ライブイメージングに適した、クテノフォア Mnemiopsis leidyiのスタトシストおよび関連組織を除去するための簡単なプロトコルについて説明します。
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この記事について
サマリー
要約
クテノフォア Mnemiopsis leidyi は、全身再生の古典的な動物モデルです。多くの実験技術の扱いやすさの向上と、残りの後生動物の姉妹グループとしての系統発生的配置により、クテノフォアの研究に対する科学的関心が最近新たに高まっています。それらは、体の ~15% という小さな断片からの完全な全身再生を含む、数日間にわたって、欠損した臓器や細胞型を再生することができます。ほとんどのクテノフォアと同様に、 M. leidyi は、感覚入力を運動出力にリンクして体の位置と向きを制御する、異常に配置された重力感知器官を持っています。このプロトコルは、 M. leidyi の腹部器官(AO)複合体および関連構造の外科的除去と、その後の数時間から数日で起こる創傷治癒および再生のプロセスを画像化するのに適した培養、取り扱い、および取り付け方法を示しています。これらの簡単な手法は、さまざまな実験パラダイムや実験室の状況に広く適応できます。
概要
櫛ゼリーとしても知られるクテノフォアは、地球の海洋環境にとって国際的であり、特に食物網の一部として、生態系の主要なプレーヤーになる可能性があります。クテノフォア Mnemiopsis leidyi は、歴史的でますます人気のある全身再生の動物モデルです 1,2。欠損した臓器または細胞型を再生する能力は、胚形成の終わりに向かって発生し、胚後の生涯を通じて持続します3,4(体のサイズが~0.1〜>1,000 mm)。また、生涯を通じて透明であり、多様なライブおよび固定イメージング技術に対応しています。すべてのクテノフォアの最新の共通祖先は、多くの細胞型と複雑な器官を持っていました。現存するほとんどのクテノフォアは、少なくとも1つのライフステージでこれらのほとんどを持っています:中絶の重力感知器官(歴史的には頂端器官と呼ばれ、ここでは上顎器官、AOと呼ばれます)、高度に組織化された大繊毛で構成される特殊な自発運動構造協調的に鼓動する(櫛列)、格納式摂食触手、および有害な刺激に応答して生物発光するフォトサイト(図1)。
それらの多数の細胞型と複雑な状況依存の行動にもかかわらず、ゲノムデータの堅牢なボディは、他のすべての生きている動物の姉妹グループとしてのクテノフォアの位置付けを支持しています5,6,7,8。クテノフォア神経系の細胞的および機能的基盤と、神経系を持つ他の動物(両側性動物および刺胞動物)との大きな違いは、クテノフォア神経系が独立した起源を表すという仮説を示唆しています。ただし、これは不確実なままです 9,10,11,12。
腹部感覚器官複合体には、複数のタイプの推定神経感覚細胞13、14、15、16、17、18を含む多くの細胞型を含むスタトシストが含まれ、操作されていないクテノフォアで一定の維持下にあります。機械感覚細胞には大きな毛様体束があり、重力を検出するために生体石灰化細胞(リソサイトと呼ばれる)で構成されるスタトリスによって偏向されます。未知の機能14の推定感覚構造14 と推定される光感覚細胞16を含む2つの「極性フィールド」が、スタトシストに隣接しています。
の実験的調査 M.leidyiの再生能力は、胚から孵化したばかりの移行期(~100 μm)の最小動物から、自由生活の巨視的成体(>2 cm)に及びました。体径~1mmの M.leidyi は、マイクロマニピュレーターなどの特別な器具なしで手動の外科的操作を可能にするのに十分な大きさですが、高出力の対物レンズでイメージングするための標準的な顕微鏡スライドに取り付けるのに十分な大きさです。このプロトコルは、その後数時間から数日で起こる創傷治癒と再生のプロセスを記録するのに適した培養およびイメージング方法とともに、腹部感覚器官および関連構造の外科的除去を示します。
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プロトコル
1. 道具や備品を準備する
- 標準的なブンゼンバーナーを使用して、ガラスキャピラリーマイクロピペットからガラス解剖針を手で引っ張ります。1 mmを超える動物には、液体処理用の校正済みソーダ石灰ガラスマイクロピペットを使用してください。
注:100 μlサイズは、0.5〜3 mmの焦点範囲でうまく機能します。- ブンゼンバーナーに鋭い青い円錐形の炎を確立します。
- ガラスピペットの中心点を、穏やかな圧力で動くのに十分なほど柔らかくなるまで炎に保持します。
- ピペットを炎から外し、すぐに両側をまっすぐ引き離して、短くて強い針を作ります。
注:最初の試行で満足のいく結果が得られなかった場合は、ガラス針材を再溶かし、壊れた針を保存して再度引っ張ることができます。この方法で引っ張られた使用可能な針と使用できない針の例については、 図2 を参照してください。
代替案:26 G 1/2インチの針も、特に焦点サイズ範囲の大きい方の端でうまく機能します。
- 0.22μmのフィルターに天然または人工海水を通すことで滅菌海水を調製します。
- 測定ピペットを作成します。
- 鋭利なハサミまたはカミソリの刃を使用して、プラスチックトランスファーピペットを切断して、好みのサイズの内径の開口部を作成します。少なくとも1つのピペットを目的の範囲の上部に、1つのピペットを目的の範囲の下部に準備してください。測定ピペットのセットの例については、 図3 を参照してください。
注:これらのピペットは~8 mmまでうまく機能します。また、写真からマイクロメーターや測定ツールでサイズを推定することも可能です。
- 鋭利なハサミまたはカミソリの刃を使用して、プラスチックトランスファーピペットを切断して、好みのサイズの内径の開口部を作成します。少なくとも1つのピペットを目的の範囲の上部に、1つのピペットを目的の範囲の下部に準備してください。測定ピペットのセットの例については、 図3 を参照してください。
2. 実験用の動物を準備する
- 所望のサイズとステージの形態学的に正常な個体を選択します。
注:直径~0.5〜3 mmの動物がスライドへの取り付けに最適です。動物が最下位のサイズピペットには収まらないが、最上位のサイズピペットには快適に収まることを確認します。 - 実験動物を8〜16時間飢えさせます。
注: M.leidyi は光学的に透明で自家蛍光性が高くありませんが、消化器系を循環する食物は一般に不透明であり、しばしば自家蛍光を発します。
3. カットを実行する
- 実験動物の体格よりも幅の広いトランスファーピペットを使用して、滅菌海水の入った35mmのポリスチレン皿に移します。
- 解剖顕微鏡を使用してサンプルを視覚化します。1匹の動物をそのアデソファジア側に転がします(図1)。このビューは、腹部器官を除去するための最も簡単なアクセスを提供します。腹部器官に焦点を当てます。
注:最も有用な倍率は、動物のサイズやユーザーの好みによって異なる場合があります。一般的に12〜20倍の倍率がうまく機能します。 - 利き手ではない手を使って、1本のガラス針で動物をそっと所定の位置に保持します。
- 利き手を使用して、鼻腔器官の少し下に針の先端を挿入します。斜めに入って、腹部器官の目に見える端からその基部の下まで1つの切り込みを入れます。針を引き抜き、2回目の切り込みを行い、腹部器官のすべての構造を含むくさび形の組織片を取り除きます( 図4、トップパネルを参照)。動物と切除された組織を注意深く検査して、手術が成功したことを確認します。
- 同じトランスファーピペットを使用して、切りたての動物を滅菌海水の入った新鮮な皿に移します。
注:創傷はすぐに閉じるため、実験目標(複数の同期再生サンプルや治癒と再生の初期段階を画像化する場合など)に応じて、複数のサンプルを生成するために迅速に移動する必要があります。タイマーを使用して手術時間を制限し、再生動物のコホートを近づけます。
4. カットが正しいことを確認する
注:解剖顕微鏡で注意深く確認しても、手術ミスを見逃すことがあります。
- 以下の取り付け手順に従って、術後の各個人をスライドガラスに一時的に取り付け、DICを備えた複合顕微鏡で、意図したすべての構造が正しく除去されたことを確認します。この時点でそれ以上のイメージングを行わない場合でも、このチェックを実行してください。
注:クテノフォアの優れた治癒能力は、接ぎ木実験に適しています。切除したAOの切断面とそれが取り出された動物の残りの部分がくっついて融合する可能性を防ぐために、切除した腹部器官を培養容器から常に取り除きます。
長期イメージングに直接進まない場合は、スライドを密閉しないでください。これにより、この実験動物の迅速な回復と培養への復帰が促進されます。高倍率で手術精度を確認することをお勧めします。特に、スタトリスは手術を完了せずにドームからノックアウトすることができます。
5. ライブイメージング
- マウンティング
- 標準的なガラス顕微鏡スライドをガラス処理用の撥水剤などのシラン化剤で処理し、完全に乾燥させます。
- 手術後1匹の動物をトランスファーピペットで準備したスライドに移します。水が動物の中に入っていることを確認します。
- カバーガラスの各角に少量のモデリング粘土(~1.5 mg)を置き、カバーガラスを持ち上げて動物から離すためのスペーサーとして機能する「足」を形成します。
- カバーグラスを粘土で塗ったものを動物の上にそっと置きます。カバーガラスの各角を持ち、動物を画像処理用の所定の位置に転がします。下に押して動物をわずかに圧縮し、所定の位置に保持します。満足のいくビューが得られるように、サンプルの位置を必要なだけ変更します。
- ~30分を超えるイメージングの場合は、カバーガラスの両端にワセリンの薄層を塗布して、試料の乾燥を防ぎます。
注:この方法でマウントされた M.leidyi は、さらなる培養または他のアッセイのために簡単に回収できます。ただし、動物は通常、1〜2時間以内に自分自身を解放して再配置するため、2時間を超える連続タイムラプスキャプチャには、異なるイメージングアプローチが必要になります。
6. 培養
- カサゴイドの培養条件
- 培養は、室温に近いろ過された天然または人工海水で外科的に操作された動物と対照です。一貫した結果を得るために、20〜22°Cに設定されたインキュベーターを使用してください。
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結果
Cydippid-stage M. leidyi は通常、損傷後~20分以内に創傷閉鎖を完了しますが(図4 および 図5)、臓器の完全な再生には1〜3日かかる場合があります。このタイミングには生物学的ばらつきがありますが、ほとんどの場合、手術後 72 時間までに完了します (図 6)。
手術前後の画像で示されているように、腹部臓器複合体および近くの組織から細胞とメソグリを外科的に除去し、その後創傷を急速に閉鎖すると、全体の体径が小さくなります(図3)。
0.5〜3 mmのサイズ範囲のcydippidステージ M.leidyi を使用して、私たちの研究室の学部生は、このプロトコルに従って再生アッセイを作成することができ、動物の53%が除去後48時間までに、1...
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ディスカッション
同様の実験は、任意のサイズで実行できます M. leidyi 希望する。臓器の形態形成は、再生能力の開始と同時に完了します4。動物は野生から収集されるか19、または実験室で飼育されるか20,21。特定の体のサイズが必要な場合は、動物を産卵させ、子孫を希望のサイズに育てることができます。本体サイズは、プロトコルステップ1.3で作成された測定ピペットを使用して、目的の内径に切断して概算できます(図3)。小さいピペットと大きいピペットを1つ使用することで、さまざまなサイズの動物を集めることができます。大型の動物では取り扱いが容易になりますが、固定化とイメージングがより困難になり、体格が~5 mmを超える動物は、このプロファイルに大規模な変更が必要になる場合があります。生後~1週間(または上...
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開示事項
著者には開示すべき利益相反はありません。
謝辞
著者らは、ジョヴィタ・ジョセフに感謝の意を表して感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.2 & ミュー;m SFCAシリンジフィルター | サーモ/ナルジーン | 723-2520 | 無菌海水を作る |
| 35mmポリスチレンシャーレ | ファルコン/コーニング | 351008 | カットを実行します。小動物の文化 |
| 60 mL 使い捨てルアーロックシリンジ | BHサプライ | BH60LLの | 無菌海水を作る |
| 校正済みガラスピペット、100 &L | ドラモンド | 2-000-100 | カットを実行する |
| カバーグラス、#1.5、18mm角 | VWRの | 16004-326 | イメージング用マウント |
| クテノフォア | 湾岸の標本 | 生きた動物 | |
| ダブルキャビティガラスくぼみスライド、1.3 mm | VWRの | 470200-930 | イメージング用マウント |
| ガラス顕微鏡スライド | VWRの | 16004-398 | イメージング用マウント |
| インスタントオーシャンシーソルト | インスタントオーシャン | 動物用培地 | |
| ミニ定規 | テッド・ペラ | 13623 | プラスチックピペットの測定 |
| モデリング粘土(粘土) | ペピープラスチリナ | イメージング用マウント | |
| ワセリウムゼリー | ワセリン | イメージング用マウント | |
| プラスチックトランスファーピペット(各種サイズ) | コール・パーマー | 06226-13, 06226-12, 06226-01 | 小動物を動かす |
| Rain-Xガラス処理 | レイン-X | 顕微鏡スライドのシラナイズ | |
| ルーラー | ウェストコット | 10564 | プラスチックピペットの測定 |
| 鋏 | オキソ | プラスチックピペットを切断 |
参考文献
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