方法論記事

高倍率生細胞共焦点蛍光顕微鏡用等二軸延伸装置

DOI：

10.3791/67520

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2025年6月13日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), 2University of Barcelona (UB), 3Department of Physics, King's College London, 4ICFO-Institut de Ciencies Fotoniques, The Barcelona Institute of Science and Technology, 5Centro de Investigación Biomédica en Red en Bioingeniería, Biomateriales y Nanomedicina (CIBER-BBN), 6Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA)

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、空気圧で作動し、高解像度顕微鏡法と互換性のある汎用性の高い等二軸ストレッチデバイスを紹介します。

要約

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細胞は、さまざまな引張応力や圧縮応力など、生理学的および病理学的状況で機械的な力に絶えずさらされています。細胞や組織がどのように応答し、そのようなストレスに適応するか、そしてこれらの応答がメカノケミカルシグナル伝達とどのように統合されるかを探求する非常に活発な研究があります。そのため、標準的な細胞培養プロトコルや顕微鏡法と互換性があり、in vitro研究で生理学的ストレスを再現する洗練されたツールが必要とされています。この研究では、高解像度の光学顕微鏡および蛍光顕微鏡と互換性のあるストレッチデバイスの設計、機能、および特性評価を示します。空気圧ベースまたはモーターベースの数多くのストレッチ装置が開発され、現場で使用されています。これらのシステムの1つを、設計ガイドライン、さまざまなアプリケーション、および同様のセットアップを製造するためのすべてのツールなど、詳細に紹介します。このシステムは、変形可能なポリジメチルシロキサン(PDMS)膜に基づいており、真空塗布時に等軸方向に引き伸ばされ、均質で再現性のある制御されたサンプル株を提供します。これは、時間厳守で即時のストレッチから、制御された振幅と周波数の繰り返しストレッチリリースサイクルまで、さまざまな引張応力を提供します。接着タンパク質による基板コーティングにより、蛍光レポーターを持つ細胞を伸張装置に播種し、高倍率蛍光顕微鏡を使用して伸張時にこれらの細胞のライブイメージングを行うことができます。圧縮応力は、サンプルを伸張に適応させてから放出するか、伸張解放の前にサンプルを事前に伸ばした基材に播種することによっても加えることができます。PDMS基板のトポグラフィーパターニングを追加することで、同じサンプルを異なる顕微鏡モード(蛍光顕微鏡や電子顕微鏡など)でイメージングすることができます。ポリアクリルアミドゲルはPDMSメンブレンに付着させることもでき、その結果、異なる剛性の基質に播種された細胞が伸張します。全体として、生きたサンプルに制御された引張応力を加えることにより、この延伸装置は高品質の蛍光顕微鏡法と組み合わせることで、メカノバイオロジーにおけるさまざまな問題に対処できます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

薄く変形可能なポリジメチルシロキサン(PDMS)メンブレンは、PDMSが顕微鏡イメージングに適した確立された生体適合性不活性材料であるため、さまざまなカスタムメイドの延伸デバイス1,2,3で広く使用されています。ここでは、他の多くの4,5,6,7,8,9と同様に、真空を適用するという単純な概念を使用してメンブレンを変形させ、堅牢で制御可能な等軸ストレッチデバイスを組み立てます。メンブレンを円形のリングの内側にクランプし、リングを「ストレッチポスト」(図1A-C)の上部にシールすることにより、均一で等方的な変形が達成されます。生体サンプルは、自立型PDMSメンブレン上のリングの中心に位置し、蛍光顕微鏡によるイメージングが可能です。ここでは、2つの顕微鏡ステージモデル(図1D-F)と互換性があり、生物学的アプリケーションの観点から非常に汎用性の高い2つのカスタムメイドのセットアップを紹介します。全体的なデザインはシンプルで、他のステージに転置可能ですが、セットアップの寸法はイメージング要件に合わせて慎重に選択する必要があります。達成したら、デバイスのひずみプロファイルを特性評価し、検証する必要があります。

セットアップ自体とは別に、ひずみの大きさ、均質性、および等方性を特徴付けるためのMatlabコードを伴う簡単な方法が提示されます。その後、延伸装置を使用して、合成システム10、単一細胞11、12、または単層13に等二軸引張応力を加えることができ、同時に、蛍光顕微鏡を使用してサンプルの生物学的応答を高い時空間分解能で記録することができる。メンブレンは、異なる細胞外マトリックス接着タンパク質14,15で被覆することができる。生物学的研究のニーズに合わせて、追加の機能を追加することができます。例えば、ポリアクリルアミドゲルをPDMSメンブレンに結合させて、伸張しながら基質の剛性を調整することができ13,16、PDMSメンブレンは、サンプル12内の同じ関心領域の後方イメージングのための参照番号付きグリッドで作製することができる。固定伸長したサンプルは、免疫染色によって処理し、その後、蛍光イメージングのために再延伸することもできる17。適用されたストレッチパターンは、単一の即時ストレッチパルスから、さまざまな大きさ、周波数、または形状の周期的なひずみまで、制御することができる14,16。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ステージとストレッチポストの設計(図1)

  1. ステージサイズ/ホルダーおよび客観的な構成と寸法が互換性のあるストレッチポストを設計します。2 つの特定のストレッチ支柱を 図 1A、D に示します。
    注:このプロトコルで提供されるFreeCADファイル(補足フォルダ1)は、次のニコン顕微鏡およびステージと互換性があります:NI-SH-Eステージを備えたEclipse Ni-E直立、およびTI-S-ERステージを備えたEclipse Ti-E / B倒立ステージ、 図1D。ポストは3次元(3D)プリントできますが、繰り返し使用すると変形する可能性があります。アルミニウムベースのポストは、この欠点に悩まされることはありません。酸化を防ぐために、アルミニウムベースのポストは必ず陽極酸化してください。直立構成により、より大きな振幅の動きが可能になります。さらに、直立構成により、インターフェースなしでサンプルを直接イメージングできるため、変形可能なPDMSメンブレン基板の場合、光学的に有利です。代わりに、逆さまにした構成では、照明ビームはPDMS膜を通過します(図1F)。ストレッチ塗布時にPDMSメンブレンが移動するため、対物レンズの浸漬媒体は慎重に選択する必要があります(推奨される水浸タイプ、空気またはグリセロール、油浸はPDMS基板と互換性がないため推奨されません)。市販のホルダーは、追加のネジ穴を使用して変更できます。ねじ込み中のほこりを避けるために、プラスチックまたはテフロンベースのネジの使用に注意してください。 図1Eに示すように、ストレッチポストをステージの上部に取り付けることができるホルダーを設計すると便利です。このプロトコルで提供されるFreeCADファイルは、Eclipse Ni-E正立顕微鏡のステージと互換性があります。
  2. ストレッチポスト(図1A、B)とサイズが互換性のあるストレッチリング(図1C)を設計します。このプロトコルで提供されるFreeCADファイルは、対応するポストと互換性があります(サンプルを取り扱う際にリングを覆うために、その直径はペトリ皿のサイズと互換性があるように選択できます)。
    注:リングは、アルミニウムベース(陽極酸化)または3Dプリントすることもできます。ストレッチポストとリングを真空シールするための適切な直径のガスケットを含めます。
  3. オプション: 真空コントローラーを製作します。このプロトコルで使用される真空制御ボックスの電気マップは、補足情報に記載されています( 補足フォルダ2を参照)。これにより、延伸装置に適用される真空レベルを手動で制御できます。
    注:商用真空コントローラーも同様の機能を提供でき、通常は、さまざまな信号タイプ(正弦波、三角など)のアプリケーションを可能にする制御ソフトウェアを伴います。(フルイジェント、コバルト)。

2. 伸縮性メンブレンの作製

  1. 円形のプレートを設計します(推奨材料:ポリメタクリレート、PMMA)。これらのプレートがリングよりも幅が広く、スピンコーターとサイズが互換性があることを確認してください(図2A)。推奨寸法については 表 1 を、 補助フォルダ 3 を参照してください。
    注:ポスト1には、直径12cmが使用されました。ポスト2の場合、直径18-21cm。各使用の前および使用の間に、プレートは不織布ワイプと96%エタノールを使用して慎重に洗浄する必要があります。プレート内だけでなく、境界や下にもPDMSが蓄積しないようにすることが重要です。
  2. PDMS 1:10を調製し、よく混合して非常に均質なエマルジョンを得ます(推奨される攪拌スプーンを使用してください)。
    注:12 cmの場合、プレートあたり4.5 gを準備します。18cmプレートの場合、プレートあたり8g。複数のプレートを調製する場合は、追加のPDMSを準備します(たとえば、10プレートに対して必要以上に10 mL)。12cmのプレート10枚に対して、50gの成分Aと5gの成分Bを準備します。大型のレセプタクルを使えば、簡単にピペットで挟むことができるので便利です。レセプタクルには、PDMSの適切な回転と硬化を妨げる可能性のあるほこりやその他の汚れが含まれていてはなりません。PDMSの硬化を確実にするために、互換性のある素材の手袋を使用してください(ラテックスは避けてください、ビニール手袋が適切です)。
  3. 真空チャンバーを使用して最低1時間脱気します。
    注:あるいは、PDMSを50mLチューブを使用して0.2 × g で5分間遠心分離することもできますが、分注シリンジを使用してチューブからPDMS混合物を吸引するのは複雑であることに注意してください(ステップ2.4に必要)。PDMSの予備硬化を避けるために、直射日光で長時間(2時間以内)脱気しないでください。
  4. PMMAプレート上のPDMSスピンコーティング
    1. 4.2 mLまたは7.5 mLの脱気PDMSをPMMAプレートの上に分注します。
    2. 次の推奨設定を使用してプレートをスピンコートします。
      1. 500 rpmで5秒間スピンコートし、加速は100 rpm/sです。
      2. 500rpmで1分間スピンコートし、加速は300rpm/sです。
        注:PMMAプレートの底面に中心をマークすると、紡績および均質な紡糸中にプレートの中心を確保するのに便利です。ステップ2.4.2.1は、特に加速度パラメータを調整できない場合には必須ではありません。紡糸前にPDMSを広げるのに役立ちます。このプロトコルでは、厚さ約140μmのPDMSメンブレンが得られます(干渉法で測定; 補足図1 および 表2を参照)。スピンコーターのモデルやパラメータが異なる膜特性につながる場合に備えて、実験前にキャリブレーションを行う必要があります。
  5. 各プレートは、ほこりの蓄積を避けるためにシャーレに保管し、オーブン内で65°Cで一晩重合します。
    注意: 耐熱性のある皿の使用に注意してください。硬化条件は、適用された特定の真空レベルでのPDMS変形性に影響します。

3.リングに挟む膜

  1. 取り付け材の設計。
    1. スピンコーティングされたPDMS円形膜を敷設するために、内径/外径のPMMAリングを設計します(図2A)。 表 1 および 補足フォルダ 3 で提案されている寸法を参照してください。
    2. リングが収まる取り付けサポート(図2B)を設計し、メンブレンをリングに取り付けるときの高さによって事前ストレッチも決定されます。
      注:取り付けサポートは、既存の実験器具(ペトリ皿など)に基づく簡単なソリューションにすることができます。よりエレガントな解決策は、高さをユーザー定義でき、簡単に変更できるため、サポートを3Dプリントすることです(このプロトコルで提供されているこの部分のFreeCADファイルを参照、 補足フォルダ3を参照)。サポートの中央部分の高さは、取り付け時にPDMS基板がサポートに触れないように、ハーフリングの高さよりも小さく選択する必要があります(手順3.4.2のその他の使用を参照)。これには、ポリ乳酸(PLA)フィラメントを使用した3Dプリンター( 材料表を参照)が適しています。カッティングリングを設計し、3Dプリントしてメスのガイドとして使用することもできます(図2A)。
    3. メンブレンを取り付けながらリングに重量を及ぼし(図2C)、再現性のあるプリテンションにつながるサイズに適合する真鍮製の重りを設計および製造します。
      注:ここで提供されているFreeCADファイル( 補足フォルダ3を参照)は、このプロトコルで示されるリング寸法と一致します。
  2. PMMAプレートからPDMSメンブレンをはがします。
    1. 白いベンチペーパーの上にPMMAリングを準備します。
      注意: 取り付け中に紙がPDMSメンブレンに触れないように、ベンチと用紙を平らに保つことが重要です。
    2. ブレードでプレートの端を慎重に(1回または2回)回り、次に鋭利なピンセットで同じ端をトレースして、PDMSが全周に沿ってきれいにカットされていることを確認します(図2A)。
    3. ピンセットを使用して、メンブレンの一方の端を慎重に持ち上げます。次に、親指でPDMSシートの端をそっと剥がし、メンブレンの端を均等に持ち上げます。プレートの円周の半分に沿って、メンブレンの端をプレートから取り外します(図2A)。
      注:PDMSメンブレンの下に96%エタノールを数滴注ぐと、メンブレンを壊さずに持ち上げることができます。
  3. PDMSメンブレンを乾燥させます。
    1. 以前に準備したPMMAリングの上面全体(ステップ3.2.1)の周りの96%エタノールを拭き取り、指で均等に広げます。
    2. PDMSメンブレンを慎重に取り外し、前に持ち上げた端から持ち上げ(ステップ3.2.3で説明)、エタノールで覆われたPMMAリング上に対称的に置きます。PDMSからしわを取り除きますが、メンブレンを引き伸ばさないように注意してください。まっすぐにするだけです。
      注:この段階でプレストレッチを適用すると、適用された特定の真空レベルのPDMS変形性に影響します。
    3. エタノールが完全に乾燥したら、PDMSメンブレンがPMMAリングにしっかりとくっついていることを確認します。
  4. ストレッチリングを組み立てます。
    1. 別の空のPMMAリングを取ります。取り付けリングの上に置き、金属クリップを使用してそれらを一緒にシールし、PDMSメンブレンを2つのリングの間に挟みます(PDMSメンブレンサンドイッチ、図2B)。
    2. ストレッチリングの下半分を、手順3.1.2で設計した取り付けサポートに配置します(図2B)。
    3. PDMSリングサンドイッチをストレッチリングに置き、最後まで届くまでしっかりと押し下げます。PDMS基板は実装サポートに接触しません。ガスケットを正しい位置に固定します(図2B)。
    4. 円形の真鍮の重りをサンプルの上に置きます(図2C)。これにより、取り付けられたすべてのリングと同様の固定プリテンションが適用され、システムのキャリブレーション時にさらなる再現性が確保されます。
    5. 金属製のストレッチリングの上半分を上に置き、ネジ穴を合わせ、すべてのネジを取り付けて締めます(図2C)。
      注:この段階では、PDMSメンブレンは穴が開いているため、プロトコルをアンマウントしたり、後退したりしないでください。
    6. PDMSをブレードでリングの周りを優しく切ります(図2C)。
    7. メンブレンをほこりから保護するために、(たとえば、ペトリ皿で)カバーします(図2C)。
      注:PDMSをポリアクリルアミドゲルで官能基化する必要がある場合は、セクション5に進んでください。初期キャリブレーション測定については、セクション6に進んでください。PDMSリングを細胞播種に使用する場合は、セクション7に進みます。

4. PDMS膜製造のバリエーション:参照グリッドをパターン化

  1. フォトリソグラフィーを使用して作成されたSU8ベースのグリッドで「パターニング」されたPMMAプレート(PDMSスピンコーティング前)を準備します(図2D)。このためには、フォトマスクフィルム(アセテートマスク)を作成するための関心のあるパターンを設計します。
    注:このプロトコルで提供されるpdfファイル( 補足フォルダ4を参照)は、代替番号でグリッドを作成します。 図 2D を参照してください。グリッドは、パターンのサイズを考えると、Inkscape(またはClewinやFreeCADなどの代替手段)などのシンプルなソフトウェアを使用して作成できます。デザインは、外部の企業が写真フィルムに印刷できます( 資料の表を参照)。
  2. PMMAプレート上のフォトリソグラフィープロトコル(PMMA光学特性については 、補足フォルダー3 を参照)。
    1. PMMAプレートの酸素プラズマ処理を7 Wで20分間、0.8 barの一定の酸素流量で行います。
      注意: プレートの可能なプラスチック保護が取り除かれ、PMMAプレートが完全に透明であることを確認してください。
    2. 95°Cで5分間焼きます。
    3. 窒素ガンを使用してPMMAプレートを冷却し、12cmのPMMAプレートに4mLのSU-8 2100樹脂を置きます(異なるプレートサイズを使用する場合は容量を調整します)。
    4. 次のパラメータでスピンします(またはスピンパラメータを調整して、高さ約10μmの層を作成します):500rpmで100rpm/sの加速度で5秒、続いて4000rpmで30秒、300rpm/sの加速度で。
    5. 95°Cで2.5分間焼きます。
    6. アセテートマスクの存在下でPMMAプレートをマスクアライナーに置き、次のパラメータを使用します:i-ラインなし。広帯域露光(260〜460 nm)、25 mW / cm2、7.5秒露光。
    7. 95°Cで3.5分間焼きます。
    8. プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテートを使用して1分間パターンを作成します。
    9. イソプロパノールで広範囲に洗浄します。
    10. 明視野顕微鏡で低倍率対物レンズ(2-10倍)を使用してパターン品質の目視検証を行います。
      注:PMMAパターンプレートのシラン化により、繰り返し使用するためのパターンの寿命が延びます。このためには、パターン化されたPMMAプレートを酸素プラズマ処理で30秒間活性化し、その後、ケミカルフード内の真空下でトリクロロ(1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル)シランで1時間処理を行います。
  3. ステップ2.2から2.5のようにパターン化されたPMMAプレートを使用して、PDMS伸縮性メンブレンをスピンコートします。
    注:パターン化されたPDMSは、前述のように明視野顕微鏡だけでなく、走査型電子顕微鏡でも視覚化できます(図2D)。PDMSメンブレンをストレッチリングに取り付けながら、パターンのどちら側が上を向いているかに注意して、目的の向きのパターンを取得します。

5. PDMSメンブレンの上にポリアクリルアミド(PAA)ゲルを接着する

注:この手順は、PMMAプレートに取り付けられたPDMSメンブレン(セクション2を参照)または以前に取り付けられたストレッチリング(セクション3を参照)のいずれかで実行できます。ケミカルフードの下で作業します。加熱を伴う手順については、化学フードの下に小さなオーブンフィッティングを使用すると便利です( 材料の表を参照)。それ以外の場合は、サンプルをオーブンの密閉ボックスに保管してください)。

  1. PDMSメンブレンプレコーティング(図2E)
    1. 96%エタノールと10%(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTES)を微量遠心チューブ(例:180μLのエタノールに20μLのAPTES)で混合して、コーティング溶液を調製します。
    2. コロナプラズマディスチャージャーでPDMSメンブレンを1分間活性化します(または酸素プラズマクリーナーを使用して30秒間活性化します)。
    3. 200 μLのAPTES/エタノール溶液をメンブレンの中央に置きます。
    4. メンブレンを65°Cのオーブン内に1時間放置します。
    5. PBSで2回洗います。2回目の洗浄では、PBSを振とうしながら10分間放置します。
    6. PBSで3%グルタルアルデヒド(GA)溶液を調製します。1メンブレンあたり200 μLのGAを、APTESで処理したメンブレンの同じ領域に置きます。
    7. 25分待ちます(30分以内)。
    8. PBSで2回洗い、2回目は振とうしながら洗います。
    9. 液体を吸引し、PBSが完全に乾くまでリングを衰退位置に置きます。
  2. カバースリップのシラン化
    1. 6mLの反発シランを準備し、それをペトリ皿に注ぎます。
    2. 正方形の18mmガラスカバースリップを1枚ずつ丁寧に液体に入れます。
    3. カバースリップを5分間インキュベートします。
    4. ビーカーを2つ用意します。1つは96%エタノールを含み、もう1つは超純水です。
    5. ピンセットでRepel Silaneからカバーガラスを取り外し、最初に96%エタノールで洗い、次に超純水で洗います(カバーガラスは水洗いから「乾いている」はずです)。
    6. ペトリ皿の境界でさらに30分間乾燥させます。
  3. ポリアクリルアミド(PAA)ゲルのPDMSメンブレンへの付着
    1. Repel Silane処理されたカバースリップの半分をペトリ皿の底に配置します。
    2. 所望の剛性16,18のPAAゲルミックスを調製する。
    3. 各カバーガラスの上に10 μLのゲルミックスを一滴垂らします。
    4. 別のRepel Silane処理されたカバースリップを上に置いて、ゲルを広げます。.2つのカバースリップを合わせないでください。簡単に分離できるように、星型に配置されていることを確認してください。ジェルが平らになるように、カバースリップ領域を超えないように、ゆっくりと押します。
    5. 45分から1時間待ちます。
    6. ピンセットを使用してカバーガラスをそっと分離します。ゲルがカバースリップの1つに付着したままであることを確認してください。
    7. ゲルが付着しているカバーガラスを取り、以前にGAで処理したPDMS領域にゲルを接触させます(図2E)。
    8. 下と上から2本の指で5秒間押します。
    9. 37°Cで一晩インキュベートします。
    10. 翌日、リングにPBSを30分間充填します。
    11. ピンセットで上部のカバースリップをそっと取り外します。
    12. PDMSメンブレンの反対側から油性マーカーでPAAゲルの周囲を引きます。これは、次の手順でサンプルを見つけるのに役立ちます。
    13. PBSを吸引します。
    14. ゲル15への所望の細胞外マトリックスタンパク質の付着を容易にするために、官能基化ステップを行う。

6. 延伸装置の操作、ひずみ校正、分解能評価

  1. ひずみキャリブレーション用の蛍光ビーズを備えたPDMSストレッチリングを準備します。
    1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液に0.1 μmまたは0.2 μmの蛍光ビーズを1:50000希釈( 材料表を参照)で1:5000 希釈し、1 mLのPBS溶液と2 μLのビーズストック溶液を添加し、その後、中間溶液から10 μLの最終希釈をPBSの1 mLにすることで調製します。
      注:メンブレン上の高いビーズ密度は、キャリブレーションステップに最適です。ビーズの塊がキャリブレーション中の操作を助けるので、溶液を超音波処理しないでください。
    2. PDMSの中央に10〜30μLの液滴を置きます。
      注:取り付けサポートは、クロスツーセンターサンプル堆積で便利に設計できます
    3. 40°C以下で乾燥させ、二次硬化の交絡問題を回避してください。
  2. 分解能評価のために、蛍光ビーズ付きのPDMSストレッチリングを準備します。
    1. Coleとal.19 のプロトコルに従って、回折限界よりも小さい直径のビーズ(通常は直径0.1μmのビーズ)を使用してビーズ溶液を調製します。
      ( 資料の表を参照)。各中間ステップでビーズ溶液を慎重に超音波処理します。
    2. リングの中央にコロナ処理を使用して、PDMS基板を活性化します。
    3. すぐに20 μLのビーズ溶液を処理したPDMSの中央領域の上に広げ、乾燥させます。
      注:この場合、ビーズ溶液を高度に希釈し、親水性PDMS上でインキュベートして、広範囲に拡散させ、基質に吸着した単一の分離された0,1μmビーズを取得します。
  3. ストレッチ装置を顕微鏡ステージホルダーに取り付けます(図1F)。
    1. ストレッチポストを顕微鏡に取り付けます。
    2. ポストの円形領域(中央部分、 図1D、F)の上に潤滑剤(ワセリン)をたっぷりと塗ります。
      注:PDMS基板が摩擦を克服してポスト上をスライドするためには、潤滑剤の使用が必須であり、各サンプル間の潤滑剤をリフレッシュする必要があります。ワセリンは、このプロトコルで提示されるセットアップで非常に便利な潤滑剤として使用されます。
    3. 手順6.1で準備したストレッチリングをストレッチポストに取り付け、トップキャップをねじ込んでアセンブリをシールします。
    4. バキュームコントローラーをバキュームソースとストレッチポストに接続します(図3A)。
      1. 真空制御ボックスの背面を真空源に接続します(図3A)。
      2. ボックスの前面をストレッチポストに接続します(図1B、D、F)。
        注意: 真空源は、建物のインフラストラクチャで利用可能な真空ラインにすることができます。十分なストレッチには適度な真空が必要ですが、ストレッチリングの直径によって異なります(直径が小さい場合、同じ真空レベルでより小さなひずみが得られます)。あるいは、真空ポンプが市販されています(FloidentまたはElveflowは自律型真空ポンプを提供しています)。この場合、真空源への接続については、製造元の指示に従ってください。真空制御ソース(このプロトコルで提示されているカスタムメイドの真空制御ボックスや市販のシステムなど)のない真空供給は使用しないでください
  4. ひずみキャリブレーション
    1. 視野全体に高いビーズ密度があり、ユーザーが認識できるビーズの塊を含む対象フィールドを選択します( 図3Bを参照)。
    2. 選択した視野の「静止」画像を取得します(位置を保存します)。
    3. 低真空レベル(このセットアップでは-20 mbar)でストレッチを適用します。サンプルはすべての方向(X-Y-Z)に移動します。
    4. 最初にZ平面に再度焦点を合わせます。
    5. ステージを x-y 方向に動かして、静止状態で画像化されたのと同じ関心領域を見つけ、引き伸ばされた状態のビーズの画像にピントを合わせ、画像を取得します。
      注:サンプルの中心が非常にずれている場合、ひずみの大きさに応じて、関心領域は大きく移動します。変位は中心から離れるほど大きくなりますが、ひずみの大きさは基板上のサンプルの位置とは無関係です。ビニングなしで、2048x2048の解像度で画像を記録します。
    6. 緊張を解放します。より高い真空レベル(-30 mbar、-40 mbarなど)で手順6.4.3〜6.4.5を繰り返します。
      注:キャリブレーションの目的で、PDMSは変形時にヒステリシス動作をするため、再伸張する前に常に静止状態に戻してください( 補足図3Aを参照)。
    7. 2 つ目のストレッチ リングを取り付け、手順 6.4.1 から 6.4.6 を繰り返します。このキャリブレーションは、少なくとも 3 つの異なるストレッチリングに対して実行します。
    8. 取得した画像は、サンプルごとに整理されたフォルダに保存します。
    9. 各フォルダで、静止reference_str1時に取得した参照ビーズ画像、および真空 度stretched_str1、 stretched_str2、 stretched_str3などを増やして引き伸ばした画像に名前を付けます。
      注:この手順は、システムのコアキャリブレーションを構成します。ユーザーのニーズに応じて、同様のビーズサンプルを使用し、他の真空アプリケーションプロトコルを使用して追加のキャリブレーションを実施する必要があります。生物学的サンプルに適用されたひずみに似たひずみプロトコルを適用します(代表的な結果のセクションを参照)。
  5. Matlabコードを使用して、ひずみ20を定量化します。
    1. 次のリンクからMatlabフォルダ全体をダウンロードします https://github.com/xt-prc-lab/Le_Roux_et_al_2024_JOVE
      注:実行するメインコードの名前はgel_strain で、メインコードと同じフォルダに保存されている、指定されたとおりに保持する必要がある他のMatlabコードファイルを呼び出します。
    2. Matlabを開き、コード gel_strainを開きます。
    3. パラメーターを設定します (推奨設定については 、表 3 Code_Parameter を参照してください)。
    4. 親フォルダーと実験フォルダーのパスを、コードに示されているように定義します。
      注: フォルダが存在しない場合、コードには警告ポップアップが表示されます。[ パスに追加 ] を選択し、画像が保存されている実験フォルダーまで参照します。
    5. gel_strainコードを実行します。
    6. コードの要求に応じて stretched_str1 を開きます。
    7. コードの要求に応じて reference_str1 を開きます。
      注:このプロトコルで示されているように、引き伸ばされたすべての画像を一度に異なる真空レベルで処理すると便利です。すべてのファイルを同じ experimental フォルダーに格納する必要がありますが、コードは最初に引き伸ばされたイメージを開くように要求するだけです。イメージ名は strX 名で終わり、X はこの章のポイント 6.4.9 で示されているように、増分番号 1、2、3 などです。
    8. 結果フォルダが4つのサブフォルダとともに表示されることを確認します:トリミングおよび整列されたデータを含むCroppeddata。ビード変位ファイルを含む変位。半径方向の変位とひずみのプロットを含む画像。各真空レベルで取得されたひずみマトリックスのスプレッドシートを含むひずみ。
      1. 各真空レベルのひずみマトリックスの中央値を計算します。
      2. 各サンプル(最小3)に対して繰り返します。
      3. 3つのサンプルの真空レベルに対するひずみマトリックスの中央値をプロットして、検量線を取得します(図3C)。
        注:ビーズ画像がコードから適切に処理されない場合に備えて、いくつかのパラメータを変更できます。これを行うには、Matlab で set_settings_stretch ファイルを開き、コード コメントの推奨事項に従って Settings.Resolution と Settings.Overlap を変更します ( 表 3 も参照)。実験のニーズに応じて、生体サンプルに加えられるひずみは変化させることができます(サイクリックひずみ、より大きなひずみなど):これらの条件の較正が推奨されます( 補足図2 および 補足図3の例を参照)。
  6. 解像度評価(Cole et al.19によるプロトコルに従う)
    1. 手順6.2で準備したストレッチリングを取り付けます。
    2. 1 つのビーズ ドットを含む視野をイメージします (使用する目的に関連する Z ステップ距離のスタックをイメージします)。
    3. Cole et al.に示されているように、MetroloJ(フィジープラグイン)を使用して、ストレッチセットアップのX-Y-Z解像度を特徴付けます(図3D および 補足図4)。

7.細胞播種と伸張

  1. 細胞接着タンパク質によるPDMSのコーティング
    1. PDMSリングをUVライトに15分間さらして滅菌します(図4A)。バイオフードの下でプロトコルの後続のすべてのステップを実行して、無菌性を確保します。
    2. フードの下のプレートを滅菌PBSですすいでください。
    3. 細胞接着タンパク質11,14,15をインキュベートするには、リングの中央に溶液を100〜200μL滴沈殿させます(図4A)。
      注:一般的に、10μg/mLのフィブロネクチンの溶液が適切です11。PDMSのコーティングには、他の目的の接着タンパク質(ラミニン、ケラチン15など)を使用することができます。特定の処理/プロトコールが必要な場合があります。フィブロネクチンコーティングのインキュベーションは、4°Cで一晩行うことをお勧めします。別の方法は、37°Cで1時間です。
    4. PDMSメンブレンの下側から油性マーカーで液滴の周囲を描きます。これは、次の手順でサンプルを見つけるのに役立ちます。
  2. PDMSリング上の細胞播種(図4A)。
    1. 必要に応じて、ストレッチ実験の前に目的の細胞に蛍光タンパク質をトランスフェクションするか(一過性トランスフェクションの場合は、トランスフェクション方法と特性に応じて実験の1〜3日前)、または特定のプロトコルを使用して目的の蛍光マーカーを視覚化します。
      注:初期実験では、GFP-mem11,12などの原形質膜マーカーを使用して、細胞膜の応答と潜在的な破裂を視覚化すると便利です。このマーカーはトランスフェクションが容易で、トランスフェクションされた細胞をひずみレベルを上げて伸ばし、原形質膜の破裂につながるひずみ閾値を評価することをお勧めします。Supplementary Folder 5のプラスミドマップを参照してください。これは細胞の種類によって異なり、シングルセル実験では細胞単層に比べて低くなります。この膜マーカーは、低伸張レベルで原形質膜の破裂を引き起こすことが観察された一部の膜挿入色素とは対照的に、細胞の伸張に適合します。
    2. 実験当日は、細胞培地を温め、CO2非依存培地を調製します。
      注:顕微鏡にストレッチシステムと互換性のあるCO2 制御がある場合、実験は通常の細胞培養培地で行うことができます(これは、CO2非依存培地で生き残ることができない繊細なサンプルに必要なセットアップです)。CO2非依存性に抗漂白剤を添加することが推奨されます(例:GFPタンパク質の場合、10 mg / mLのルチンサプリメント21 )。
    3. 細胞をトリプシン化してカウントします。
    4. 少量(20-50 μL)に適切な数の細胞を標準細胞培地で播種して細胞の接着を促進し、CO2湿度制御インキュベーターに保管します。
      注:平らで大きな線維芽細胞および単一細胞実験の場合、5000細胞;数値は、細胞の種類と実験自体によって異なります。
    5. 20〜30分のインキュベーション後(最初の細胞付着を確認してください)、細胞の上に500μLの培地を穏やかに加えます。インキュベーターに戻し、細胞がさらに広がるようにします。
      注:播種時間は、細胞の種類と実験要件によって異なります。一晩のインキュベーションによる単分子膜の形成も可能です。培養培地の量はそれに応じて調整する必要があります。二次細胞染色:細胞が付着すると、SpyDNA( 材料表を参照)などの色素で染色して核を可視化したり(補足図5)、別の染色で目的の構造を可視化したりできます。生細胞の染色やトランスフェクションによるタンパク質の過剰発現は、特に細胞皮質、原形質膜、または機械感受性タンパク質/構造において、伸張に対する細胞応答に影響を与える可能性があることに常に注意してください。
    6. CO2に依存しないメディアに交換し、すぐにストレッチ装置で使用します。
      注:これで、サンプルはストレッチ実験の準備が整いました。
  3. 細胞伸張実験:線維芽細胞の動的PMリモデリングを捕捉するための単一の伸張放出サイクルと原形質膜(PM)のイメージングの例。
    1. ストレッチリングをセクション6のステップ6.2のように顕微鏡ステージに取り付けます。
    2. 目的のセルを見つけ、その位置を記録し、事前に引き伸ばされたセルの画像を撮ります(図4B)。
    3. 検量線に従って、目的の基板ひずみに一致する目的の真空を適用します。
    4. 引き伸ばされたセルを見つけるには、まず Z 軸に再度フォーカスを合わせてから、X-Y 方向に移動してセルを見つけ、視野の中心に戻します。
    5. 必要な期間に画像を記録します(図4B)。
      注:引張ひずみに対する細胞の応答を決定するには、一般的に初期実験が必要です(平均)。細胞を異なる基質ひずみで引き伸ばして、細胞が耐えられる最大引張荷重を決定します。細胞膜の破裂は、細胞にとってひずみが過剰である場合、原形質膜蛍光膜マーカーを通じて視覚化されるように発生します。
    6. 細胞の放出については、静止状態の細胞位置に戻り、顕微鏡の取り込みモード をON にして、サンプルの焦点が戻ったらすぐに取り込みを開始できるようにします。
    7. ストレッチを解除し、Z軸で手動ですばやくピントを合わせ直します。
    8. 解放されたセルの画像を希望の時間記録します(図4B)。PDMSメンブレンは柔軟性があるため、サンプルは時間とともに簡単に焦点がぼけます。したがって、画像取得全体でフォーカスを手動で調整します。
      注:リリース後のイメージング中に焦点を合わせ直すには、画像を十分な頻度で視覚化する必要があります。3秒ごとに3〜5分のビデオイメージングが妥当です。PDMS基板は顕微鏡のパーフェクトフォーカスシステムと互換性がないため、通常、迅速な取得のためにユーザーによる手動調整が必要です。ソフトウェアのフォーカシングは解決するかもしれませんが、エラーの可能性や大きなステージの動きに注意して、ストレッチポストパーツを打つことで対物レンズを損傷する可能性があります。ユーザーは、実験に応じてサンプルの複数のストレッチを実行することを決定できます。
  4. 後処理:フィジーを使用して画像を整列させます
    1. 安静時に画像を開き、緊張させます。
    2. Fiji プラグイン テンプレート マッチング を使用して、位置合わせするセルの領域を選択します (図 4C)。
      注:整列したひずみ画像の相対変位はフィジーによってレンダリングされ、画像はトリミングされて整列されます。このリンクからtemplate_matchingプラグインをダウンロードします:https://sites.google.com/site/qingzongtseng/template-matching-ij-plugin

8. 予め延ばした基質への細胞播種

  1. 接着タンパク質をコーティングしたストレッチリングをストレッチデバイスに取り付けます。
  2. PDMS基板を目的のひずみレベルまで引き伸ばします。
  3. セクション7のようにセルに種をまきます。
    注:この実験では、播種は無菌状態で行われていないため、プロトコルがすべての細胞タイプに適しているとは限りません。
  4. 細胞が接着した後、培地をCO2非依存培地に交換します。
    注:接着時間を最小限に抑えるために、高速接着細胞を選択してください。
  5. 所望のインキュベーション時間後、ストレッチをリリースし、目的の細胞をイメージングします。
    注:このステップアップでは、静止している細胞の位置が不明であり、PDMS基質の動きが容易に予測できないため、伸張放出後に同じ細胞を見つけることは困難です。

9.伸ばした細胞または弛緩した細胞を固定する

  1. 細胞を伸張状態に固定する(ケミカルフードの下で作業する)
    注:パラホルムアルデヒド(PFA)は標準的な固定剤です。37°Cで温めて使用することで、素早く固定することができます。あるいは、グリオキサール溶液22 は、良好なサンプル保存を伴う迅速なサンプル固定を可能にする。
    1. 固定剤を調製します。
    2. ステップ7.2に続くリング上の細胞を播種します。
    3. ストレッチポストとコントローラーをケミカルフードの内側に取り付け、真空供給に接続します。
    4. 播種された細胞のリングをストレッチポストに置きます。
    5. ストレッチ状態を固定するには、目的のひずみまでストレッチします。細胞培養培地を取り出し、4% PFA溶液を細胞に添加して37°Cで10分間固定します。 次に、PBSで洗い、常にストレッチを保持します。ゆっくりと真空を解除し、より多くのPBSで洗います。
      注:非伸縮性制御状態を準備することを忘れないでください(このために、小さなPDMSピースをカットして、ガラスカバースリップの上に少量の96%エタノール溶液で乾燥させることができます)。固定サンプルをイメージングするには、サンプルを同じ大きさに戻すことをお勧めします。PFAは毒性があるため、このステップでは適切な予防措置を講じる必要があります。ボンネットの下に保管できる小さなオーブンを使用すると便利です( 材料の表を参照)。
    6. サンプルを画像化し、できれば真空を再び適用して、固定時と同じレベルまですることで、サンプルの「再フラット化」を確実にします(図4D)。
  2. ストレッチリリース後に細胞を固定します(ケミカルフードの下で作業します)。
    1. 細胞を希望のひずみと時間まで引き伸ばします。ストレッチリリースの直前に、サンプルを完全に乾燥させずにほとんどの培地を取り除き、ひずみを解放します。または、特定の期間の周期的なストレッチを適用します。
    2. メディアをすばやく取り除き、すぐに固定液で10分間固定します。PBSと画像で洗ってください。
      注:サンプルは、事前に引き伸ばされた基板上に播種し、ユーザー定義の播種時間後に、ステップ9.2.2のように伸張後のリリースを固定することもできます。
  3. 固定サンプルの免疫蛍光染色:伸ばした状態または放出した状態での免疫蛍光の標準プロトコルに従ってください。魚ゼラチンによるブロッキングは、BSA17よりも好ましいです。
  4. サンプルを画像化します(図4E)。
  5. サンプル保存
    1. サンプル保存用の封入剤(MowiolまたはProlong)を調製します。
    2. PBSを取り外し、封入剤を一滴(約75μL)追加します。
    3. ピンセットでカバースリップをつかみ、その上に繊細に置きます(視覚化を妨げる泡を避けてください)。
    4. 室温(RT)で少なくとも48時間乾燥させます。
    5. PDMS固定サンプルの周囲をカットし、後でイメージングするために別のガラスカバースリップにマウントします。
      注:PDMSメンブレンを保存媒体と一緒にカバースリップに取り付けると、メンブレンがリラックスした状態でのみ保存されるため、このステップはストレッチメンブレン上のサンプルのポストイメージングとは互換性がありません。

10. 同じサンプル領域を異なるモードでイメージングするためのグリッドによる固定 - SEMイメージングの一例

注:このプロトコルは、ここに示されているように、蛍光顕微鏡と走査型電子顕微鏡の2つの異なる顕微鏡で同じ単一細胞をイメージングするために使用できます。相関イメージングには、このプロトコルの範囲にない高度な画像処理が必要です。その他の有用なアプリケーションとしては、例えば、ライブモードでのサンプルの可視化、ボンネット内でのさらなる固定、免疫染色後の同じ細胞の可視化( 補足図5で使用したプロトコル)などがあります。

  1. セクション4のパターン化されたPMMAプレートを使用してストレッチリングを準備します。
  2. 手順7.2のようにセルをシードします。
    注:コーティング溶液は、小さなグリッド穴でもPDMSを完全にカバーするために慎重に塗布する必要があることに注意してください。
  3. セクション8に記載されているように固定しますが、サンプルおよび電子顕微鏡イメージングに適合する適切な固定剤およびプロトコルを使用します。
    注:PFA+グルタルアルデヒドの混合物(例えば、2%〜2.5%)を使用する場合は、グルタルアルデヒド試薬の存在下からの自家蛍光に注意し、最終的にはクエンチングステップ23を実行する。
  4. 蛍光モードでサンプルをイメージングし、細胞の位置を記録します(たとえば、グリッドを印刷し、十字で位置をメモします)。
  5. すべての画像が撮影されたら、まずサンプルの周りのPDMSを切断して(潤滑剤を取り外して)、EM用のサンプルを準備します。
  6. 走査型電子顕微鏡用のPDMSメンブレン+サンプルを処理します(サンプルの脱水と金属スパッタリングの標準プロトコルを含む)12。
  7. SEM顕微鏡でイメージングする場合は、グリッド位置を見つけ、以前に蛍光モードでイメージングした細胞を探します(図4F、G)。

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結果

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キャリブレーションと放射状
得られた菌株の適切な特性評価は、実験の再現性と制御を保証するものです。蛍光ビーズを各サンプルに追加してひずみを正確に記録することもできますが、前のキャリブレーションステップにより、実験者がサンプルに適用したいひずみの大きさを実際の伸張前に知って、実験の適切な計画が保証されます。ひずみは、適用される真空度だけでなく、ストレッチリングの寸法、PDMS組成(1:10とは異なる混合物)、膜の厚さ、およびリングをクランプする前のPDMS膜のプレストレッチによって異なります。したがって、各実験セットアップは個別にキャリブレーションする必要があります。蛍光ビーズの均質な画像を使用し、適用されたさまざまなレベルの真空に対するそれらの信号を記録すると(補足図3Aを参照)、ひずみと適用された真空の検量線を作成できるだけでなく、ひずみの等方性と基板上のその均一性も検証できます。プロトコルのセクション6で説明されているように、これらの画像を記録し、Matlabコードを使用してひずみ計算のために画像を処理することにより、得られたひずみの品質とその再現性を評価でき...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多数の伸張装置が、生体内の生理学的条件を模倣して、生物学的試料に機械的伸張を適用するために使用されてきた24,25。文献には多数のセットアップが利用可能であり、サンプル応答の観察は通常、延伸装置を原子間力26または蛍光顕微鏡27,11に結合することによって行われる。

ここで紹介するストレッチングデバイスの設計と操作により、高倍率の蛍光イメージングを行い、任意の蛍光マーカーで標識した生細胞にそのような画像を記録することができます。デバイスのシンプルな設計により、アクセスしやすく使いやすく、空気圧ベースのシステムを使用することを選択することで、機械ベースのセットアップと比較してシンプルで手頃な価格になります。この研究で提示された構成では、等...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

当社は、利益相反を一切表明しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、「la Caixa」財団からの資金提供(X.T.、J.V.R.、P.R.-Cへの助成金406 LCF/PR/HR20/52400004、およびフェローシップLCF/BQ/DR19/11740009から407 I.G.-M.およびLCF/BQ/DR19/11740009からM.M.J.)、スペイン科学イノベーション省408(PID2022-142672NB-I00からP.R.-C.、 PID2021-128635NB-I00からX.T.、PID2022-141040NA-I00 409からI.A.)、カタルーニャ州政府(2021 SGR 01425からX.T.およびP.R.-C.)、研究優秀賞「ICREA 410 Academia」からP.R.-C.、Fundació la Marató de TV3(201936-30-31から411 P.R.-C.)、欧州連合(ERC、MECHANOSYNTH、PRCおよびERCへの助成金101097753、 Adv-412 883739エピフォールドからX.T.まで)。ただし、表明された見解や意見は著者のものであり、必ずしも欧州連合または欧州研究会議事務局の見解や意見を反映するものではありません。欧州連合も付与機関も、それらに対して責任を負うことはできません。A.E.M.B.は、サー・ヘンリー・ウェルカム・フェローシップ(Sir Henry Wellcome Fellowship、210887/Z/18/Z)の支援を受けました。著者らは、MCIU/AEI/10.13039/501100011033およびEuropean Social Fund Plus(FSE+)(JDC2023-051559-IからV.V.)が支援するJuan de La Ciervaフェローシップからの資金提供を認めています。IBECは、MINCINからSevero 415 Ochoa Award of Excellenceを受賞しています。ストレッチシステムの支援を提供してくださったV González-Tarragó氏と、技術サポートを提供してくださったEvelyn Coderch氏に感謝します。また、UNIAT de Criomicroscòpia Electrònica TEM/SEM (Centres Científics i Tecnològics de la Universitat de Universitat de Barcelona, CCiTUB) と、IBEC の CIBER-BBN の ICTS 'NANBIOSIS' Unit 7, MicroFabSpace and Microscopy Characterization Facility の支援にも感謝いたします。また、ICFOの機械工房とのコミュニケーションを促進してくれたMaria Garcia Parajo氏と、部品エンジニアリングのスムーズな支援を提供してくれたTecnifill氏にも感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アセテートマスクJDフォトデータ
アクリルアミドバイオラッド161-014040%アクリルアミド溶液
APSのシグマ・アルドリッチA3678電気泳動用過硫酸アンモニウム、≥98%
アプテスシグマ・アルドリッチ281778(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン
自律型マイクロ流体ポンプエルヴェフローコバルトコバルトデュアルコバルトデュアル
ビサクリルアミドバイオラッド161-01422%ビス溶液
刃フィッシャーサイエンティフィック11733919教訓的なグループ Hoja は aacute;ctica X100 ラメビストーリ滅菌N&°;23 ラムド23 
クリップスプリントAKXX000001ブルドッグクリップ、32mm、金属製、容量10mm、ニッケルメッキ
コロナ処理機電気技術製品BD-20AC、SKU:12051ABD-20AC実験室用コロナ処理機
カップVWRの611-1368VWR, ビーカーカップ、使い捨て、250 mL
DAPIのロシュ10236276001DAPI染色
エタノール 96%パンリーク・クイアキュート;マイカ、SLU131085-1212エタノール 96% v/v para anáリシス、ACS- 2,5 L
フィブロネクチンシグマF0895フィブロネクチン、ヒト血漿由来、液体 0.1%
FluoSpheres カルボン酸修飾マイクロスフェア、0.1 &mライフテクノロジーF8801、F8803解像度評価用の黄緑色および赤色蛍光ビーズ
FluoSpheres カルボン酸修飾マイクロスフェア、0.2 &mフィッシャーサイエンティフィックF8809、F8810ひずみ校正用の黄緑色および赤色蛍光ビーズ
グルタルアルデヒドシグマ・アルドリッチG6403H2O
干渉計ヴィーコ ワイコNT1100PDMS膜の厚さを測定する干渉計
イソプロパノールパンリーク・クイアキュート;マイカ、SLU131090-1212 2-プロパノール (Reag. Ph. Eur.) para anáリシス、ACS、ISO
Laitonの体重カスタムメイド
糸くずのないティッシュバークシャーDURX670、DR670090920不織布ワイプ
潤滑剤(ワセリン)シグマ16415ワセリン
マスクアライナーSüss マイクロテック MJB4 PMMAプレート上のフォトリソグラフィー用マスクアライナー
モウィオールカルビオケム - メルク475904MOWIOL 4-88試薬
ニコン顕微鏡スピニングディスク共焦点ニコンエクリプスTi-E/BニコンTi-S-ER を搭載。舞台
ニコンマイクロスコープアップライトニコンエクリプスNi-EニコンNI-SH-Eステージ搭載
目標 60倍ニコンCFI アポ近赤外 60X WNIR Apo 60X/1.0w DIC N2 WD 2.8
PBSソリューションギブコ14200067DPBS、10倍
PDMSのダウコーニング2401673921シルガード - 184 シリコーン エラストマー KIT DN 109
ペトリ皿リングカバー(大)プロキノルテ93060Plato de cultivo celular TPP SKU: 07177925直径 100
ペトリ皿リングカバー(小)プロキノルテ93060Plato de cultivo celular TPP SKU: 07177924
プラズマクリーナーハリック PDC-002酸素プラズマ発生器
PMMAプレートとリング補足資料のExcel仕様表を参照してください
引き摺るインビトロゲンP36930 / P36934ProLong Gold 退色防止試薬
リペルシランGEヘルスケア17-1332-01PlusOne リペル シラン ES
リング/ラバーリングテクニフィルカスタムメイド
スピンコーター月桂樹WS-650Szスピンコーター
SPY650-DNAスピロクロムサウスカロライナ州501SPY650-DNA
ステアリングスプーンVWRの231-0416エコショート使い捨てスパチュラ、両頭スプーンとスクープ、PP、エコピュア添加剤
SU8樹脂2100マイクロケムY111075SU8-2100
SU8-開発者シグマ・アルドリッチ484431プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート
テメドシグマ・アルドリッチT9281-50MLのN,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン、バイオ試薬 suitab。電気泳動試薬
トリクロロ(1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクチル)シラン シグマ・アルドリッチ448931 トリクロロ(1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクチル)シラン
ピンセットIESMAT(アイスマット)T5039 Dumont HP ピンセット 7 ステンレス鋼。0.17 x 0.10mmの先端。(寒天科学株式会社)
真空コントローラーGARCAP/パーカー 990-005203-005 Controlador de vacio 
真空コントローラー fluigent流暢LU-FEZ-N800ラインアップ フロー EZ (n800mbar)
白いベンチペーパーライマ931.1001 ペーパーライマ 42 x 52

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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