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方法論記事

ブリルアン分光法を用いた球体の機械的マッピング

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DOI：

10.3791/67538

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2025年12月12日

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1Centre for the Cellular Microenvironment, Advanced Research Centre, 11 Chapel Lane, University of Glasgow, 2LightMachinery Inc.

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本記事では、ブリルアン顕微分光法を用いた3次元マトリックス内の生体球体の機械的特性評価プロトコルについて説明します。この全光学方式により、ミクロスケールの分解能と定量的な力学的特性を持つ球状体の可視化が可能となります。このアプローチは機械的な表現型付けにも影響を与えます。例えば、3次元微小環境内の腫瘍球体の病理状態の決定などです。

要約

ブリルアン分光法は、生物医学で大きな関心を集めている新興技術であり、研究者が非破壊的かつ接触のない方法で試料の粘弾性および構造的特性を調査することで、力学や構造に関する情報を収集することを可能にします。このアプローチは、可視光と熱誘起された音響波/フォノンの相互作用を測定することで、3次元試料の機械的特性を評価します。ブリルアン分光法が提供する情報は、生 体内 での生物物理学評価や疾患病理の診断の可能性を秘めています。ブリルアン分光法の大きな利点は、生物学的サンプル内の微小スケール力学を評価できることです。原子間力顕微鏡のような従来の技術は、直接接触が必要なため2次元でしかサンプルを探査できません。本研究は、ブリルアン微小分光法を応用し、3次元ハイドロゲルマトリックス内に埋め込まれた生体球体の生体力学を調査する方法を説明しています。細胞球体を3次元微小環境にカプセル化することで、細胞と細胞外マトリックスの界面を生 体内で密接に再現する球状系が確立されます。当プロトコルでは、球状サンプルの準備および連続蛍光イメージングによるブリルアンスペクトルの測定を記述しています。さらに、スペクトルデータ解析の手順や光学システムの技術的詳細についても議論します。

概要

3Dモデルで細胞を培養することは、典型的な2D細胞培養法に比べて有利であり、生体内で見られる組織構造や細胞間相互作用をよりよく再現できます。球体は複雑な細胞間相互作用を促進する3次元細胞集合体であり、これらの相互作用は、組織培養プラスチック上の単分子層として培養された細胞では損なわれます。球体は、細胞が起源した微小環境を模倣した足場内で培養することができます。例えば、ハイドロゲルは剛性、分解性、孔径、成長因子1の取り込みなどのパラメータを精密に制御できるため、細胞や球体の培養に使われる人気のある生体材料です(図1A)。機械的な手がかりは、がんや線維症などの疾患病理における生化学的変化に先行することが多いため、臨床的に関連性の高い3Dモデルにおける生体力学的特徴を獲得することは、治療実践を助け、基礎となる病態生理を理解するための診断介入の開発に不可欠です。

ブリルアン顕微鏡(BM)は、生体材料の機械的特性を2次元平面5,6,7で測定できるイメージング技術です。BMは、原子間力顕微鏡(AFM)や弾片造影法など、他のより一般的に使われる手法に比べていくつかの重要な利点があります。AFMが高時空間的機械的分解能を達成できること、そしてエラストグラフィーがサンプル内の力学を探査できることはよく知られています。BMは調査対象の材料と直接接触する必要がなく、ハイドロゲル内の球状体などアクセスが難しいサンプルや細胞に対してAFMよりも理想的な技術となります。BMのもう一つの大きな利点は、サンプルの標識が不要であり、生物サンプル内でミクロスケールの解像度を提供できることです。これは一般的に使われるエラストグラフィー法では達成できない7;より高度な光学エラストグラフィー技術は、マイクロスケール解像度10で動作可能です。異種の生物学的サンプルのブリルアンイメージングにおける正確な有効分解能は定義が容易ではないことに注意が必要です。まず、特定の照明波長に対して、焦点スポットサイズ(対物レンズの数値絞りNA、サンプルの不透明度)を記述する光学特性に依存します。さらに、試料の機械的特性の精度やブリルアンスペクトルの形状は、材料の音響特性(フォノン波長および伝播距離)によっても影響されます11,12。ブリルアン分光法の根底にある現象はブリルアン散乱であり、入射する単色レーザー光が生体媒体内で自発的に熱的に誘起される音響フォノンと相互作用します。これにより光の非弾性散乱が生じ、(図1Bのブリルアン周波数シフト、BFS) および 通常数GHzの範囲で光子がエネルギーを失うか増えるかによって、散乱光のスペクトル上でそれぞれブリルアン・ストークスピークと反ストークスピークが検出されます。BFSは媒質中の局所的な音速に依存することで、弾性縦度率と関連し、さらにヤング率7,13と経験的に相関しています。しかし、これらのモジュラスの比較には注意が必要です。なぜなら、(i) 直接的な関連性がないこと、(ii) ヤング率は通常、生物学的サンプルや軟質物質でPa-kPa範囲であるのに対し、ブリルアンで得られる縦度モジュラスはGPa範囲、(iii) 屈折率の変化や材料密度などのパラメータを考慮する必要があること、7。ブリルアン線幅(図1B)はBMから得られる別の指標です。これは縦方向損失率に関連しており、試料の粘度に関する洞察を与えます。これらの性質は粘弾性14と相関できます。したがって、BMは粘弾性特性の評価を可能にし、BFSが大きいほど材料が剛性が高く、線幅が大きいほど粘性が高い材料を示します(図1B)。光子が周波数シフトを経験しない弾性(レイリー)散乱は、ブリルアン散乱に比べて発生確率が著しく高いことに注意すべきです。したがって、ブリルアン分光器はレイリー信号を抑制するために装備されなければなりません。

BMは、さまざまな組織、バイオマテリアル、3D細胞培養モデルの機械的特性を特徴付けるために用いられてきました。例えば、BMはメラノーマと周囲の健康組織を区別するために用いられ、非がん組織がメラノーマよりも有意に柔らかいことが示されました。Radらは、ハイドロゲルのポリマー濃度を上げるとBFSと線幅が増加することを示しました。最も低いポリマー濃度では、細胞を含むハイドロゲルは空のハイドロゲルに比べて7日間でブリルアン周波数シフトの減少が大きく見られ、これはハイドロゲルの細胞再形成によるものと考えられています。これは10%のポリマー濃度では観察されず、これらのハイドロゲルに見られる細胞生存能力の欠如を浮き彫りにしました16。

本研究に最も関連性の高いのは、BMが球体17,18,19,20の力学的性質を調査するために用いられていることです。特に、局所的な微小環境が球状体力学に与える影響はBM20を用いて検出できます。コンプライアンスハイドロゲルで培養した腫瘍球体と比較して、硬いハイドロゲルで培養された球体はより高いBFSを示し、弾性率20の増加を示しています。球体内の力学的性質の空間的変動もBMで特徴付けることができます。例えば、腫瘍球体のBFSは球状体核に向かって増加することがわかっています20,21。さらに、BFSの減少は腫瘍球体の侵襲性の増加と相関しています20。BMは浸透圧ショックに反応する腫瘍球体の機械的変化を調査するために用いられてきました。研究では、球状体成長を5日間にわたりモニタリングし、BMで観察されたがんと健康な球体の初期の機械的差異は時間とともに失われていることがわかりました。別の研究では、7日後に球体のBFSが増加し、球状体のサイズと細胞数の増加に起因するとされました。細胞数は16です。

さらに、ブリルアン顕微鏡とAFMおよびレオロジーを組み合わせたマルチモーダル研究が行われ、細胞およびハイドロゲル16,23,24の機械的特性を調査しています。Radらは、BMで測定された傾向をレオロジーを用いて文脈化し、ハイドロゲルのポリマー濃度に対する縦度弾性率と貯蔵せん断弾性率との間に強い正の相関を確立しました16。ブリルアン顕微鏡と光学ピンセットマイクロレオロジーを用いて、3次元ハイドロゲルで培養されたがん細胞の力学を測定しました23。本研究では、ハイドロゲルで懸浮培養した単一細胞と比較して、球状体細胞の機械的異質性が減少していることが確認されました。

本研究では、商業用ブリルアン顕微鏡を用いてハイドロゲルに埋め込まれた生球体の機械的特性を調査するプロトコルが詳細に示されています(図1)。Berghausらは、高分解能ブリルアン分光器の構築手順と、参照材料を用いた校正方法を詳細に記したプロトコルを記述しました。さらに、Shiらによるプロトコルでは、胚組織の機械的性質の変化を監視するためにブリルアン顕微鏡を用いる方法が説明されています。私たちは、ポリ(エチレン)グリコール(PEG)-マレイイミド水素ゲル中の間葉系幹細胞(MSC)球体を用いて骨髄ニッチを模倣し、この環境の機械的特性を調査しています。この3Dモデルは、白血病、多発性骨髄腫、二次性骨がんなどの骨髄疾患の機械的特徴を明らかにする可能性を秘めています。したがって、このプロトコルは、障害された機械生物学が病理に重要な役割を果たす可能性のある他の疾患の3Dモデルに直接応用可能です。球状体およびハイドロゲルの調製、蛍光イメージング、ブリルアン顕微鏡技術が詳細に説明されています。推奨される手順、可能な欠点、そして技術の潜在的な改善点について議論します。詳細な実験装置の説明は 図S1 および実験装置に関連する 補助材料 および方法のセクションに示されています。

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プロトコル

1. 2次元細胞培養

注意:可能な限り、すべての細胞培養作業は組織培養の標準的な層流フードを用いた無菌環境で行われ、汚染を避けるようにしてください。本プロトコルではMSCが使用されましたが、研究の目的に応じて他の細胞型も球状体を作るために利用可能です。

  1. 細胞を覆うのに十分な容量を持つDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)細胞培養培地でMSCを培養し、4.5 g/L D-グルコース+L-グルタミンに10%胎児用牛血清(FBS)、100μMのピルビン酸ナトリウム、1%非必須アミノ酸(NEAA)、1%ペニシリン、ストレプトマイシンを添加します。細胞を37°C、CO25%で培養します。
  2. 70〜80%の合流率で、0.05%のトリプシンエチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA)(トリプシンの添加量はDMEM体積の1/3)を37°C、5%CO2 で3分間インキュベートして細胞をプレートから剥離させることで通過細胞を分離します。反応を止めるには、FBSを含む培養培地(少なくとも追加されたトリプシンの量と同等)を加えます。ヘモサイトメーターを使って細胞数を数えます。

2. 球状体の調製

注意:可能な限り、すべての細胞培養作業は組織培養の標準的な層流フードを用いた無菌環境で行われ、汚染を避けるようにしてください。本研究では、マイクロウェルプレートを用いてMSC球状体を作成しました。これらのプレートは24の井戸で構成されており、各井戸には直径400μmの1200個のマイクロウェルが含まれています。これにより大量の球体を調製することが可能になります(図2)。

  1. マイクロウェルプレートの準備には、各ウェルに500μLの接着防止洗浄液を加えて前処理します。遠心分離機のプレートを1,300gで室温で5分間浸します。20倍の顕微鏡で気泡がないか確認してください。もしあれば、遠心分離の手順を繰り返します。粘着防止洗浄液を取り除きます。
  2. プレートを洗浄するには、リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)1mLを加えて吸引します。洗浄液が完全に取り除かれていることを確認するために、これを2回繰り返します。
  3. 球状体あたりの細胞数とゲルあたりの球体数を決定します。これは個々の研究課題によって異なります。例えば、球状体1つにつき100個、ゲルあたり100個の球体を使いました。したがって、このプロトコルではマイクロウェルプレートのウェル1本だけで十分で、合計で1200個の球体が生成されます。1本の井戸に必要なセル数を計算するために、次の計算を行いました:1200 x 100 = 1.2 × 105。1.2×10個の5セルを含むセルの懸浮体積を計算します。細胞懸濁液を300gで室温で5分間遠心分離し、上清液を除去します。
  4. 細胞を1 mLのDMEM(+4.5 g/L D-グルコース、+L-グルタミン)に再懸浮させ、100 μMのピルビン酸ナトリウム、1% NEAA、1%ペニシリン、ストレプトマイシンを補足します。マイクロウェルプレートの1つのウェルに1mLの細胞懸濁液を加え、ピペットを上下に優しく動かして細胞をウェル全体に均等に分散させます。気泡を作らないように注意してください。100gの皿を室温で3分間遠心分離します。
    注:現時点では、FBSをメディアに加えることはありません。これは細胞が組織培養プラスチックに付着するのを防ぐためです。
  5. 顕微鏡でプレートを観察し、細胞が均等に分布し、マイクロウェルの底に沈んでいるか確認してください。細胞を37°C、CO25%で培養します。24時間後に球状体の形成を観察。
    注:球体は細胞の種類や球体のコンパクトさに応じて最大48時間放置可能です。
  6. 球体をプレートから採取するには、まず培養媒体をゆっくりと優しく取り除き、球体を乱さないように注意します。球状体がプラスチック製品にくっつくのを防ぐために、ピペットの先端やチューブには1%FBSを含むPBSを塗ってください。球体がピペットの先端に挟まらないように、先端を切って開口部を広げてください。これらのステップでは、球状体の損失を防ぐための追加措置として最大回収チップを使用できます。マイクロウェルプレートの各ウェルに500μLのPBSを加え、ピペットを上下に動かして球状体を外します。PBSをチューブ内に浮遊球体で採取します(図2)。
  7. 顕微鏡で20倍の倍率でプレートを観察し、この工程を繰り返してほとんどの球状体が正常に除去されるまで繰り返します。
  8. サスペンション内の球体数を数えるために、サスペンションから96ウェル板のウェルに50μLを移します。50μLの球体数を数えます。数えるのを助けるために、油性マーカーを使って井戸の底に十字を描くことができます。球体の数は式(1)で計算します:
    figure-protocol-1

3. PEGハイドロゲルの調製

注意:可能な限り、すべての細胞培養作業は組織培養の標準的な層流フードを用いた無菌環境で行われ、汚染を避けるようにしてください。本研究ではPEG-マレイイミド水素ゲルが使用されましたが、他のタイプも利用可能です。PEG-マレイイミド水素ゲルはチオール-マイケル付加反応を用いて形成されました。使用された架橋剤はPEG-ジチオールとプロテアーゼ分解性ペプチドの混合物で、2つのシステイン残基(VPMペプチド、GCRDVPMSMRGGDRCG)が両側に加わりました。本研究のゲルは70%のPEG-ジチオールと30%の分解性VPMペプチドを使用していました。

  1. VPMペプチドを200 mg/mLのストック溶液に作り、1ゲルあたり2.4 μLのペプチドを加えます。PEG-ジチオールを200 mg/mLのストック溶液にし、1ゲルあたり5.6 μLを加えます。
  2. 球体をPBSで再懸浮させてから架橋剤と混合します(図2)。球状懸液をPEG-ジチオール(1ゲルあたり5.6 μL)およびVPM(1ゲルあたり2.4 μL)と混合します。この解は解Bと呼ばれます。
    注:このプロトコルでは、ゲルあたり100個の球体が追加されました。
  3. 250 mg/mLのPEG-マレイミドストック溶液を作ります。1ゲルあたり50μgのフィブロネクチンを加えます。PEG-マレイミド溶液とフィブロネクチン溶液を混ぜます。これを「溶液A」と呼びます。ピペット溶液A(100μLゲル用40.3μL)を12ウェルの組織培養プレートの底部に塗布します。溶液B(100μLゲル用59.7μL)をモル比1:1のマレイミド:チオールで加え、完全な架橋を確実にします。ゲル化が瞬時に起こるようにしましょう。最終的なハイドロゲルの体積は100μLです。
  4. ゲルを37°C、5%CO2 で30分間培養し、ゲル化を促します。ウェルに完全培養培地(DMEMに10%FBS、100μMピルビン酸ナトリウム、1%NEAA、1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを補足)を加え、ゲルを完全に浸かせます(図2)。ゲルは37°C、CO25 %で培養し、ブリルアン顕微鏡下での測定準備が整うまで行います。
    注:ブリルアン測定前のハイドロゲル内での球状培養の期間は、細胞タイプおよび研究課題によって異なります。例えば、本研究では球体は通常、ハイドロゲル内で最大7日間培養され、その間にブリルアン顕微鏡で球体を監視します。球状体カプセル化の有無にかかわらず、ハイドロゲルの粘弾性特性が特徴づけられ、球体がゲル力学に有意な影響を与えないことが示されました(図S2)。

4. ハイドロゲル中の球体の蛍光染色およびイメージング

注:本研究では、細胞核および細胞骨格を構成するアクチンフィラメントを蛍光染色し、ブリルアン測定前に画像化しました。

  1. アクチン染色には、画像撮影の3時間前に1/500希釈で生アクチン染色を培養培地に加えます。サンプルを光の当たらない場所にホイルで包んでください。ゲルは37°C、CO25%で培養します。
  2. 核を染色するには、画像撮影の40分前にゲル周囲の培地に生核染色剤2滴/mLを加えます。サンプルをインキュベーターに戻してください。
  3. 染色培養期間終了後、できるだけ早く蛍光画像を取得してください。適切な光経路(顕微鏡カメラを露光させる場合)と正しいフィルターホイール位置が選択されているか確認してください。部屋の照明を落とし、背景を捉えましょう。発光ダイオード(LED)光源をオンにし、染色プロトコルに応じて波長を選択します(ここでは原子核に385 nm、アクチンイメージングに621 nmが使用されました)。推奨ソフトウェアで20倍倍率の蛍光画像を取得します。終わったらLED電源を消してください。

5. 球体のブリルアン顕微鏡法

  1. 装置の起動とレーザー発光
    1. デバイスの電源を入れるには、コンピューター、分光計、顕微鏡カメラ、顕微鏡、レーザー冷却ファン、レーザー発光装置をコントローラーのキーをオンにします。レーザーが熱化されていることを確認するために、分光器の最適化15分前に必ず実施してください。出力計(実験では100 mW)で、放出されるレーザー出力が期待通りかどうかを確認しましょう。
  2. 温度制御アプリケーション( 材料表参照)をオンにし、エタロンの温度が最適化されているか、エタロンの後にビーム出力を測定して確認します。光学密度(OD)フィルターを考慮した後で予想より著しく低い場合は、目標温度を1°C変化させ、時間とともにパワーが上昇するかどうかを観察します。減少があれば、変化の方向を逆にします。パワーが期待値に近づいたら、0.1°Cまで少しずつ調整し、最大値に達するまで調整します。
  3. 対物レンズの焦点スポットをアクリルキューブ内に配置する
    注:「ポンプキラー」から分光計への弾性散乱や結合の抑制は、各実験前に硬く均質な基準物質のサンプルを用いて最適化されています。この研究ではアクリルキューブが使用されます。
  4. SpectraLokのソフトウェアを開き、すべてのデバイスが検出されるまで待ちます。メインウィンドウの左側(図3)で分光器カメラを選択します。
    1. アクリルキューブを顕微鏡サンプルホルダーに取り付け、透明面が対物レンズの方を向くようにします。対物レンズをできるだけ下げて、キューブをその下に置きましょう。顕微鏡の光学経路が分光器カメラを露出するように選ぶこと(回転ポートセレクターを Lに設定)してください。
      注:私たちのセットアップでは、 L ポートは共焦点循環器に接続され、 R は顕微鏡カメラポートに接続されています。
    2. SpectraLok Camera のウィンドウで 、センサー露出時間を 500ms、ソフトウェアゲインを100msに設定します。ソフトウェアの ゲイン 設定は、視覚化のためにコントラストを強調するだけです。
  5. レーザーシャッターのブロックを外せ。
    注意:レーザー発光がオンになっている間、頭部や目をレーザービームの経路に入れないように注意してください。
    1. キャプチャボタンを押し、対物レンズを上に動かします。信号強度が大幅に増加し、飽和パターン(図4A)が現れます。これは空気とアクリルキューブの界面でレーザー光が強く反射することによって引き起こされます。レンズをさらに上に動かすと信号強度が低下し、ブリルアンピークが明らかになります。ブリルアンピークの強度が一定になるまで対物レンズの位置を調整し続けます(図4B)。これはアクリルキューブの内部に焦点が完全に位置していることに対応しています。
  6. 残留弾性散乱光を最小限に抑えるためにエタロン圧力を最適化すること
    注:以下の手順の目的は、弾性散乱されたレイリー信号を抑制し、周波数シフトしたブリルアン光だけが分光器カメラに届くようにすることです。
  7. SpectraLokソフトウェアで、 ポンプキラー(PK)制御 ウィンドウを開きます(図5)。
  8. 最も明るいブリルアン命令の一つにズームインし、圧力アクチュエータの位置を100μm単位で調整することで、レイリーピーク強度を最小化します。レイリー信号が強まっている場合は、逆 方向をクリックして方向を変えます。その後、エタロン圧力を10μm単位で微調整します。
    注:アクリルキューブではレイリー光を完全に抑制できます。しかし、異質な生物学的サンプルでは必ずしもそうとは限りません。
  9. ストライプオーバーレイの最適化によるスペクトルデータの「アンラップ」
    注意:以下の手順により、カメラセンサーの(x, y)ピクセル座標がルックアップテーブルLUT を適用して 適切に波長にマッピングされます。
  10. カメラのウィンドウで、ブリルアンの命令の一つをズームインしてください。
  11. Sを押すと、LUTがカメラ画像に適用されるストライプを視覚化できます(図6A)。 設定 ウィンドウを開き、 クイックキャリブレート を押してストライプの最適な水平オフセットを再計算します。センサーが飽和している場合は、このステップの前に露出時間を短縮してください。
    1. カメラウィンドウで、紫色の縞模様がブリルアン峰の中央部とよく重なっているか確認してください(図6B)。
  12. PK分光計結合の最適化
  13. コリメーターレンズ軸の調整により、PKから分光計への光の結合効率を最大化できます。
  14. スペクトルウィンドウを開き、「 アンラップ 」をクリックするとスペクトルが表示されます(図7)。
  15. PKコントロールウィンドウを開けてください。0.0005°の刻みで、ブリルアン信号を最大化するためにコリメータ軸1と2を繰り返し調整します。必要に応じて、エタロンの圧力制御をさらに最適化することも可能です。均質なアクリルキューブでは、レイリー信号を完全に抑制することができます(図7A)。残留レイリー信号を含む正確なブリルアン測定は可能です(図7B)が、抑制が不十分な場合(図7C)、弾性散乱光がブリルアン信号を遮断します。
  16. 達成されたブリルアン信号が基準振幅と同等であることを確認しましょう。例えば、我々のシステムでは、露光500ms、OD 0.3の場合、ブリルアンピーク強度振幅は約3000カウントです。PKパラメータの変更を設定ファイルに保存するには、PKウィンドウで「すべて更新」をクリックして「すべて保存」をクリックします。さらに、メインウィンドウの「ファイルI/O」セクションで「保存」を押してください。
  17. スキャンソフトウェアに切り替え、パラメータがまだ最適化されているか確認する
  18. SpectraLokを閉じてスキャンソフトを開きます。現在のプロトコルではLabVIEWベースのソフトウェアが使用されており、 図S3に詳細に説明されています。スキャンジオメトリの設定には、この独自のユーザーインターフェース(UI)がPrior XY-Zの変換段階を制御するために使われます。しかし、他の方法も用いられます。
    1. アクリルキューブの代わりに、ヒドロゲル球体サンプルと一緒にガラス底のペトリ皿を設置してください(図8)。ゲルの脱水を防ぐため、インキュベーターは37°C、相対湿度95%に設定されています。ペトリ皿の蓋を外し、ゲルを浸すための培地を加えます。ジェルの動きを防ぐために、ジェルの上部にカバースリップを付けます。
    2. 球体の位置を特定せよ。レーザービームが遮られたら、顕微鏡の光学経路を接眼レンズに切り替えます。ホワイトライト照明をつけてください。ジョイスティックを使ってサンプルステージを手動で操作し、球体を見つけてフォーカスします。
    3. 球体の明視野画像を取得してください。コントロールホイールを回転させて照明の明るさを調整してください。光学経路を Rに設定し、顕微鏡カメラを露光させます。露光時間は必要に応じて調整でき、高コントラストの画像(すなわち50ms)を得ることができます。
    4. 分光器とアンラップパラメータがまだ最適化されているか確認してください。顕微鏡ポートを L に設定し、レーザーを遮った状態で背景をキャプチャします。レーザーのブロックを解除するには、ホイールを回して 発射します。望ましい信号対雑音比に基づいて露光時間を選びます。これらの測定に典型的な露光時間は200〜500ミリ秒です。
    5. 初期校正から数時間経過している場合やシステムに機械的な乱れがある場合、エタロン圧力設定やPK分光器のカップリングが最適でなくなることがあります。必要に応じて、ステップ5.3〜5.5を繰り返して、前述の再最適化を行います。
    6. アンラップされたスペクトラムの中から、ブリルアンピークフィッティングレンジを選びましょう。 閾 値をブリルアン峰の強度の約半分に調整します。この閾値以下の振幅を持つブリルアン峰は無視してください。識別されたすべてのブリルアンピークペアに応じてレーザー波長を補正します。
  19. 多次元スキャンジオメトリの設定
  20. スキャン領域の幅とステップサイズを調整して、ラスタスキャンジオメトリを選択します。
    注:約70μmサイズの球体では、低解像度スキャンでは通常150μm×150μmの走査面積と10μmのステップサイズを使用します。これにより約3.4分で低解像度の2Dマップが得られます。
    1. スキャンを始めてください。
  21. ブリルアンシステムの停止
    1. ソフトウェアを閉じてパソコンの電源を切ってください。コントローラーのキーでレーザー発射をオフにしてください。シャッターホイールは ブロック された位置のままにしてください。レーザーファン冷却をオフにしてください。顕微鏡と分光器のカメラをオフにしてください。最後に顕微鏡をオフにします。

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結果

スキャン後に得られるファイルには、スペクトル、スキャンフィッティングパラメータ(.csv)、スキャンパラメータと解析、BFSおよび線幅マップ、注目領域を特定したブライトフィールド画像、UIウィンドウのスクリーンショットが含まれます。多次元ブリルアンスキャンの各点に対してBFS値が取得されます。 図9では、高解像度スキャンの例を明晰領域画像と並べて表示し、アクチンフィラメントや核を示す蛍光画像も示しています。我々のシステムでは、顕微鏡が共焦点イメージングモジュールではなくエピ蛍光装置を備えているため、ブリルアンマップのイメージングや解釈の誘導に蛍光が使われています。ここで、サンプルのピントが合わない蛍光が有効解像度に影響を与えます。 図9に示すように、2次元ブリルアン走査データと明界画像を用いて、球体を分割し、球体の平均BFSを得ることができます。これはゲルの平均BFSと比較してもよい。Fiji(ImageJ)28

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ディスカッション

私たちは、ヒドロゲル内に埋め込まれた球体を微小解像度で生体力学的にイメージングするためにブリルアン顕微鏡法を用いるプロトコルを確立しました。ハイドロゲルは、得られるBFS値の違いによってライブスフィロイドと区別できます。代表的な結果では、MSC球体とPEG-マレイイミド水素ゲルを用い、しかし、このプロトコルは他の細胞種(例:がん細胞株)にも広く適用可能です。本研究の細胞は、関連する3D微小環境内でライブで画像化されており、生物学的に関連性の高いモデルと組み合わせたこのプラットフォームの実現可能性を示しています。非ヒト種の脳、筋肉、皮膚、軟骨など様々な生外組織のブリルアンシフト値が測定されています。ブリルアン顕微鏡はこれまでに、人間のレンズや角膜31などの生体内組織力学の測定に効果的でした。このプロトコルで用いられる3Dマイクロ環境は、臨床応用向けの予測ツールの開発に寄与し、今後複雑で高価なin vivoモデルの開発の必要性...

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開示事項

著者らは、T. アレンとG. ワードルが本研究で使用されるブリルアン分光計を製造・販売するLightMachineryの従業員であることを指摘しています。同社はこの研究の出版から利益を得る可能性があります。他のすべての著者は競合する利害関係を一切表明していない。

謝辞

著者らは、この手法の開発を支援するためにMechanoMedsフェーズ2助成金(UKRI/EPSRC、助成番号EP/X033554/1)から得た資金を認めます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4アームPEG-マレイミド(20 kDa)クリエイティブPEGWorksPSB-455https://creativepegworks.com/product/4-arm-peg-mal-mw-20k
アグリウェル400プレートSTEMCELL テクノロジーズ34411http://stemcell.com/products/aggrewell400.html
空空間エタロンライトマシナリーHF-16074-660https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-spectroscopy-excitation-laser-optimization/
接着防止洗浄液STEMCELL テクノロジーズ7010https://www.stemcell.com/products/aggrewell-rinsing-solution.html
ボールドライントップステージインキュベーターオコラブH301-NIKON-NZ100/200/500-Nhttps://www.oko-lab.com/live-cell-imaging/stage-top-digital-gas/chamber/nikon/h301-nikon-nz100-200-500-n
コボルト・フラメンコ-100 660nmレーザーヒューブナー0660-05-01-0100-700https://hubner-photonics.com/products/lasers/single-frequency-lasers/05-01-series/
コンフォーカルサーキュレーターライトマシナリーHF-13311該当なし
D-LEDi蛍光照明システム ニコンMBF83000https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/light-sources/d-ledi
EPI-FLモジュールニコンTi2-LA-FL-3https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/intermediate-modules
フィブロネクチン(ヒト)YoProteins663https://www.yoproteins.com/fibronectin-human-5-mg-663.html
ギブコ・ダルベッコ改良型イーグル中型(DMEM)サーモフィッシャー11965092https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965092
ハイパーファイン・ブリルアン分光計ライトマシナリーHF-8999-PK-660https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-hyperfine-spectrometer/
LED-DA/FI/TR/Cy5-B クアドラプルバンドフィルターキューブニコンMXR00753https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/fluorescent-filter-cubes
間葉幹細胞(MSC)プロモセルC-12974https://promocell.com/us_en/human-mesenchymal-stem-cells-hmsc.html
モーター駆動翻訳段階 プライアー・サイエンティフィックH117E2NNhttps://www.prior.com/imaging-components/motorized-stages?filter=MicroscopeBrand-33
NucBlue™ライブReadyProbes™試薬(Hoechst 33342)サーモフィッシャーR37605https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605
目的、Sプラン フルオナ20X NA 0.45、空気ニコンMRH08230https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/selector/comparison/-1708
ORCA-Fusion CMOSカメラ浜松C14440-20UPhttps://www.hamamatsu.com/eu/en/product/cameras/cmos-cameras/C14440-20UP.html
PEG-ジチオール、2 kDaクリエイティブPEGWorksPLS-613https://creativepegworks.com/product/hs-peg-sh-mw-2k-10g
sCMOS カメラ テレダイン・ビジョン・ソリューションズ01-IRIS-15-USB-M-16-Chttps://www.teledynevisionsolutions.com/en-gb/products/iris/?model=01-IRIS-15-USB-M-16-C&vertical=tvs-photometrics&segment=tvs 
SPY555-アクチン スピロクロムCY-SC202https://spirochrome.com/product/spy555-actin/
TemperatureApp温度制御ソフトウェア
VPMペプチド、GCRDVPMSMRGGDRCGジェンスクリプト該当なし該当なし
エクリプス Ti-2A 顕微鏡ニコンエクリプス Ti-2Ahttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series 

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