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方法論記事

結核病因理解のための 結核菌 培養濾液の調製

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DOI:

10.3791/67540

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2025年3月28日

 , 
1CSIR-Centre for Cellular and Molecular Biology (CSIR-CCMB), 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), 3National Institute of Immunology

この記事について

サマリー

ここでは、細菌が分泌するタンパク質からなる細菌増殖培地である Mtb 培養濾液(CF)の調製を実演します。 Mtb は、病因に重要な宿主シグナル伝達と免疫応答を調節するタンパク質を分泌します。調製したCFは、質量分析法によって分析され、すべての分泌因子が特定されます。

要約

結核菌(Mtb) は、多くのタンパク質を宿主に分泌して、宿主シグナル伝達、免疫応答、アポトーシスなどのさまざまな細胞プロセスを調節して生存率を高めます。いくつかの分泌因子の機能は解明されていますが、多くはまだ特徴付けられていません。したがって、 Mtb 分泌タンパク質の研究は重要な研究分野です。 Mtb は、一般分泌系、ツインアルギニン分泌系、および特殊なVII型分泌系の3つの異なる分泌系の助けを借りて、タンパク質を細胞質外空間に分泌します。新規の分泌分子を同定し、既知の因子を機能的に特徴付けるためには、セクレトームを準備する必要があります。ここでは、セクレトームの調製方法と質量分析用のサンプル調製について概説します。セクレトームの調製には、細胞質タンパク質の汚染を避けるために細心の注意が必要であり、細胞質タンパク質は、十分に特性評価された膜タンパク質、分泌タンパク質、および細胞質タンパク質に対する抗体でプローブすることで監視できます。このようにして調製された培養濾液は、宿主の免疫調節特性の調査を含むさまざまな目的に使用できます。

概要

結核菌(Mtb)は、世界で最も致死率の高い病原体の1つであり、くしゃみや咳をしながら感染者から伝染するエアロゾルを通じて健康な人に感染します1。肺に入ると、肺胞マクロファージに飲み込まれ、宿主の免疫系を乗っ取って生き残ります。Mtbが生存のために持つさまざまな宿主調節メカニズムの中で、分泌性病原性因子はその1つです。桿菌が成長中に培地に分泌されるタンパク質は、培養濾液(CF)タンパク質2と呼ばれます。これらの培養濾液タンパク質は、細菌が宿主細胞内の過酷な条件で生き残るのを助けます。Mtbには、特殊なVII型分泌システム(T7SS)、一般的なSec分泌システム(Secシステム)、ツインアルギニン分泌システム(Tatシステム)の3種類の分泌システムが装備されています。T7SSは、グラム陰性菌3のI-VI型とは異なり、放線菌の中で最も排他的な分泌システムです。膜を越えたアンフォールドタンパク質の分泌は、主にSecシステムに関与しており、タンパク質はN末端シグナル配列4,5によって認識されます。折り畳まれたタンパク質または部分的に折りたたまれたタンパク質は、Tatシステムを介して輸送され、ツインアルギニンモチーフ6,7を持つN末端シグナル配列によって同定されます。SecおよびTatシステムがタンパク質分泌をどのように制御するかは、まだ決定されていません。

感染時の宿主の酸化的猛攻撃に耐え、生き残るのに役立つMtbの培養濾液タンパク質には、活性酸素種の分解に必要なKatGやSodA 8,9などの酵素があります。また、ヘテロ二量体タンパク質複合体であるCFP10-ESAT6は、サイトカイン応答、細菌の脱出、ROS産生などの制御に重要な役割を果たしています10。RD1遺伝子座は、CFP10-ESAT6の分泌を含むVII型分泌系の調節に関与しており、cpf10-ESAT6の遺伝的欠失は、ex vivoおよびin vivo感染モデルにおける細菌の生存を損ないます。マイコバクテリウム・ボビスBCGワクチン株は、病原性因子の分泌に関与するRD1遺伝子座を欠いており、したがって、弱毒生ワクチン11として使用することができます。さまざまな未踏の細胞プロセスが分泌プロセスを厳密に調節します。培養濾液タンパク質には、細菌が潜伏状態から再増殖するのを助ける蘇生促進因子(RpF)が含まれています。蘇生促進因子(Rpfs)は、休眠に関与することが知られているペプチドグリカン加水分解酵素です。Mtbは、細菌が単独で、または他のタンパク質と相互作用することによって休眠状態から再増殖するのを助ける5つのrpf様遺伝子(rpf A-E)をコードする12。Rpfsは細菌培養濾液中に見られ、Mtbの病原性および宿主免疫に関与することが知られている13,14。広く研究されているrpf遺伝子rpfEおよびrpfBは、in vitroで防御免疫を示し13、in vivoで免疫応答を強化します。したがって、rpfEおよびrpfBはMtbワクチン候補として使用できます。

可逆的リン酸化15は、様々な細胞プロセス、細胞恒常性、細胞分裂などを変化させる翻訳後修飾である。例えば、CFP10のリン酸化は重要な調節的役割を果たしており、CFP10のリン酸化変異体および模倣変異体の両方が、CFP10-ESAT6欠失株16で観察された表現型を回復できない。一方、SecA2は、宿主細胞17のDNA損傷に関与する分泌タンパク質である。SecA2変異体のセクレトームは、宿主の免疫応答とシグナル伝達カスケードを変化させるのに十分である18,19。したがって、H37Rvのセクレトームと、分泌タンパク質の遺伝子が欠失するMtb変異体(未発表データ)を調査し、それらが宿主の免疫調節と生存にどのように影響するかについての洞察を得ることは不可欠であり、エキサイティングです。

このレポートでは、Mtb培養濾液の調製、質量分析のためのサンプルの処理、免疫調節機能を調べるための培養濾液を用いたex vivo実験の実施の3つの側面に焦点を当てています。以前の研究では、2Dゲル電気泳動とそれに続く質量分析8による培養濾液タンパク質の同定が示されました。薬剤感受性株および薬剤耐性株の培養濾液タンパク質を質量分析法を用いて同定し、セクレトームの変化に関する洞察を得て、薬剤耐性に関与する可能性のある病原性因子を同定した20。私たちは以前に、質量分析16の助けを借りてMtbのsecretomeとphosphosecretomeを調査しました。2Dゲル電気泳動などの技術は低スループットであり、プロテオームやセクレトームの全体的な変化を調べるために使用されません。培養濾液タンパク質は、細菌株、成長細胞の段階、さらにはさまざまなストレス条件で異なります。さまざまな状況に応じて、細胞内の分泌タンパク質プールの変化は、セクレトーム全体を全体的に探索し、治療介入のための細菌分泌システムに関するより多くの情報を提供します。分泌系のノックアウト株または枯渇株のセクレトームを調べて、各分泌経路の経路と標的についてさらに洞察を得ることは、さらに魅力的です。細胞を細菌の代わりに培養濾液タンパク質で処理すると、サイトカインレベルやその他の免疫調節因子が変化します17。セクレトーム研究の助けを借りて、新しい病原性因子とそれらの病原性におけるそれらの役割を特定することができます。

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プロトコル

注:ここでは、MtbのH37Rv病原性実験室株を使用します。細菌培養を増殖させ、バイオセーフティラボレベル3(BSL-3)で培養上清を分離するために必要な手順を実行する必要があります。培養の復活から濾液調製まで、BSL-3施設が利用されています。

1. Mtb 培養物の接種

  1. BSL-3の作業領域の準備
    1. 使用前に、バイオセーフティキャビネットのUVライトを10分間オンにしてください。使用前と使用後に75%エタノールでバイオセーフティキャビネットを清掃してください。使用した材料は、バイオセーフティガイドラインに従って適切なゴミ箱に廃棄してください。
  2. 一次 および二次Mtb H37Rv 培養物の調製
    1. グリセロールストックを-80°Cから取り出し、ストックを室温で解凍します。生物学的四つ子には4つの独立したストックを使用します。
    2. 10% ADC を含む 10 mL の 7H9 培地 (表 1) 10 mL を 100 mL オートクレーブ処理したスクリューキャップ付き円錐形フラスコに入れます。
      注:7H9 + ADC:7H9は市販の栄養豊富な培地であり、ADC(ADC:アルブミン、デキストロース、カタラーゼ; 表2)。ADCとOADCの両方を使用して、培養を成長させることができます。円錐形のフラスコは、培養物により多くの通気を提供します。ただし、組織培養フラスコを使用して細菌細胞を増殖させることもできます。
    3. グリセロールストック全体を培地に接種して、一次培養となる培養物を復活させます。グリセロールストックを作るための600~0.8成長 中のMtb 培養物を取ります。15%グリセロールと増殖中の Mtb 培養物をクライオバイアルで混合し、-80°Cで保存します。
    4. 培養フラスコをインキュベーターシェーカーで37°Cで100rpmで3〜4日間インキュベートします。
    5. 5日目 に、600 nm(A600)で吸光度を測定します。培養物が A600~0.8-1 に達したら、500 mL フラスコに 100 mL の 7H9 +10% ADC 培地に A600 ~0.2 の二次培養物を接種するために使用します。反復に対して同じ手順を実行します。
      1. 一次培養のA600を測定します。A600 が ~ 0.8 の場合、2100 x g で 10 分間遠心分離して培養液をペレット化します。上清を捨て、ペレットを 5 mL の 7H9 + 10% ADC 培地に再懸濁し、A600 を測定します。A600~ 0.2の二次培養物100mLにどれだけの接種物を添加するかを計算します。例えば、A600~4を使用する場合、その培養物の5 mLを、A600 ~ 0.2の新鮮な7H9 + 10% ADC二次培養物100 mLに添加する必要があります。
    6. インキュベーターシェーカーで37°C、100rpmでOD A600 ~0.8になるまで2〜3日間成長させます。
    7. フィルターチップを取り付けたピペットマンを使用して10 μLを引き出し、細菌フードに抗生物質を含まないLB寒天プレートで培養物を見つけます。プレートを37°Cで12〜16時間インキュベートして、細菌汚染(存在する場合)を視覚化します。培養物を廃棄し、細菌汚染が検出された場合は実験の新しい培養物を復活させます。
  3. Sautonの培地における細菌の増殖
    1. A600~0.8 で、500 mL フラスコ中の Sauton 培地 100 mL に A600 ~0.2 の細菌を接種し (表 3)、OD が ~0.8 に達した後 3-4 日間増殖します。
    2. A600 ~0.8 まで培養した Sauton 培地 (Sauton の一次培養物) で培養物を接種し、培養濾液調製に使用します。
      注:7H9 + ADCは、アルブミンを含む栄養豊富な培地です。アルブミンは培養濾液タンパク質を隠す可能性があるため、セクレトーム分析には使用できません。したがって、Sautonの培地は培養濾液の調製に使用されます。Sautonのメディアは、 表3に記載されているコンポーネントを再構成することによって調製されます。

2. Mtb 培養濾液タンパク質の調製

  1. 培養上清の遠心分離
    1. Sautonの一次培養液を使用して、A600 ~0.2で300 mLのSautonの二次培養液を接種します。OD A600 が~0.4-0.5になるまで培養物を育てます。死細胞からの汚染を避けるために、活発に増殖している初期の対数期培養を使用してください。
      1. 二次培養物のODを測定します。ODがA600~0.8に達したら、2,100 x g で10分間遠心分離することにより、培養物をペレット化します。上清を捨て、ペレットを10 mLのSauton培地に再懸濁し、ODを再採取します。.測定されたODから0.2ODの300mL培養物にどれだけの接種物が追加されるかを計算します。例えば、外径が8の場合、その培養物の7.5 mLをOD0.2の新鮮なSauton培地300 mLに添加する必要があります。
        注:細胞溶解とGroEL汚染を減らすために、前述のODに固執してください。GroELはシャペロンであり、細菌細胞内で構成的に発現します。一部の文献では、成長中のストレスにより培養濾液中にGroELが存在することが示されました。ここでは、培養濾液調製にSautonの培地を使用しており、細胞に軽度のストレスを与えます。したがって、GroELは培養液中に存在する可能性があります。また、培養ODが1を超えると、細胞溶解が起こり、培養濾液中のGroELコンタミネーションが発生します。
    2. 6、50 mLチューブ中の300 mLの増殖培養物を2,100 x g で4°Cで10分間ペレット化します(図1A)。
    3. ペレットをそのままにして、45 mLの上清を引き出し、25 mLの血清学的ピペットを使用して、それぞれの場合で新しいチューブに入れます。.ペレットは全細胞ライセート(WCL)調製のために取っておきます。
    4. 2,100 x g で4°Cで10分間遠心分離を繰り返します。 25 mLの血清学的ピペットで40 mLの上清(5 mLの培養物はそのまま残す)を新しいチューブに引き出し、遠心分離ステップを繰り返します。
    5. 上清35 mLを新しいチューブに引き出し、0.2 μmシリンジフィルターを使用して培養上清をろ過します。新しいチューブにろ過して、病原性細菌汚染を排除します。300 mLの培養液から、1回の複製あたり210 mLの培養濾液が回収されます。
      注:ここで培養濾液をろ過するために使用されているフィルターは、0.22μmの滅菌シリンジフィルター(タイプSY25PL-S)です。
    6. 培養濾液を濾過した後、濾過した培養濾液の1 mLアリコートを寒天プレートに接種し、37°Cインキュベーターで4週間インキュベートして、培養濾液中に他の病原性細菌汚染が存在することを確認します。全細胞ライセート(WCL)から1 mLのアリコートを採取し、同じ安全対策を講じてください。
    7. サンプルチューブを75%エタノールで拭き取り、パスボックスを通してBSL-3から取り出します。
  2. 全細胞ライセート(WCL)の調製
    1. ペレットをフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)を含む1x PBSG、1xプロテアーゼ阻害剤カクテル1 mLに再懸濁し、ライセートを1/3容量の 0.1 mmジルコニアビーズを含む2 mLスクリューキャップビーズビートチューブに移します。
      注:1x PBSGは、1x PBS + 5%グリセロールで構成されています。ペレットとバッファーの重量比を 1:3 とします。
    2. ミニビーズビーターでサンプルをビーズで叩いてサンプルを溶解します:1分間のビーズ叩きとそれに続く2分間の氷上でのインキュベーション。これを8回繰り返します。
    3. チューブを18,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。 上清を新鮮な1.5 mLの微量遠心チューブに集め、氷上に保ちます。
    4. 遠心分離ステップを繰り返します。上清を0.2μmシリンジフィルターに通し、病原性細菌汚染を除去します。
      注:ここで培養濾液をろ過するために使用されるフィルターは、0.22mmの滅菌シリンジフィルター(タイプSY25PL-S)です。
    5. 75%エタノールでサンプルを拭き取り、パスボックスを通してBSL-3から取り出します。以下に示すように、BCAアッセイキットを使用してライセートの濃度を確認します。ライセートを-80°Cで保存します。
  3. 遠心フィルターユニットを使用して培養濾液タンパク質を濃縮します。
    1. 遠心フィルターユニットを使用して、210 mLのMtb培養濾液タンパク質を濃縮します。3 kDa 15 mL遠心フィルターユニットチューブ(セントリコン)を使用して、培養濾液を~1 mLに濃縮します(図1A)。3 kDa遠心フィルターユニットチューブは、3 kDaと同じサイズまたはそれ以上のタンパク質を保持します。
    2. 培養濾液の各反復を約15 mLずつ1つのcentricon tubeに添加し、2,100 x g で4°Cで1時間遠心分離します。
    3. 基準に従ってフロースルーを廃棄し、ステップ 2.3.2 を 15 倍から 16 回繰り返し、培養濾液濃縮物 210 mL を ~1 mL にします。
    4. 濃縮した培養液タンパク質100μLを10本の低タンパク質結合性微量遠心チューブに分注し、BCAキットを使用してタンパク質濃度を推定します。
  4. 濃縮タンパク質の推定
    1. BSAを標準としてタンパク質濃度を推定します。1 μg、2 μg、3 μg、4 μgのBSAを25 μLの容量で重複して使用します。サンプルが希釈されていない場合は、25 μLの容量で5倍希釈した(PBS中)サンプルを25 μLで二重に使用して推定します。推定は96ウェルプレートで実行されます。25 μLのPBSを含むサンプルなしコントロール(ブランク)を使用してください。
    2. 175 μLの混合試薬を製造元の指示に従って添加します。マルチチャンネルピペットを使用してサンプルを混合し、37°Cで1時間インキュベートします。ELISAリーダーを使用して562nmでの読み取り値を測定します。空白値から値を差し引いて、BSA とサンプルの値を取得します。
    3. 標準曲線を線形回帰曲線に適合させ、標準に対してサンプルを推定します。タンパク質推定マニュアルのBCAキットに従ってください。

3. 異なるマーカーを用いた培養濾液タンパク質の確認

  1. クマシー染色によるタンパク質の検出
    1. 培養濾液中のタンパク質の存在を確認するには、30 μgのタンパク質を採取し、10%ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE; 表4)。
      注:表の説明に従って、SDS-PAGE、Coomassie染色、および脱染溶液をバッファーにしてください。
    2. 20 mLのクマシー染色溶液(表5)をゲルに加え、ロッカー上で室温で30分間インキュベートします。染色液は廃棄します。
    3. 30 mLの脱染溶液(表6)をゲルに加え、ロッカーで室温で30分間インキュベートします。脱染液を破棄し、新しい脱染液を追加します。ゲルが適切に脱染するまで繰り返します。
    4. トランスイルミネーターのタンパク質ストリークを確認します(図1B)。培養濾液タンパク質にはいくつかのタンパク質が含まれているため、脱染後のゲルにはタンパク質バンドの縞模様が見られます(図1B)。
  2. 分泌タンパク質マーカーのウェスタンブロット確認
    1. 分泌されたタンパク質の抗体を使用して、培養濾液中の分泌タンパク質の存在を確認します。Ag85B(ab43019)は、培養濾液中のよく知られた Mtb 分泌タンパク質であり、サイトゾルに存在します。Ag85B(濃度5 mg/mL)抗体(5% BSAで1:5000希釈)は、分泌タンパク質のポジティブコントロールとして使用されます。
    2. WCLに培養濾液タンパク質をロードして、細胞質/膜と分泌タンパク質画分を区別します。Ag85Bは細胞質で分泌されるため、これは両方の画分に存在するはずです。一方、PknBは膜に局在し、培養濾液には存在しないことが知られています。
    3. BCAキットを使用して、WCL/培養濾液中のタンパク質の濃度を測定します。30 μgのWCL/培養濾液を2x-lamelliバッファーと30 mLの容量で混合します(表7)。PknBの場合は10%SDS-PAGE、Ag85Bの場合は12%SDS-PAGEで、SDSゲルランニムバッファーを使用して、色素の前面が底に達するまでサンプルを分離します(表8)。染料がゲルから流出しないようにしてください。
      注:Ag85Bのサイズは~35 kDaであるため、12 % SDS-PAGEが使用されます。
    4. 9 cm x 6 cm 0.2 μmのニトロセルロースメンブレンを切断し、ゲルからメンブレンにタンパク質を転写します(表9)。転写カセットを使用して転写をセットアップし、カセット、フォームパッド、吸い取り紙、ゲル、およびメンブレンを1x ice-cold転写バッファーに浸します。
    5. 発泡スチロールパッドをカセットの片側に置き、次に吸い取り紙を置き、ゲルを置き、ゲルの上にニトロセルロース膜を置き、再び吸い取り紙を置き、最後に別の発泡パッドを置いてカセットホルダーを閉じます。カセットホルダーをトランスファータンクに入れ、メンブレン側がアノードを向き、ゲル側がカソードを向くようにします。
    6. カソードリード線とアノードリード線をタンクに接続してセットアップを閉じ、120mAの電流で120分間設定します。コールドルームで転送の実行を開始します。
    7. 転送が終了したら、メンブレンを小さなプラスチックの箱に入れます。1x PBST20 で調製した10 mLの5% BSA溶液を使用してメンブレンをブロックし、ロッカー上の室温で1時間非特異的結合を減らします。
    8. ブロッキング溶液を取り出し、抗マウスAg85B抗体である一次抗体(5%BSA溶液で1:5,000希釈)を5〜10 mL加え、ロッカーで4°Cで一晩インキュベートします。抗体は-20°Cで保存し、最大3回まで再利用してください。
    9. 一次抗体を取り出し、1x PBST20を5-10 mL加え、メンブレンを室温で8分間激しく振って洗浄します。最初の洗浄液を取り出し、1x PBST20 を5〜10mL再度加えて洗浄します。これを2回繰り返します。
    10. 抗マウスウマ酸化還元ペルオキシダーゼ(HRP)標識抗体(1:10,000希釈)である二次抗体を含む1x PBST20 を5-10 mL添加し、ロッカー上で室温で2時間インキュベートします。
    11. ステップ3.2.9に従って二次抗体の後にメンブレンを洗浄します。同量のHRP基質とエンハンサーを添加して、ケミルミノメーターの下でメンブレンを現像します(図1C)。
      注:細胞質タンパク質の汚染がないことを確認するために、抗PknB抗体(図1C)でウェスタンブロットをプローブしました。この抗体は、動物施設である国立免疫学研究所で、PknBの精製された細胞質外ドメインに対して産生されました。PknBバンドは、培養濾液ではなくWCLで観察でき、PknBは細胞質および膜結合のみであり、培養濾液には存在しません。

4. 質量分析用サンプルの調製

  1. トリプシンによる溶液中タンパク質消化を行います。
    1. 100 μgの培養濾液タンパク質を取り、氷冷したアセトンを6倍の量で加え、-20°Cで一晩保管します。
      注:ガラス製品を使用して、質量分析サンプルのすべての試薬を調製します。低タンパク質結合性微量遠心チューブと低タンパク質結合チップを使用してください。質量分析におけるポリマー汚染を避けるために、プラスチック材料を使用しないでください。
    2. タンパク質を18,000 x g 、4°C、30分間遠心分離して沈殿させます。上清を捨てます。
    3. ペレットを500 μLのアセトンで洗浄し、18,000 x g で4°Cで10分間ペレットを洗浄します。 上清を捨てます。真空濃縮器を使用して残留アセトンを除去します。
    4. 25 mM重炭酸アンモニウム(MSグレードの水で調製した2 Mストック)に溶解した8 M尿素20 μLを加えます。サンプルをボルテックスし、室温で30分間インキュベートします。
    5. 25 mM重炭酸アンモニウムを60 μL添加し、8 M尿素を2 Mに希釈し、室温で1時間インキュベートします。TCEP 4 μL (25 mM 重炭酸アンモニウム中に 10 mM の最終濃度を添加) を加え、室温で 30 分間インキュベートし、1,800 x g で振とうします。
    6. IAA(25 mM重炭酸アンモニウム中25 mMの最終濃度)4 μLを加え、暗所で1,800 x g で振とうしながら室温で30分間インキュベートします。110 μLの25 mM重炭酸アンモニウムを加えます。
    7. トリプシンを追加します(1:20;トリプシン:タンパク質(μg)を溶液に添加し、300rpmで振とうしながら37°Cに保ち、一晩消化します(図2)。10% TFA(トリフルオロ酢酸)を添加して消化反応を停止します。サンプルを完全に真空にして乾燥させます。
  2. サンプルの脱塩
    1. 消化したペプチドに100 μLの5% ACN + 0.1% TFAを添加します。室温で1,500rpmで30分間ボルテックスします。
    2. 18,000 x g で室温で10分間遠心分離します。ペレットに触れずに上清(ペプチド)を新しい微量遠心チューブに取り、脱塩を進めます。脱塩ステップの前に、すべての洗浄液と溶出液を作ります。
    3. 溶液をピペッティングし、プロセスを5回繰り返して、100 μLの100 μLのACN + 0.1% TFAでC-18カラムチップを平衡化します。
    4. 50% ACN + 0.1% TFA を 100 μL 加え、このプロセスを 5 回繰り返します。5% ACN + 0.1% TFAを100 μL加え、このプロセスを5回繰り返します。
    5. C-18カラムチップにペプチドが結合するまで、30回ピペッティングします。サンプルが質量分析用に処理されるまで、溶液を-20°Cに保ちます。これで、ペプチドはC-18カラムに結合します。
    6. C-18カラムをピペッティングで100 μLのMSグレードの水+ 0.1% TFAで洗浄し、このプロセスを5回繰り返します。
    7. ピペッティングにより、C-18カラムを5% ACN + 0.1% TFAの100 μLで洗浄し、このプロセスを5回繰り返します。C-18カラムから50%ACN + 0.1%TFAの100 μLでペプチドを溶出します(図2)。
      注:溶出後、C-18カラムチップは、質量分析が完了するまで4°Cで保存できます。
    8. 溶出したペプチドを完全にスピードバキュームし、サンプルが質量分析に与えられるまで-20°Cで保存します。
  3. ペプチドサンプルを質量分析に注入します。
    1. 20 μLの溶液A(質量分析施設から提供)を乾燥ペプチドサンプルに加えます。サンプルを30分間ボルテックスし、4°Cで90分間遠心分離します。
    2. 20 μLのサンプルを質量分析装置に注入し、90分間のグラジエント分析を行います。

5. 培養濾液中に存在する分泌タンパク質のデータ解析

  1. タンパク質の同定
    1. 四重極質量分析計を使用してプロテオミクスサンプルを分析します。取得したスペクトルを Mtb H37Rv UniprotKB データベースに対してクエリします。
    2. プリカーサーとフラグメントの質量許容誤差を 10 ppm と 0.5 Da に設定し、酵素をトリプシンに設定し、最大ミス切断値を 2 に設定します。
    3. Sequestを検索アルゴリズムとして、システインのカルバミドメチル化を固定修飾としてSequestを併用したプロテオームソフトウェアを使用します。
    4. すべてのペプチド-スペクトル一致(PSM)を1%の誤検出率で特定します。他のすべてのパラメータにデフォルト設定を適用します。
    5. ペプチド配列の生質量分析ファイルを、それぞれのMtbタンパク質のUniProt IDにマッピングします。Mycobrowserデータベースを使用して、すべてのMtbタンパク質、そのUniprot ID、および機能分類をリストアップします。
    6. さらに解析を進めるには、同定したタンパク質のUniProt IDをそれぞれの Rv 番号にマッピングします。質量分析セクレトームのデータは、PRIDEパートナーを通じてProteomeXchangeコンソーシアムに寄託します。

6. H37Rv を培養ろ液タンパク質で処理し、宿主シグナル伝達の変化を確認する

  1. マウスからの腹膜マクロファージの単離。
    注:腹膜マクロファージの単離、細胞の播種、および感染については、参考文献21 に従ってください。
    1. Balb/cマウス(4-6週齢)に1mLの4%チオグリコール酸を注入し、感染21の4日目にマウス腹膜から腹膜マクロファージを単離する(図3)。
    2. マウス腹膜に1x PBSを注入してマクロファージ細胞を採取します。細胞を1,800 x g で5分間遠心分離し、上清を廃棄し、10% FBS(Fetal Bovine Serum;完全培地)および1x Pen-strep(抗生物質)を添加した5 mLの1640-RPMI培地を加えます。
    3. ウェルあたり3 x 105 個の細胞を24ウェルプレートに播種し、プレートを37°Cのインキュベーターで一晩インキュベートします。翌日、培地を新鮮で完全な培地に交換すると、細胞は培養濾液タンパク質による感染または処理の準備が整います。
  2. 培養濾液タンパク質による腹膜マクロファージの治療
    1. マクロファージ細胞をBSL-3に持って行き、インキュベーターに保管します。細胞を1 mg/mL培養濾液タンパク質で処理します(図3)。培養濾液処理後4時間、24時間、および48時間の異なる時点で細胞を回収します。
      1. 単離されたマクロファージ細胞を24ウェルプレートに播種し、各時点で3重に播種します。細胞を1 mg/mLの培養濾液タンパク質で処理し、CO2の存在下で37°Cインキュベーターでインキュベートします。処理後4時間、24時間、および48時間の3つの時点で細胞を回収します。
      2. i)2x-ラメラバッファーで細胞を処理してマクロファージ細胞ライセートを作製し、ウェスタンブロッティングを実施してさまざまな宿主細胞マーカーを確認します。また、ii)キットとともにメーカーが提供する免疫学的アッセイ用のさまざまなバッファーで処理します。
    2. 宿主の細胞ライセートを調製し、培養濾液処理マクロファージ細胞に対するさまざまなマーカー、宿主細胞のサイトカインプロファイリング、およびさまざまなシグナル伝達経路タンパク質の発現を確認します。
      注:ラボに分泌経路タンパク質の遺伝子置換変異体がある場合、 Mtb H37Rv および Mtb 変異体から調製された培養濾液を使用して、宿主免疫調節パラメータへの影響を評価できます。

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結果

このプロトコールでは、 マイコバクテリア からの培養濾液タンパク質の単離を実証しました(図1A)。次に、培養濾液タンパク質でさまざまなマーカーをチェックし、培養濾液の単離を確認しました。プロトコールに記載されているように、タンパク質のローディングを確認するために、Coomassie染色を行いました。WCL画分(最後のレーン図 1B)では縞模様のタンパク質バンドが観察できますが、CF(培養濾液)レーンでは、すべてのタンパク質が見えず、すべてのレーンのタンパク質負荷は等しくなりました。ウェスタンブロットを異なる抗体を用いて行い、単離された異なる画分を確認しました。Ag85Bを使用して、培養濾液の画分を確認しました。 図1C のAg85Bに対応する~35 kDaのタンパク質バンドが、培養濾液とWCLの両方で観察されました。PknBは細胞質画分に用いられた。 図 1C では、~75 kDa ...

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ディスカッション

重要な研究分野の1つは、結核の病因を理解し、効果的な診断とワクチンを開発することに関係しています22,23。Mtb培地からの培養濾液タンパク質の単離は、病原体によって分泌される病原性因子の同定を可能にするプロセスです。Mtbの病因の調節における分泌タンパク質の役割を調査することで、メカニズムの洞察が得られ、治療介入の候補にもなる可能性がある。研究によると、H37Rv培養濾液には、宿主細胞の恒常性、細胞プロセス、および転写調節を調節するタンパク質が含まれていることが示されています。一部の培養濾液タンパク質は、宿主細胞の侵入を助け、細菌がマクロファージ内で生き残るのを助けます。これらのタンパク質は、宿主細胞の経路を操作して、細菌の生存のためのニッチを作り出すことができます。

このプロトコルは、BSL-3の病原性Mtb

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開示事項

著者は何も開示していません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.2 &マイクロ;m シリンジフィルターmdiSYPL0601MNXX204
0.2µm ニトロセルロース メンブレンアマシャム10600001
37% HClメルクH1758
アセトンエンプルラ メルクSL9F690866
アセトニトリルSigma-Aldrich34851-2L
アクリルアミドバイオラッド1610107
アルブミンバイオ ベーシック カナダカタログ番号 AD0023
アミコンUltra-15Merck, MilliporeUFC900396
Ammonium biocarbonateSigma-Aldrich09830-500G
過硫酸アンモニウムSigma-AldrichA3678-100G
抗Ag85BAbcamAB43019
抗マウスHRP標識二次抗体Thermo Fischer62-6520
アスパラギンSigma-AldrichA0884-500G
bis-acrylamideSIGMA146072-500G
BSA MerckMB083-500G
C-18 カラムThermo FischerSEM SS18V
Catalase シグマ-アルドリッチC1345
エン酸シグマ-アルドリッチC0759-500G
デキストロースシグマ-アルドリッチG7021-1KG
ディフコミドルブルック7H9ブロス  フィッシャーサイエンティフィック271310
クエン酸第二鉄アンモニウム(III)シグマアルドリッチF5879-100G
ギ酸98-100%メルクZ0823704246
氷酢酸100%メルクCD0C700160
グリシンSigma-AldrichG8898-1KG
グリシンSIGMAG8898-1KG
GycerolSigma-AldrichG5516
Immobilion Western Chemiluminescent HRP substrateMerckWBKLS0500
IodoacetamideAmershamRPN6302V
Mga sulpahteSigma-AldrichM7506-500G
Mycobroswer
オレイン酸Sigma猫番号: O1008
Pierce BCA protein assay KitThermo Fischer23225
Pierce Trypsin ProtaseThermo Fischer90058
Proteome Discoverer 2.0Thermo Fischer Scientific
Q-Exactive HF (Thermo Scientific) (プロテオミクス実験 - ペプチドシーケンシング、タンパク質同定、定量)Thermo Fischer Scientific
塩化ナトリウムSigmaカタログ番号:S3014
塩化ナトリウムSigma-AldrichS7773-1KG
ドデシル硫酸ナトリウムSigma-AldrichL3771-1KG
TCEPSigma-AldrichC4706-25
TemedSigma-AldrichT9281-100ML
Tris BaseBioRad161-0719
Tris-HClAMRESCO0234-500G
Tween 80Sigma-AldrichP1754
UniProt タンパク質データベース
尿素MP バイオ194857
ク

参考文献

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