザインの柔軟性を高めます。エンドリソソームパッチクランプ技術を利用することで、エンドリソソーム内のイオンチャネル活性を直接測定および分析できます。

エンドリソソームイオンチャネルの異常な機能と神経変性疾患や代謝性疾患などの疾患との間には密接な関連性があることから、これらのチャネルを調査・調節することで、新たな創薬標的が明らかになる可能性がある。細胞内イオンバランスを回復させることで、関連疾患の緩和や治癒につながる可能性があります。したがって、この手法は、新しい薬剤標的を発見し、関連する薬剤を開発するために極めて重要です。

Introduction

イオンチャネルは、多くの生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしています。表面イオンチャネルが大きな注目を集める一方で、細胞内チャネル、特にエンドリソソーム内のチャネルの重要性が徐々に認識されつつあります。エンドリソソーム系は、リサイクルエンドソーム(RE)、初期エンドソーム(EE)、後期エンドソーム(LE)、リソソーム(LY)、およびエンドリソソームとファゴソームやオートファゴソームなどの他のコンパートメント特性の両方を持つハイブリッドオルガネラなど、基本的な細胞機能に特化した多機能の膜結合オルガネラで構成されています。

EEは、ソーティングエンドソーム(SE)とも呼ばれ、原形質膜(PM)から内在化された材料の初期の目的地の1つです。EEは、LE/LYへの成熟経路による分解、PMに戻る急速なリサイクル経路、リサイクルコンパートメントまたは末梢REが関与する低速リサイクル経路など、貨物をさまざまなエンドサイトーシス経路に選別する役割を担う重要なコンパートメントです。エンドソームに由来する多胞体(MVB)は、制限膜に囲まれた球状のコンパートメントであり、管腔内小胞(ILV)¹で充填することができます。これらのオルガネラの正常な機能を維持するためには、小胞のpH、浸透圧、およびシグナル伝達を調節するための膜イオンチャネルが必要です。ただし、これらのチャネルのアクティビティを測定するのは簡単ではありません。

原形質膜上に位置するイオンチャネルについては、1970年代に開発されたパッチクランプ法が長らくゴールドスタンダードの手法^でした2。しかし、小さな細胞内小胞内の電気生理学的チャネルにアクセスすることは依然として課題でした。細胞膜上のイオンチャネルを測定するためのゴールドスタンダードを細胞内小器官のイオンチャネルに適用することは、主に3つの課題に直面しています。まず、エンドリソソームのサイズは通常非常に小さい(直径1μm未満)ため、顕微鏡での観察や分離が難しく、一般的なガラス製マイクロピペットの開口径よりも小さいため、実験ができなくなります。次に、オルガネラの完全性を維持しながら、エンドリソソームを標的細胞から直接単離するには、特別なスキルが必要です。第三に、細胞内小器官には細胞骨格がないため、パッチピペット内のエンドリソソーム膜にシールを形成し、それを破裂させて全エンドリソソーム構成を達成することは、オルガネラ³の構造的完全性を損なうため、困難な場合があります。

これらの問題を克服するために、脂質二重層の記録、リソソーム標的配列の修飾、固体支持膜ベースの電気生理学(SSMまたはSSME)技術など、いくつかの方法が開発されています。脂質二重膜記録法は、精製されたイオンチャネルを用いて合成リン脂質膜を再構築し、制御された条件下での膜タンパク質機能の詳細な電気生理学的研究を可能にする^4,5。イオンチャネル上のリソソームターゲティング配列の修飾には、従来のパッチ^{クランプ法6}を用いた測定のために、エンドリソソームイオンチャネルを原形質膜に向け直すことが含まれる。固体支持膜ベースの電気生理学(SSMまたはSSME)技術は、エンドリソソーム平面パッチクランプ法とも呼ばれ、微細構造の平面ホウケイ酸チップに小さな開口部(直径<1μm)を持つ固体基板平面ガラスチップを使用します。これらの小口径ガラスチップは、圧力吸引制御システム(Nanion)を使用して、天然のエンドリソソームであっても小さなエンドリソソームの分析を可能にします。しかし、最初の2つの方法では、イオンチャネルは自然な生理学的環境にありません。リソソームチャネルを原形質膜上に発現させたり、脂質二重層に再再構成したりする試みは、主に不確実で矛盾する結果をもたらしました。

平面パッチクランプ技術は、人為的な干渉の問題に効果的に対処し、ハイスループット測定の利点を提供しますが、使用されるソリューションもこの方法によって制限されます。本稿で紹介するエンドリソソームパッチクランプ法は、複数の細胞を同時に記録し、他の測定方法と簡単に組み合わせることができます。手動操作は、ターゲット小胞を視覚化する利点を提供します。また、エンドリソソーム膜の片側の溶液中のCa²⁺の避けられない制限を克服し、実験計画の自由度を高めます³。近年、エンドリソソームパッチクランプ法が医薬品開発研究において重要な役割を果たしています。例えば、神経変性疾患では、この技術は、アルツハイマー病やパーキンソン病に関連するエンドリソソームイオンチャネルを標的とする新薬の同定に役立っています^7,8。研究者は、この技術を使用して、^{腫瘍細胞9}におけるエンドリソソームイオンチャネルの役割を探索し、それによって腫瘍の成長と増殖を制御することもできます。代謝性疾患に関しては、エンドリソソームパッチクランプ研究により、エンドリソソームイオンチャネルを制御する化合物が明らかになり、糖尿病や肥満に対する新しい治療法が提供されています。エンドリソソームパッチクランプ技術は、エンドリソソームの機能障害を理解し、潜在的な治療法^{を見つける}のに役立ち6、エンドリソソームイオンチャネル機能の理解を大幅に高め、新しい薬物標的の発見を促進します。

Protocol

1. インストゥルメントのセットアップ

1. ハードウェア
   注:標準的な電気生理学リグのセットアップについては、 図1 を参照してください。
   1. テーブルとファラデーケージを使用して、セットアップを外部干渉から保護します。
   2. マイクロマニピュレーター付きの倒立顕微鏡を使用して、微小電極を安定して位置決めします。
   3. 集録した信号を収集して増幅するためのアンプをセットアップします。
   4. デジタイザを使用して、アナログ信号をデジタル信号に変換します。
   5. データ取得および解析ソフトウェアを使用して、実験プロトコルを設定し、収集したデータから意味のある分析可能な結果を抽出します。
2. 電極
   1. バス電極とピペット電極の2つの電極を使用します。
      注:プラチナと塩化銀は最高の分極特性を持っています。塩化銀電極は、塩化銀線またはペレットで構成されているため、ワイヤまたはペレットの外面にAgCl層があります(図2)。
3. ピペットの準備
   1. 曳曳
      1. キャピラリーチューブをプーラーに取り付けます。
         注:以下のピペット製造に使用されるパラメータは、機器固有です。この論文で使用した機器は 、資料の表に記載されています。
      2. ヒーターフィラメントが焼損しない実験条件(室温22°C、スルーシェイプヒーターフィラメント、フィラメント付きホウケイ酸ガラス)で、プーラーでRAMPテストを実行し、ガラスキャピラリーを溶かすのに必要な 熱値 (HEAT)を決定します。
      3. HEAT、速度(VEL)、および時間(TIME)パラメータを使用して、6つの個別のプルサイクルで新しいプルプログラムを設計します(表1)。
         注意: HEAT とは、ヒーターのフィラメントを加熱し、ガラスフィラメントを溶かすパラメータを指します。 速度 は、プーラーがフィラメントを両方向に引っ張る速度を示します。 時間は 、各サイクル間の間隔の期間を表します。
      4. キーパッドの緑色の プル ボタンを押します。
      5. clを緩めますampノブを緩め、ピペットをプーラーから取り外します。
      6. マイクロフォージの接眼レンズの下にあるピペットチップを点検して、チップの直径、シャープネス、および形状を判断します。先端径が0.5〜0.9μmであることを確認してください。
         注:フィラメントの使用頻度が高くなると、ガラスキャピラリーを溶かすのに必要な熱量が変化します。
      7. チップサイズが期待に沿わない場合は、HEATパラメータとVELパラメータを調整します。温度が高く、速度が速いほど、先端が細く長くなり、 その逆も同様です。 HEAT を 5度 刻み、 速度 を 3度刻みで調整します。
   2. 研磨
      1. 引っ張ったパッチピペットをマイクロフォージホルダーに入れます。
      2. 35倍の対物レンズ(15倍の接眼レンズと組み合わせると、 525倍の 倍率が得られます)を使用してピペットチップを検査します。
      3. マイクロマニピュレーターを使用して、パッチピペットをフィラメントに近づけます。
      4. 温度ダイヤルを 80 に設定します。
      5. フットスイッチを使用してヒーターをオンにし、短時間の 熱パルス (1〜2秒)を印加して、マイクロ鍛造接眼レンズを通じて研磨プロセスを監視します。
      6. すべてのピペットが磨かれるまで、このプロセスを繰り返します。
      7. 完成したピペットは、ほこりが入らないように密閉された箱に入れます。
         注:目標は、チップをすばやく溶かして、ガラスが鋭くなりすぎないように最終的なチップの形状を再構築することです。これにより、ピペットが押し付けられた小胞膜に浸透するのを防ぎ、シール形成を効果的に促進します。最終的なポリッシュの後、ピペットチップの内側の経路は非常に狭く、まっすぐで、直線的である必要があります。
         最高のレコーディングピペットは、通常、ファイヤーポリッシング後の 抵抗 が 5〜8MΩ です。 先端開口径 は 2μmとしてください。完璧に研磨されたパッチピペットは、ギガシールの形成を成功させるために不可欠であり、これは手順の成功に不可欠な技術の1つです。

2. サンプル調製

1. 細胞培養(HEK293を例に)
   1. 標準的な加湿インキュベーターで、5% CO₂を含む37°Cで細胞を培養します。
   2. HEK293細胞を、10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、100 U/mLペニシリン、および100 mg/mLストレプトマイシンを添加した低グルコースDMEMで培養します。
   3. ポリ-L-リジンコーティングされた12 mmカバースリップを24ウェルプレートに入れます。
2. オルガネラの拡大
   1. 24ウェルプレートのHEK293細胞に1 μMのバクーリン-1を添加し(ステップ2.1から)、5% CO₂ で37°Cで一晩インキュベートし、拡大した小胞が形成され始めるまでインキュベートします。
      注:拡大したエンドリソソームのサイズは、ツール、化合物、インキュベーション時間、および細胞タイプに応じて、1〜10μmに達することがあります(図3 および 表2)。
3. 溶液調製
   注:標準溶液調製は、細胞内および細胞小器官内のイオン濃度をシミュレートすることを目的としています。例えば、リソソーム上のイオンチャネルを測定するための標準的な溶液は、以下の通りです。
   1. 入浴液を調製する(mM):140 K-メタンスルホン酸(MSA)、5 KOH、4 NaCl、0.39 CaCl₂、1 EGTA、10 HEPES。KOHでpHを7.2に調整します。グルコースを使用して浸透圧を300 mosm / Lに調整します。
   2. ピペット溶液を調製する(mM単位):140 Na-MSA、5 K-MSA、2 Ca-MSA、1 CaCl₂、10 HEPES、10 MES。MSAでpHを4.6に調整します。グルコースで浸透圧を310 mosm / Lに調整します。
      注:溶液を0.2μmフィルターに通し、50mLコニカルチューブに45mLのアリコートを調製し、4°Cで最大2〜4週間保存します。

3.オルガネラの分離

1. 処理した細胞の入ったカバースリップ(セクション2を参照)を24ウェルプレートから取り出し、顕微鏡チャンバーに移し、1 mLの入浴液を加えます。
   注:エンドリソソームの単離、シーリング、および記録を含む全エンドリソソームパッチクランプ実験のために、細胞を>1時間浴溶液に保存してはなりません。1時間後、拡大したエンドリソソームは収縮してピペットに付着し、分離が困難になります。
2. 自家製のプラスチック製充填針を使用して、アイソレーションピペットにピペット溶液を充填し、パッチクランプセットアップのフロントエンドにピペットを取り付けます。
3. マイクロマニピュレーターの対角線移動角度を30°(工場出荷時の値)に近づけてください。
4. 顕微鏡(40倍対物レンズと10倍接眼レンズ)で、細胞膜の端近くにある十分に拡大したエンドソームまたはリソソームが単離のために細胞を調べます。アイソレーションピペットを選択したセルに近づけます。
5. マイクロマニピュレーターを使用して、アイソレーションピペットを原形質膜の端に接触するまで下げます(図4)。アイソレーションピペットを素早く水平に動かして、原形質膜の小片をはがします。
6. 同じピペットを使用して、細胞を反対側から押して、エンドソーム/リソソームを細胞から~2μmの距離まで絞り出します。
   注:オルガネラに細胞膜が残っていると、ギガシールの形成が妨げられる可能性があります。
7. 顕微鏡下で単離されたエンドリソソームを調べます。

4. ギガシールフォーメーション

1. 磨きたてのパッチピペットに適切なピペット溶液を入れ、ピペットをアンプのフロントエンドに取り付けます。
2. ピペットに 20〜50 mbar の正圧を加え(または、圧力制御のために1mLシリンジから0.03〜0.05mLを使用)、この圧力を維持します(バルブをロックします)。
   注: 1 mbar(ミリバール)= 0.001バール= 0.1 kPa(キロパスカル)= 1 hPa(ヘクトパスカル)= 1,000 dyn / cm2。
3. ピペットの先端を視野の中央にある浴液に移し、液体が浴液に流れ込むのを見るのに十分な圧力があることを確認します。
4. 電流パルス (+5 mV、5 ms) を繰り返し印加して、ピペット抵抗、シール抵抗、および直列抵抗を決定します。ピペットチップのサイズ、シール形成、および全エンドリソソーム構成の確立を監視します。
5. ピペットをターゲット小胞の上部にすばやく近づけます。ピペットからの流体の流れにより小胞が移動または転がるまで、ピペットを小胞に近づけます(図5)。
6. オフセットボリュームを調整しますtageピペットの0mVに。すぐに陽圧を解放します。理想的には、小胞はピペットに向かって引き寄せられ、膜に接続し、1秒以内にギガシール(1-20GΩ)を形成します.5mVの電圧パルスによって誘発される電流振幅の<10pAへの減少を探します。これは、ギガシール形成が成功したことを示します。
   注:ギガシールの形成には、安定した陽圧が不可欠です。場合によっては、チューブの漏れがギガシールの形成を妨げることがあります。漏れがないことを確認するために、圧力計を使用することをお勧めします。漏れが検出された場合は、チューブを再度取り付けるか、縫い目に少量のワセリンを塗布してシールを改善します。

5. 電流測定

1. メンブレンの破損
   注:実験のニーズに応じて、電極と膜の接触は、細胞付着モード、全細胞モード、インサイドアウトモード、およびアウトサイドアウトモードの4つのモードに分類できます(図6)。
   1. 全小胞記録の場合は、 200 μs または 500 μs の高電圧短パルス(ZAPパルス)を使用して、ピペットとオルガネラの接触点でメンブレンを切断します。電圧を -500 mV から -1,200 mVまで設定し、膜が破壊されるまで毎回 100 mV ずつ下げます。
   2. インサイドアウト(シングルチャンネル録音)モードの場合、ギガシールを形成した後、ピペットをオルガネラから引き離し、メンブレンの小さな破片を引き裂き、もともと小胞内腔に面していた側を露出させます。
   3. アウトサイドアウトモードは、ギガシールを形成して全小胞モードに移行した後、ピペットをオルガネラから引き離し、小さな小胞構造を維持しながらメンブレンの小片を引きちぎります。
2. 現在の録音
   1. エンドリソソーム電圧クランプパッチクランプ実験で入力電圧が変化するため、エンドリソソーム膜を横切る電流を記録します。
      1. これらの電圧は、電圧ステップまたは電圧ランプによって制御します。エンドリソソーム電圧クランプ実験では、幅広い入力電圧( -100 mV 〜 +100 mVなど)を使用します。

Results

エンドリソソームパッチクランプ実験中に観察された現在の形状について、以下に記載します。現在の形状が予想どおりでない場合は、接触不良または漏れが原因である可能性があります。参照電極が浴液と完全に接触していない場合、またはピペット電極が破損しそうな場合、接触不良が発生する可能性があります。チャンバーとカバーガラスの間に隙間があり、流体が対物レンズまたはステージに流れ込むと、漏れが発生する可能性があります。ピペット溶液が多すぎたり少なすぎたりすると、このような異常が発生する可能性があります。

溶液への針の挿入/細胞表面/ZAPとの針接触
リソソーム付着モードの確立(ギガシール形成)の間、電流応答は急速に減少します。シール抵抗は、コマンド電圧を低残電流量で割ることによって決定できます(図7)。

ランプ/リーク
-100mVから+100mVの範囲の連続入力電圧を繰り返し印加すると、...

Discussion

電気生理学的実験セットアップには、4つの主要な実験室要件があります:i)環境:サンプルを健康に保つ方法。ii)光学:サンプルを視覚化する方法。iii)力学:微小電極を安定して配置する方法。iv)エレクトロニクス:信号を増幅して記録する方法。

エンドリソソームパッチクランプ実験を成功させるには、いくつかの重要なステップが重要です。まず、細胞の状態-細胞はカバーガラスにしっかりと接着され、分離ピペットを使用して細胞を壊すときに細胞全体が動かないようにする必要があります。細胞が健康で十分に広がっていることを確認することが重要です。セルを所定の位置に固定できない場合は、カバーガラスの適切なコーティングに切り替えると役立つ場合があります。さらに、細胞密度を監視する必要があります。細胞密度が高すぎる(90%以上)と、薬物誘発性オルガネラ拡大の有効性が低下し、実験が困難になります。次に、パッチピペットの品質-パッチピペットの先端は適切なサイズ(5〜8MΩ)でなければならず、両側のガラスは滑らかで平行でなければなりません。

...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ホウケイ酸ガラス	製サッター装置	BF150-75-10	外径:1.5mm、内径0.75mm 長さ10cm、フィラメント付き
Digidata 1140A	Axon Instruments
倒立顕微鏡 IX73	OLYMPUS
MODEL P-97 マイクロピペットプーラー	SUTTER INSTRUMENT
MPC-200	SUTTER INSTRUMENT
MultiClamp 700B	Axon Instruments
POLISHER
クイックリリースチャンバー	Warner instruments	641943	QR-40LP, for 25 mm Coverslips