マウスのアイデンティティ認識を調べるための行動課題

サマリー

否定的または正の価数の経験を個々の社会的目標と組み合わせることにより、C57BL/6マウスのアイデンティティ認識を調べるための行動課題を開発した。これらの課題により、社会的認知が損なわれた健康なマウスモデルと疾患関連マウスモデルにおいて、個々の社会的標的の社会的記憶のメカニズムを研究することができます。

要約

げっ歯類のような社会的な動物は、身近な個人のアイデンティティを認識し、区別することができます。身近な個人のアイデンティティを認識することは、ヒエラルキー、親族関係、家族などの社会構造を発展させるために重要です。しかし、社会的アイデンティティの認識の根底にあるメカニズムは、まだ不明です。社会的認知に関するほとんどのげっ歯類の研究は、げっ歯類が新しい社会的ターゲットと相互作用する傾向、つまり社会的新規性として知られる現象に基づいています。しかし、社会的な新規性を調べるための行動課題では、身近な同種のアイデンティティに基づく認識を明らかにすることはできません。ここでは、C57BL/6マウスのID認識を、原子価の経験を持つマウスと持たないマウス2匹を関連付けることにより、アイデンティティ認識の検討を可能にする行動課題を紹介します。被験者は、2匹のマウスと相互作用をした(中立的)または価数の経験(陰性または陽性)のいずれかで、これらのマウスに親しむようになった。負価のマウスはショックと関連し、正の価数を持つマウスは食物報酬と関連していました。訓練後、これらの身近なマウスのアイデンティティの認識は、社会的識別テストで明らかにすることができ、これは、正価マウスの選好性と、中立マウスと比較して負価マウスの回避として表されます。アイデンティティ認識のための行動課題は、自閉症スペクトラム障害や統合失調症など、社会的認知障害を伴う障害の社会的記憶メカニズムや病態生理学を探るのに役立つ可能性がある。

概要

アイデンティティ認識、つまり過去の経験に基づいて身近な個人を特定する能力は、社会的な動物の生存にとって重要です¹。げっ歯類では、社会的階層、配偶者と子孫の認識、縄張り防衛、およびグループの確立と維持は、アイデンティティ認識が成功した際の義務的な行動です^2,3。社会的記憶の現在の理解は、新しい同種と身近な同種を識別する能力に根ざしたげっ歯類の研究に基づいています。これらの課題は、海馬CA2⁴や腹側CA1領域⁵など、社会的記憶を媒介すると考えられる脳領域の発見に役立っています。しかし、そのような研究は、社会的新規性のカテゴリー的認識に限定されているため、アイデンティティ認識の根底にあるメカニズムを解明するには限界があります。

アイデンティティ認識は、社会的新規性とは無関係に、価数のある顕著な経験が2つ(またはそれ以上)の身近な社会的ターゲットの1つに関連付けられる連想学習パラダイムを介して実証されてきました。これらの課題は、社会的相互作用はしばしば感情的な意味と結びついており、ネガティブな経験は対立を防ぐ行動をもたらすのに対し、遊び心のある相互作用や育成的な相互作用は一般的にやりがいがあるという考えに基づいています。相互作用に付随する感情的な影響は、社会的価数と呼ばれます。オスのゴールデンハムスターは、1つが以前にそれらを攻撃したときに、2つの身近な同種のターゲットを区別することができました⁶。個々の雄のWistarラットの認識記憶も、社会的ランク⁷の確立にとって重要でした。

最近、神経科学研究で最も広く使用されているマウス系統であるC57BL/6マウスにおいて、個々のC57BL/6マウスを食欲刺激の有無を関連付けることにより、アイデンティティ認識が検討^{されている8。}このアプローチでは、頭部固定マウスを用いて数百回の訓練試験を行ったため、自由に動くマウスの自然主義的な行動を調べるための使用は限られていました。他の研究では、C57BL/6マウスの同一性認識は、エタノール投与された同種の選好によって支持された^9,10。それにもかかわらず、物質の投与は交絡を引き起こす可能性がある。最後に、これらの研究のうち、雌雄のげっ歯類のアイデンティティ認識を調べるために使用されたものはほとんどありません。C57BL/6マウスの雄と雌の両方に適用できる、簡単に採用できる方法は、アイデンティティ認識の研究をさらに進めるために重要なツールです。

ここでは、雄と雌の両方のマウスで使用できるアイデンティティ認識パラダイムを示します。新規性の影響から独立したアイデンティティを研究するために、2つの身近な社会的ターゲットが使用され、これらのターゲットの1つは、相互作用行動を知らせると推定される顕著な感情的経験に関連付けられています。否定的な社会的価数関連については、特定の社会的目標に対する回避を引き出すために、社会的恐怖条件付けと同様のアプローチが適応された¹¹。嫌悪性フットショックなどの負の社会的価数が個人に関連付けられている場合、社会的ターゲットとの相互作用の減少が予想されます。逆に、食欲報酬などの正の社会的価数が特定の個体と関連している場合、このマウスとの相互作用の増加は、その後の試験で予想されます。まとめると、概説された行動課題は、C57BL/6マウスや他のマウス系統のアイデンティティ認識の研究のために、ほとんどの研究室で簡単に適用できます。

プロトコル

この研究では、成人の雄C57BL/6マウス(8-10週齢、体重:18-25g)を使用しました。ソーシャルターゲットとして使用されたマウスは、異なる同腹児からのものであり、対象マウスにとって以前に馴染みがなかったことを確認するために、別の供給源( 材料の表を参照)から入手しました。すべてのプロトコルは、ダグラス研究センターの施設動物管理委員会によって承認され、カナダ動物管理評議会(プロトコル番号:DOUG-5935)のガイドラインに従っていました。

1. 材料 (図 1 を参照)

1. 大きな透明なケージ(24 cm x 36 cm x 19.5 cm)を、負の社会的価数実験の中立的なコンテキストとして設定します
2. 負の価数のコンテキストとして、黒い壁の三角形のショックボックス(各辺の長さ= 46 cm、高さ= 29 cm)を使用します。ショックボックスの床が、スクランブルグリッド電流発生器に接続された金属製のグリッドで構成されていることを確認してください。
3. 大きな透明なケージ(26 cm x 47 cm x 21 cm)を、正の社会的価数実験の食物慣れのコンテキストとして使用します。
4. 大きな黒壁のケージ(24 cm x 36 cm x 19.5 cm)を、正の社会的価数実験の中立的なコンテキストとして使用します。
5. フードポート付きの大きな白い壁のケージ(24 cm x 36 cm x 19.5 cm)を、ポジティブな社会的価数のコンテキストとして使用します。フードポートは、壁の片側を通るプラスチックチューブ(直径0.5cm)を使用し、チューブの下に白いプラスチック皿を置きます。
6. ニュートラルなコンテキスト(ネガティブおよびポジティブの社会的価数実験における中立的なトレーニング)およびポジティブな社会的価数のコンテキストの床として使用するためのプレカットされた白いイーゼルパッドペーパー。パッドをコンテキストの底面よりわずかに小さくカットして、対象のマウスが紙の下に穴を掘らないようにします。対象のマウスの間にイーゼルパッドを交換します。
7. 無塵精密ペレット(20 mg、チョコレート風味)を、正価の社会的目標との相互作用の報酬の手がかりとして使用します。
8. 正の社会的価数実験の期間中、被験者マウスの体重を毎日測定するためのスケールを使用します。
9. 社会的差別テストには、中央の部屋に左右のチャンバーに接続する開口部がある3チャンバーボックス(81 cm x 23 cm x 23 cm)を使用します。取り外し可能なチャンバードアを使用して、セッション間の中央チャンバーに対象マウスを収容し、取り扱いストレスを防ぎます。
10. ネガティブとポジティブの両方の社会的価数のトレーニングには、2つの同一の長方形のプレキシガラスエンクロージャー(10 cm x 5 cm x 30 cm)を使用します。
11. 社会的差別テストには、4つの円形ワイヤーカップ(8 cm x 8 cm x 10 cm)を使用します。社会的差別テストのセッション1中は、2つのワイヤーカップを空にしてください。セッション2では、正または負の社会的価数トレーニングで使用したソーシャルターゲットを他の2つのワイヤーカップに配置します。
    注意: ワイヤーカップにラベルを付けて(テープを使用するなど)、同一のワイヤーカップを区別します。実験内では、実験期間中、同じ目的でワイヤーカップを使用します。ワイヤーカップ内に別のソーシャルターゲットを配置する必要がある場合は、石鹸、水、過酸化水素ベースの速効性消毒剤でワイヤーカップを完全に洗浄します。
12. 社会的差別試験では、被験者のマウスがワイヤーカップの上に登らないように、ひっくり返ったワイヤーカップの上に2つのガラス瓶を置きます。
13. トレーニング中のエンクロージャーに、負の社会的原子価実験用の非導電性材料の床があることを確認してください。たとえば、電気テープで覆われたプラスチックまたは段ボールを使用して、負価のソーシャルターゲットがトレーニング中にショックを受けないようにします。
14. サイレントタイマーを使用して、動物の行動に干渉する可能性のある外部の手がかりを避けます。
15. 高解像度(1,080 p / 30 fps)のWebカメラをラップトップコンピューターに接続して、トレーニング中のマウスの動作や社会的差別テストをキャプチャします。
16. コンテキストの中心で測定された 60 dB の静的ホワイトノイズを生成するホワイトノイズジェネレータを使用します。
    注:すべての行動手順は、動物の行動に影響を与える可能性のある環境音を隠すために、コンテキストの中心で測定された60dBの静的ホワイトノイズを使用して実行する必要があります。
17. すべての行動手順に赤色光ランプを使用してください。
    注:これにより、暗い環境条件が提供され、マウスでの探索が促進され、ビデオ録画で動物の行動を視覚化できます。
18. 空と動物を含む両方のきれいな囲いを、70%エタノールで被験者マウスの間に、速乾性です。過酸化水素ベースの速効型消毒剤を使用して、被験者マウス間のクリーンなトレーニングとテストのコンテキストにより、以前の被験者マウスからの嗅覚の手がかりによる行動への潜在的な影響を排除します。

2.行動手順

1. 負の社会的価数
   1. コンテクストの慣れ
      1. 実験期間中、実験室にホワイトノイズと周囲の赤色光を装備します。
      2. ショックボックスを準備するには、中央に非導電性の床がある空のプレキシガラスの筐体を配置します。
      3. 対象のマウスをショックボックスの隅に置き、マウスが5分間自由に探索できるようにします。
      4. 対象のマウスをホームケージに戻します。
      5. 残りのマウスでショックボックスの慣れを繰り返します。
      6. 少なくとも 1 時間後に、ニュートラル コンテキストでコンテキスト慣れ手順(ステップ 2.1.1.1-2.1.1.5)を繰り返します。
   2. ネガティブバレンストレーニング
      1. ネガティブな原子価トレーニングは、両方の状況に慣れてから少なくとも1時間後に開始します。
      2. 電流を0.3mAに設定してショックボックスを準備します。
         注:推奨される現在の設定は、使用したショックボックスと実験デザイン(3日間のトレーニング)に基づいています。この設定は、他の実験計画に合わせて変更できます(たとえば、トレーニング試行回数が少ない計画では、より強い電流を使用できます)。
      3. 負価のソーシャルターゲットをプレキシガラスの筐体に入れ、ショックボックスの中央に非導電性の底を置きます。
      4. ビデオ録画を開始し、被写体のマウスをショックボックスの隅に置きます。
      5. タイマーを開始し、対象のマウスが自由に探索できるようにします。
      6. 4分と4.5分で、1秒の長さの電気ショックを与えます。
         注:これにより、嫌悪性ショックを経験する前に、対象のマウスと社会的ターゲットとの間の十分な相互作用時間が可能になります。
      7. 5分で対象のマウスを取り外し、録音とタイマーを停止します。
      8. 対象のマウスをホームケージに戻します。
      9. ショックボックスを消毒し、残りの被験者マウスで陰価訓練を繰り返します。
   3. ニュートラルトレーニング
      1. ネガティブバレンストレーニングの少なくとも2時間後にニュートラルトレーニングを開始します。
      2. ニュートラルなソーシャルターゲットをエンクロージャーに配置し、非導電性の底をコンテキストの中央に置きます。
         注:非導電性の底部は、ネガティブコンテキストとニュートラルコンテキストが同一のコンテキストキューを持つようにするために使用されます。ニュートラルトレーニングではショックは与えられません。
      3. ビデオ録画を開始し、被写体のマウスをニュートラルコンテキストの隅に置きます。
      4. タイマーを開始し、対象のマウスが自由に探索できるようにします。
      5. 5分で対象のマウスを取り外し、録音とタイマーを停止します。
      6. 対象のマウスをホームケージに戻します。
   4. 研修の順序
      1. 1日目:両方のコンテキストの慣れ(ステップ2.1.1)後、ネガティブ価トレーニング(ステップ2.1.2)の2時間後にニュートラルトレーニング(ステップ2.1.3)を実行します。
      2. 2日目:2日目に逆のトレーニング順序でトレーニングを繰り返します(ステップ2.1.3、次に2.1.2、つまり、ニュートラルトレーニングを実行し、2時間後に負の価数トレーニングを実行します)。
      3. 3日目:3日目に逆のトレーニング順序(ステップ2.1.2、次に2.1.3、つまり、負の価数トレーニングとそれに続くニュートラルトレーニングの2時間後)でトレーニングを繰り返します。
2. 正の社会的価数
   1. 食料不足
      1. 実験期間中、各被験者マウスの体重を毎日測定します。
         注:任意の時点で、被験者のマウスが元の体重の15%以上を失った場合、食物の剥奪を止め、マウスをさらなる実験から廃棄する必要があります。
      2. ホームケージ内の被験者マウス1匹につき1gの通常のマウスフードを提供する。
         注:対象のマウスは、マウス1匹につき1gの食物をグループで飼育しています。たとえば、4匹のマウスをグループハウスにすると、4 gの餌がホームケージに入れられます。
      3. 正の社会的原子価実験の期間中、食物剥奪を毎日繰り返します (つまり、食物ペレットの慣れ、状況の慣れ、および正の原子価トレーニングの毎日に続きます)。
   2. ショ糖食品ペレットの馴染み
      1. 食品ペレットの馴染みは、食料不足が始まってから12時間後に開始します。
      2. 実験期間中、実験室にホワイトノイズと周囲の赤色光を装備します。
      3. 対象のマウスを食物慣れのコンテキストの隅に配置します。
      4. タイマーを開始し、10分間で1スクロース食品ペレット/分を配信します。
      5. 10分で被写体を取り外し、マウスをホームケージに戻します。
      6. 対象のマウスが消費したショ糖食品ペレットの数を記録します。
      7. ショ糖食品ペレットの馴化を合計3日間繰り返します。
         注:マウスが3日後にショ糖食品ペレットを消費しない場合は、さらに慣れ日数を追加できます。
      8. 食品ペレットの慣れ中にショ糖食品ペレットを消費しない被験者を研究から削除します。
   3. コンテクストの慣れ
      1. ショ糖食品ペレットの馴化の1日後(4日目)に、コンテキストの隅に空のプレキシガラスエンクロージャーを配置して、正の原子価コンテキストを準備します。
      2. 対象のマウスを正の原子価コンテキストの隅に置き、マウスが10分間自由に探索できるようにします。
      3. 対象のマウスをホームケージに戻します。
      4. 残りのマウスで正の原子価コンテキストの慣れを繰り返します。
      5. 少なくとも1時間後に、中立的なコンテキストでコンテキスト慣れ手順を繰り返します。
   4. ポジティブ価数トレーニング
      1. 両方の状況に慣れてから少なくとも1時間後に、陽性価数のトレーニングを開始します。
      2. 正価のソーシャルターゲットを、正の価数コンテキストの中心にあるエンクロージャーに配置します。
      3. ビデオ録画を開始し、対象のマウスを正の原子価コンテキストの隅に置きます。
      4. タイマーを開始し、対象のマウスが10分間自由に探索できるようにします。
      5. ソーシャルターゲットとのインタラクションが>2秒になるたびに、フードポートを介して1つのショ糖食品ペレットを配信します。相互作用は、対象のマウスの鼻がプレキシガラスの筐体の周辺から<2cm離れている期間として定義されます。被験者の頭の角度は、囲いに向かって配置する必要があります。
         注:鼻を突いたり、匂いを嗅いだりすることがありますが、ショ糖食品ペレットの配送には必要ありません。
      6. 10分で対象のマウスを取り外し、録音とタイマーを停止します。
      7. 対象のマウスをホームケージに戻します。
      8. フードポートを介して配送されたショ糖食品ペレットの数と、対象のマウスが消費したペレットの数を記録します。
      9. イーゼルパッドの床を交換し、陽性の状況を消毒し、残りの被験者マウスで陽性価数トレーニングを繰り返します。
   5. ニュートラルトレーニング
      1. 陽性価数トレーニングの少なくとも2時間後に中立トレーニングを開始します。
      2. 中立的なソーシャル ターゲットを、中立的なコンテキストの隅にある囲いの中に配置します。
      3. ビデオ録画を開始し、被写体のマウスをニュートラルコンテキストの隅に置きます。
      4. タイマーを開始し、対象のマウスが10分間自由に探索できるようにします。
      5. 10分で対象のマウスを取り外し、録音とタイマーを停止します。
      6. 対象のマウスをホームケージに戻します。
      7. イーゼルパッドの床を交換し、機器を消毒し、残りの被験者マウスで中立的なトレーニングを繰り返します。
   6. 研修の順序
      1. 1〜3日目:食品ペレットの馴染み化を行います(ステップ2.2.2)。
      2. 4日目:両方のコンテキストの慣れ(ステップ2.2.3)後、最初にポジティブ原子価トレーニング(ステップ2.2.4)を実行し、次に2時間後にニュートラルトレーニング(ステップ2.2.5)を実行します。
      3. 5日目:5日目に逆のトレーニング順序(ステップ2.2.5、次に2.2.4、つまり、ニュートラルトレーニングとそれに続く正価数トレーニングの2時間後)でトレーニングを繰り返します。
3. 社会的差別テスト
   1. 実験室にホワイトノイズと周囲の赤色光を装備します。
   2. 被験者を実験室に輸送し、少なくとも1時間部屋に邪魔されずに慣れることができます。
      注:慣れ期間中、社会的ターゲットが実験室の外に留まることを確認してください。
   3. セッション1では、3部屋の社会的差別ボックスの左右の部屋の反対側の角に2つの空のワイヤーカップを置きます。
      注意: 同一の大きな重量のある物体(ガラス瓶など)をワイヤーカップの上に置いて、対象のマウスがワイヤーカップの上に登らないようにします。
   4. ビデオ録画を開始し、対象のマウスを中央のチャンバーの中央に置き、タイマーを開始します。
      注:可能であれば、被験者マウスに対する実験者の干渉を最小限に抑えるために部屋を出てください。
   5. 8分後、試験室に戻り、被験者のマウスに触れずに、チャンバーのドアを使用して被験者を中央のチャンバーに閉じ込めます。
   6. 空のワイヤーカップを、ソーシャルターゲットを含む同一で異なるカップのセットと交換します。
      注:ソーシャルターゲットは、ネガティブまたはポジティブのソーシャルバレンストレーニングで使用されるものです。
   7. チャンバーのドアを取り外し、セッション2で対象のマウスが探索する間、タイマーを開始します。
   8. 8分後、記録を停止し、対象のマウスとソーシャルターゲットをそれぞれのホームケージに戻します。
   9. 70%エタノールでカップを洗浄し、消毒剤でアリーナを洗浄します。
   10. 残りの被験者マウスで社会的差別テスト(ステップ2.3.3-2.3.9)を繰り返します。
   11. コホートの半分がテストが完了したら、ワイヤーカップの位置を釣り合わせます。
       注:ソーシャルターゲットは、嗅覚の合図が競合しないように、それぞれのワイヤーカップで移動する必要があります。
   12. すべてのワイヤーカップを石鹸、水、消毒剤で洗浄します。3室の社会的差別ボックスを消毒剤で清掃します。

3. 行動分析

1. 訓練
   1. 各ソーシャルターゲットとのインタラクション時間を分析し、インタラクションの試合数をスコアリングします。
      注:分析は手動で採点するか(動物の頭部を囲いの周囲から< cm、頭部角度180°)、または自動プログラムを使用して採点することができます。
   2. ポジティブな社会的価数トレーニング中に消費された食品ペレットの数を記録して、社会的行動の変化が食品報酬を消費する動機の違いによるものではないことを確認します。
2. 社会的差別テスト
   1. 対象のマウスが各カップを調査する時間を測定します。実験者が部屋を出ると、8分間の中断のないテストが始まります。
      注:分析は手動で採点するか(動物の頭部<ワイヤーカップの周囲から2cm離れ、頭部角度180°)、または自動プログラムを使用して採点することができます。
   2. ペアワイズ解析を計算して、テストセッション内の個々の変更をより適切にキャプチャします。さらに、二元配置反復測定ANOVA(セッションとカップの因子を使用)を実行して、探索のセッション間の違いを検出します。

結果

私たちは、C57BL/6マウスのアイデンティティ認識を評価するために、正と負の社会的価数タスクを使用しました(図2)。ショ糖食物ペレットの馴化の1日目(H1、 図2B)と比較して、ほとんどのマウスは、食物馴染の最終日(H3)までに与えられたすべてのペレットを消費しました。トレーニングセッション(T1およびT2)中に、被験者マウスは、異なる状況で別々に相互作用することにより、2つのCD1マウス、ニュートラルマウス(Neu)とポジティブ価数関連マウス(PV)に精通しました。マウスPVとの相互作用後にのみ、対象のマウスに食物報酬を与えた。社会的差別課題では、訓練されたマウスは、中立マウスと比較してPVマウスとの対話を好むことがわかりました(* p < 0.05、対応のあるスチューデント のt検定)。セッション 2 のインタラクション時間とセッション 1 のインタラクションのセッション間比でも、PV マウスへの選好が明らかになりました (* p < 0.05、対応のあるスチューデント の t 検定)。

また、ネガティブな社会的価数タスクを使用して、認識を特定することを検討しました(図2C)。被験者マウスは、Neuマウスと負価随伴マウス(NV)の2つのCD1マウスと、異なる状況で別々に相互作用することにより、それらに親しみを持つようになった。マウスNVとの相互作用セッションの終わり近くで2回の電気ショックが与えられましたが、Neuマウスとの相互作用後にはショックは与えられませんでした。被験者マウスとNeuマウスまたはNVマウスとの間の相互作用時間には、各訓練日における差は認められなかった。しかし、被験者マウスは、社会的差別試験中にNVマウスとの相互作用時間を短縮することがわかりました(* p < 0.05、対応のあるStudentの t検定)。セッション 2 のインタラクション時間とセッション 1 のインタラクションのセッション間比率でも、Neu マウスへの選好が明らかになりました (* p < 0.05、対応のあるスチューデント の t 検定)。

図1:ID認識タスクの装置。 (A)社会的価数検査が陰性の場合の中立価数コンテキスト。白いイーゼルパッドの紙がコンテキストの下部に配置されます。(B)肯定的な社会的価値の文脈。ボックスの中央下部にあるフードポート(矢印)に注意してください。(C)陽性の社会的価数検査のための中立的な価数コンテキスト。(D)食物慣れの文脈。フードデリバリーポートは、 E (破線の円)と F (拡大)に示すように、ボックスの右側に設置されています。(G) ショックボックス。(H)プレキシガラスの筐体。(I)ワイヤーカップ。(J)社会的差別テスト用の3チャンバー社会的差別ボックス。中央のチャンバーに対象のマウスを収容するための取り外し可能なチャンバードアを K (矢印)に示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ID認識タスクの設計と期待される結果。 (A)アイデンティティ認識タスクの正の社会的価数バージョン(上)と負の社会的価数バージョン(下)の概略図。C57BL/6マウスは、中性標的(マウスNeu)および価数関連ソーシャルターゲット(マウスPVまたはNV)と毎日相互作用するように訓練されました。訓練の翌日、被験者のマウスを3チャンバーの装置に入れて、社会的識別テストを行いました。社会的価数が正の場合と負の場合、被験者のマウスは、それぞれ正価数(緑、マウスPV)および負価数マウス(赤、マウスNV)に対して選好と回避を示すことが期待されます。(B)正の社会的価数トレーニング実験からの代表的なデータ。被験者のマウスは、陽性価のマウス(マウスPV)および中性マウス(マウスNeu)と2日間毎日相互作用するように訓練されました。インタラクションの順序は2日目に逆になりました。左:ヒストグラムは、マウスPVを使用した順応(H1-3は順応1-3日目を表す)および訓練(T1-2:訓練1-2日目を表す)中に消費されたショ糖食品ペレットの割合を示しています。右:ヒストグラムは、社会的識別テスト中に陽性価数を持つマウスPVとの社会的相互作用時間の増加を示しています。セッション間比(セッション2インタラクション時間/セッション1インタラクション時間)は、陽性価マウスPVの選好性を明らかにした。* p < 0.05、対応のあるスチューデントの t検定。(C)ネガティブな社会的価数トレーニング実験からの代表的なデータ。被験者マウスは、負価マウス(マウスNV)および中性マウス(マウスNeu)と3日間毎日相互作用するように訓練されました。インタラクションの順序は毎日逆転しました。左:ヒストグラムは、異なるトレーニング日におけるマウスNeuとNVとの相互作用時間を示しています。右:ヒストグラムは、社会的識別テスト中に、負の価数を持つマウスNVとの社会的相互作用時間の減少を示しています。セッション間比は、負の原子価を持つマウスNVの回避を明らかにしました。* p < 0.05、対応のあるスチューデントの t検定。略語: Neu = neutral;PV = 正の原子価数;NV = 負の原子価;H =慣れ;T = トレーニング。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ID認識パラダイムは、最小限の専門機器と1週間以内のトレーニングセッションがほとんどない研究所で簡単に実装できるように設計されています。利用可能なリソースと望ましい研究課題に応じて、代替の価数経験を利用することができます。例えば、攻撃的な社会的標的からの攻撃に続く負価のアイデンティティ認識は、ゴールデンハムスターで初めて記載され、モデル^6,12のマウスに適応した。

価数化されたアイデンティティ認識パラダイムは、社会的記憶の分野でより広い応用が可能だ。これらの課題は、社会的記憶や社会的価数メカニズムをさらに研究するために使用できるだけでなく、社会的認知障害を持つことが知られている疾患モデルの研究にも役立ちます。統合失調症13,14,15や自閉症スペクトラム障害16,17,18などの障害における社会的行動障害の根底には、アイデンティティ認識の障害があり、自閉症の成人の3分の1が個人のアイデンティティ認識¹⁹に直面するのが困難であると推定されています。例えば、Shank3ノックアウトマウスおよびDf(16)A^+/-は、社会的認知障害を示すことが知られている自閉症スペクトラム障害および統合失調症マウスモデルである20,21,22。私たちの新しいパラダイムは、社会的記憶の欠損を再現し、疾患モデルの特性評価や、社会的行動の欠損を改善する操作や治療の特定に採用されるかもしれません。無生物は、社会的認識¹²と比較して、物体を支えるメカニズムをさらに解析するために、社会的ターゲットの置き換えとして研究することもできる。

図1で用いたソーシャルターゲットは同性CD1系統マウスですが、同系統C57BL/6ターゲットを用いて同等の価数認識を達成しています。したがって、私たちは、脳疾患の動物モデルにおける社会的価処理、社会的アイデンティティ、およびこれらの社会的認知機能の欠損のさらなる研究に使用できる、簡単に採用できる方法を開発しました。

アイデンティティ認識パラダイムは、特定の個人の記憶に注目します。実験を設計する際には、トレーニングセッションとテストセッションがまったく異なること、および一定の唯一の手がかりが社会的ターゲットのアイデンティティであることを確認するように注意する必要があります。たとえば、トレーニングとテストが実施される部屋、ソーシャルターゲットを保持する囲い、トレーニングとテストのコンテキストに関連付けられた手がかりはすべて異なる必要があります。

4つのワイヤーカップは互いに同一である必要がありますが、プレキシガラスの筐体とはできるだけ異なります。ワイヤーカップとエンクロージャーは、素材(プレキシガラスと金属など)、形状(長方形と円形など)、色(透明ゴールドとローズゴールドなど)の点で異なる必要があります。これは、テスト中に探索的行動を通知する唯一の手がかりがソーシャルターゲットのアイデンティティであることを確認するために行われます。

コンテクストアフォーマチュエーションは、トレーニングの1日目に行われます。これは、被験者のマウスがすでに知っているコンテキストではなく、トレーニング中にソーシャルターゲットの探索を促進するために行われます。さらに、原子価トレーニングセッションとニュートラルトレーニングセッションの間には、少なくとも2時間の待ち時間が推奨されます。被験者マウスにトレーニングセッション間の時間を提供することは、時間的により近く割り当てられた経験がリンクされる可能性が高くなるため、一般化を減らすと考えられています²³。これと同じ理由で、トレーニングは繰り返されますが、その後の日には順番に釣り合います。この繰り返しは、経験とそれぞれの社会的目標とのさらなる関連性を促進すると考えられています。理想的には、トレーニングセッション間の時間が長くなると、被験者のマウスは、社会的目標をそれぞれの価数の経験に関連付けることをさらに学ぶことができます。実用的な目的のために、待機期間は2時間であると決定されました。これは、8〜12匹のマウスのコホートで中立トレーニングセッションと価数トレーニングセッションの両方を1日で行うことを可能にしたためです。例えば、12匹のマウスの訓練には約2時間かかる場合があり、その時点で最初に訓練された対象のマウスは、次の訓練セッションを開始する準備ができていることになる。もちろん、待機期間を長くすると、被験者マウスの性能が向上するかもしれませんが、実験者にとってはより時間がかかります。

被験者のマウスと社会的目標は、輸送ストレスの影響を最小限に抑えるために、行動訓練の開始の少なくとも7日前に動物施設に到着する必要があります。カジェーメートからの嗅覚の手がかりがアイデンティティ認識を損なう可能性があるため、ソーシャルターゲットはシングルハウスにする必要があります。同じ2つのソーシャルターゲットを、最大12匹の被験者マウスのコホートに使用できます。重要なことは、被験者マウス間の各洗浄およびセットアップ期間中に、ソーシャルターゲットをホームケージに戻す必要があります。囲いの中での長期の監禁は彼らの行動を変え、ひいては被験者のマウスの相互作用の決定に影響を与える可能性があるため、社会的ターゲットを彼らの家檻に戻すことが重要です。

対象マウスおよび社会的標的は、同じ系統または異なる系統の同種種であり得る。同じ系統のソーシャルターゲットを使用する場合、それらが対象のマウスと同じ同腹児ではないことが重要であり、ソーシャルターゲットは互いに馴染みがないことが必要です。これは、異なる動物供給者から対象マウスおよび社会的標的を注文するか、またはわずかに異なる年齢の動物(すなわち、8週齢の対象マウスおよび7週齢の社会的標的)を注文することによって保証することができる。耳のタグ付け手順が必要な場合は、行動トレーニングの開始の少なくとも24時間前に実施する必要があります。これは、被験者のマウスの行動に対する外部ストレッサーの影響を最小限に抑えるためです。すべての行動トレーニングとテストでは、一度に1つの被験者マウスで作業することをお勧めします。複数の被験者マウスを同時に訓練し、試験することで時間を節約できますが、実験室内の嗅覚の手がかりも増加し、アイデンティティ認識の符号化や想起に影響を与える可能性があります。そのため、8〜12匹の被験者マウスのコホートをお勧めします。ポジティブな社会的価数実験のためには、新しい食物消費を思いとどまらせる可能性のある取り扱いストレスを最小限に抑えるために、トレーニング前に動物を毎日扱うことが推奨されます。また、慣れプロセスを容易にするために、慣れの3日前にマウスごとに2〜3個のショ糖食品ペレットをホームケージに入れることをお勧めします。

提示されたデータは手動で採点されましたが、行動分析のためのユーザーフレンドリーで自動化されたオプションが存在し、トレーニングおよびテストビデオでの社会的相互作用のより効率的なスコアリングに適用できる可能性があります。例えば、DeepLabCutは、動物の位置のマーカーレス注釈のためにユーザ訓練されたニューラルネットワークを採用するソフトウェアであり、調査行動²⁴を満たすフレームの正確な識別のために最適化されてもよい。

さらなる制御実験を用いて、成功したアイデンティティ認識プロトコルが達成されたことを確認することができる¹²。トレーニングの順序を逆にして、引き続き ID 認識を引き出し、結果が価数トレーニングと中立トレーニングの順序によるものではないことを確認する必要があります。訓練もまた、記載された通りに実施されてもよいが、試験は、中立的な標的と新規な社会的標的を用いて行うことができ、そこでは、新規な標的との相互作用の増加は、対象のマウスが中立的な標的に対する社会的記憶を有し、それが馴染み深いことを認識していることを示唆するであろう。同様に、2匹の新規被験者マウスを用いた試験を行い、回避行動または接近行動が、実際には、それぞれ否定的に価数の多い社会的標的および正に原子価を持つ社会的標的に特異的であることを確認することができる。同じ被験者マウスが陰性と陽性の両方の社会的価数の訓練を受けることができるかどうかは現在検証されていませんが、実験者が複数の社会的標的系統または訓練コンテキストにアクセスできる場合、可能と考えています。正と負の原子価実験に同じソーシャルターゲットの系統を使用すると、特定の原子価と菌株との関連が複雑になる可能性があります。可能であれば、異なるソーシャルターゲット株を使用することで、探求を促し、ポジティブな経験とネガティブな経験の間の一般化を避けることができるかもしれません。同様に、同じトレーニングコンテキストを再利用すると、反対に価数の多いエクスペリエンス間の一般化が進み、トレーニングに異なるコンテキストを使用することで最小限に抑えられます。実験のタイムラインが許せば、正と負の原子価実験を数週間間隔で分けることも推奨されます。

ID認識プロトコルの確立が困難な場合は、私たちが直面している一般的な問題の解決策を提案します。グループ飼育対象のマウスは、通常のケージメイト相互作用²⁵の後に社会的標的に関連する原子価が絶滅するため、絶滅訓練として機能する可能性があるが、社会的孤立が社会的記憶を損ない、社会的行動を変化させるため、^26,27が必要である。実際、単一のハウジングでは、オスのマウスではアイデンティティ認識が引き出されないことがわかりました。ただし、動物が定位固定手術から回復している場合、または剥離に敏感な可能性のある頭蓋内インプラントがある場合は、単一のハウジングが必要になることがあります。このような場合、マウスを穴あきパーティションで区切られた大きなケージにペアで収容することに成功し、この条件でアイデンティティ認識を再現しました¹²。

正の社会的原子価課題では、マウスが新規のショ糖ペレットを摂取することをためらうのが一般的です。この問題を解決するには、餌不足の時間を増やすか、慣れセッションの2〜3日前にマウスを自宅のケージに数個のペレットを入れて、マウスにペレットを慣れさせることが役立ちます。マウスの大多数が食物ペレットを消費しない状況では、慣れのセッション数を増やすことも役立つ場合があります。私たちは、雄のマウスは一般的に雌のマウスよりも食物ペレットの馴染中に食べる量が少ないことに気づきましたが、それは正の原子価の社会的目標を認識する彼らの能力に影響を与えません。

最後に、ID認識タスクのパラメータを変更して、タスクの難易度を軽減または向上させることができます。例えば、生物学的要因がアイデンティティ認識に及ぼす微妙な影響を明らかにするために、学習時間や訓練セッションの数を減らして、タスクの難易度を上げることができます。

このプロトコルで提示した行動課題は、シンプルで簡単にセットアップでき、アイデンティティ認識を研究するためのオスとメスのマウスに適応できます。これらの課題において、食欲刺激または嫌悪刺激のいずれかを柔軟に使用することで、アイデンティティ認識における社会的価数の役割を検討することも可能になります。これらの課題は、健康なマウスにおけるアイデンティティ認識の生物学的メカニズムや、社会的障害を示す疾患関連マウスモデルにおけるアイデンティティ認識の欠損を研究するために有用です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
エタノール
黒壁ケージ(24 cm x 36 cm x 19.5 cm)		中立的な文脈、正の社会的原子価実験
C57BL/6マウス	チャールズリバー、ジャクソン研究所		ジャクソン研究所からのソーシャルターゲット
ダストレス精密ペレット	BioServ	F05301	20 mg、チョコレートフレーバー
電気テープ
ガラスびん (2)
過酸化水素系消毒剤
プラスチックまたは段ボール			エンクロージャーフロア用の非導電性材料
長方形プレキシガラスエンクロージャー(2、10 cm x 5 cm x 30 cm)		同一
のショックボックス(三角形、各辺の長さ= 46 cm、高さ= 29 cm)
サイレントタイマー
単一出力 スクランブル アニマルショッカー	ラファイエット インストゥルメント	HSCK100AP
3チャンバーボックス(81 cm x 23 cm x 23 cm)、左右のチャンバーに接続する中央のチャンバーに開口部があります	社会的差別試験
透明なケージ(24 cm x 36 cm x 19.5 cm)		負の社会的価数
透明ケージ(26 cm x 47 cm x 21 cm)			食習慣化(正の社会的価数)
ウェブカメラ	Logitech	C920x
体重計
白いイーゼルパッド用紙			ニュートラルコンテキストのフロア
ホワイトノイズ発生器			60 dB
白いプラスチック皿
白い壁のケージ(24 cm x 36 cm x 19.5 cm)、直径1 cmのプラスチックチューブをフードポートとして	正の社会的価数コンテキスト
ワイヤーカップ(円形、4つ、8 cm x 8 cm x 10 cm)