脱細胞化マウス肺と初代ヒト内皮細胞を用いた生体工学的肺移植

サマリー

この論文では、脱細胞化および再細胞化法を使用してバイオエンジニアリングされたマウス肺を作成する方法を説明します。また、その後の同所性肺移植についても詳しく説明しています。

要約

肺移植は、特発性肺線維症などの末期肺疾患の患者にとって重要な治療法ですが、ドナー不足や移植後の合併症などの課題は依然として残っています。患者特異的な細胞を脱細胞化した動物の足場に統合するバイオエンジニアリング肺は、有望な代替手段を提供します。動物モデルでバイオエンジニアリングされた肺の使用が進んでいるにもかかわらず、機能と構造は未成熟のままです。このプロトコルは、臓器バイオエンジニアリングにおける重大な障壁である、費用対効果の高い実験プラットフォームの必要性に対処します。ラットやブタのような大型動物ではなく、マウスモデルを使用することで、研究者は各実験に必要なリソースを大幅に削減し、研究の進行を加速させることができます。

このプロトコルは、マウス心肺ブロックとヒト初代細胞を用いた肺バイオエンジニアリングの詳細な手順を概説しており、マウス心肺ブロックの単離戦略、脱細胞化、バイオリアクターのセットアップ、灌流ベースの臓器培養、バイオエンジニアリングされた肺の同所性移植に焦点を当てています。このマウススケールのプラットフォームは、実験コストを削減するだけでなく、再細胞化のための細胞の種類と数の最適化、組織学的および分子的方法を使用したさまざまな細胞タイプの試験、および移植後の血流を確保するための実行可能なフレームワークも提供します。この方法は、三次元培養条件での細胞相互作用、細胞とマトリックスの相互作用、 ex vivo がんモデリングの研究など、幅広い応用の可能性を秘めており、臓器バイオエンジニアリングの分野を前進させます。

概要

肺移植は、特発性肺線維症などの末期肺疾患¹の患者にとって決定的な治療法であり、薬物治療では呼吸機能の低下を止める効果がありません。毎年、より多くの適格な患者が待機リストに追加されます。しかし、死亡したドナーからの臓器提供の数は、待機患者数の増加に遅れをとっています^2,3。肺移植を受けた後でも、移植された肺の機能を低下させる問題が数多くあり、原発性臓器機能障害、反応性同種症候群、感染症などがあり、肺移植を受けた患者の5年生存率が大幅に低下します⁴。

臓器移植における現在の問題に対抗するためには、限界ドナーの利用⁵、 ex vivo 肺灌流システム⁶によるドナー肺の回復6、遺伝子編集^{されたブタ}7を用いた異種移植など、いくつかの選択肢が存在する。これらの選択肢は、ドナー臓器のプールを拡大することができます。しかし、ドナー臓器の希少性、免疫原性、および機能的不均一性に完全に対処できるものはありません。

現実とはほど遠いですが、患者固有の細胞が脱細胞化された動物の臓器足場に統合される生物工学的な人工臓器は、固形臓器移植の魅力的な潜在的な供給源です⁸。2010年以降、バイオエンジニアリングされた肺の潜在的な有用性を実証したいくつかの先駆的な研究が報告されています^9,10。これらの研究では、ラットまたはブタの肺を界面活性剤で脱細胞化し、気管または肺血管系から動物またはヒトの細胞を注入して灌流ベースのバイオリアクターで肺組織を再生し、それらの一部を動物の胸腔に同所的に移植した11,12,13,14,15.しかし、バイオエンジニアリングされた肺の機能と構造は時期尚早であり、これはおそらくバイオリアクターで培養される細胞の数が不十分であったか、細胞間接合部があまり統合されていなかったためである。

臓器バイオエンジニアリングの研究を進める上での障害の一つは、小規模な実験プラットフォームがないことです。この分野ではラットやブタが一般的に使用される動物ですが、肺¹⁶あたり>10⁸個の肺細胞が必要であり、これは学術研究室にとって非常に高価です。マウスが臓器バイオエンジニアリング研究に利用できるようになれば、各実験のコストを大幅に削減し、研究プログラムをスピードアップすることができます。マウスとヒトの肺の間には解剖学的な違いが存在するが¹⁷、肺の基本的な構造は哺乳類間で類似している¹⁸。そのため、マウススケールの実験結果は、体の大きさに応じて数値を掛けるだけで、より大きな動物にも応用できます。

このプロトコルは、マウスの心肺ブロックとヒト初代細胞¹⁹を使用した肺バイオエンジニアリングの詳細な実験手順を説明することを目的としています。この研究には、以前に報告され、広く使用されているマウス肺脱細胞化プロトコルを採用しました 20,21,22。肺バイオエンジニアリングの困難な部分は、脱細胞化された毛細血管系²⁰の再細胞化です。したがって、このプロトコルでは、ヒト臍帯静脈内皮細胞が使用されます。

プロトコル

すべての実験は、東北大学が発行した「東北大学動物実験等に関する規則(第15^版)」23号に準じたものである。本研究は、東北大学動物実験委員会(#2020AcA-041-01)によって承認されました。

1. 脱細胞化のための材料の準備

1. 脱細胞化溶液の調製(1 Lオートクレーブ可能なガラス瓶に1,000 mLフォーマット)
   1. 滅菌脱イオン水(DI):1 Lのオートクレーブ可能なガラス瓶に1,000 mLの蒸留水またはDI水を加えます。121°Cで20分間オートクレーブします。
   2. Triton X-100:1 Lフォーマットのオートクレーブ可能なガラス瓶に、1 mLのTriton X-100を1 mLの滅菌DI水に加えます。(オプション)10 mLのペニシリンとストレプトマイシン溶液(最終濃度、500 units/mL of penicillin、500 μg/mL of streptomycin)を加えます。.
      注:オートクレーブはしないでください。
   3. デオキシコール酸ナトリウム:1 Lフォーマットのオートクレーブ可能なガラス瓶に入った1,000 mLの滅菌DI水に20 gのデオキシコール酸ナトリウム粉末を加えます。キャップを閉め、ボトルを裏返して粉末を可溶化します。(オプション)ペニシリンとストレプトマイシン溶液10mLを加えます。.
      注:オートクレーブはしないでください。
   4. 1 M NaCl:1 Lフォーマットのオートクレーブ可能なガラス瓶に、1,000 mLの蒸留水または単次元水に58.44 gのNaClを加えます。121°Cで20分間オートクレーブします。
   5. DNase Iストック溶液:培地Aで10 mg/mLの濃度で希釈します。
      1. 培地A:5 mM CaCl₂ (9 mLの滅菌脱イオン水に5 mgのCaCl₂ )を調製し、滅菌脱イオン水で1:10に希釈します。
   6. DNase Iワーキング溶液:10 mLの培地Bに33 μLのDNase Iストック溶液を加えます。
      1. ミディアムB:10xミウムB(100 mLの滅菌脱イオン水に155 mgのMgSO₄ + 220 mgのCaCl₂ )を調製し、滅菌脱イオン水で1:10に希釈します。
2. 肺動脈(PA)と気管のカテーテルの準備(滅菌手順)
   1. PAカテーテル(ラット頸静脈用カテーテル)を約15mmの長さに切断します。
   2. カラーをカテーテルの端に移動します。
   3. PAカテーテルにカテーテルコネクタを挿入し、インジェクターに取り付けます。準備されたPAカテーテルを 図1Aに示します。
   4. PAカテーテルは、使用するまで70%エタノールで保管してください。
   5. 20Gの静脈内カテーテルを約15mmの長さで切断します。気管カテーテルに用いられます。
3. 心肺ブロックを採取するためのマウス手術
   1. オスのマウス(C57BL/6、重量>28g)を二酸化炭素またはイソフルランの過剰摂取で安楽死させます。
   2. マウスを手術台の上で仰臥位に置き、手足を固定します。胸部と腹部の表面に70%エタノールをスプレーして滅菌します。
   3. 正中線の腹腔を首までステンレスハサミで開き、ハサミで胸骨を裂きます。胸壁から横隔膜を切除し、腹側胸壁を切開して胸腔を完全に露出させ、胸腺を切除します。下大静脈と右上大静脈を4-0シルクで結紮して、ステップ1.3.5でPBSの逆流を防ぎ、それによって肺血管系の血液の洗い流しを促進します。
   4. 腹部大動脈をステンレス製のハサミで切ってドレナージします。腹部大動脈が識別できない場合は、下大静脈と腹部大動脈を完全に切断します。
   5. 右心室壁に 27 G の針を刺した 5 mL の滅菌シリンジを使用して、右心室から 3 mL の滅菌 PBS を注入します。
   6. デュモン鉗子を使用して、メインPAを4-0シルクでループします。
      注:メインPAと上行大動脈は一緒にループできます。
   7. PAバルブの下の2mmの窓を開け、スプリングハサミで右心室壁を切断します。
   8. PAカテーテルを窓から挿入し、前にループした4-0シルクを固定します(図1B)。
      注意: この手順中は、PAの壁を損傷する可能性があるため、PAに触れないでください。主PAと上行大動脈は結紮して固定することができます。
   9. 5mLの滅菌シリンジを使用して、PAカテーテルから2mLのPBSをゆっくりと注入します。PBSが注入されている間、両方の肺がわずかに拡張していることを確認してください。
   10. 気管カテーテルで気管をカニューレにし、4-0シルク縫合糸で所定の位置に結びます(図1C)。
   11. 空の5mL滅菌シリンジを使用して、気管カテーテルから2mLの空気をゆっくりと注入し、10秒間保持します。肺から空気が漏れていないことを確認してください。
   12. 心臓と肺をまとめ て取り除きます。デュモン鉗子と気管カテーテルを内側にして気管をつかみ、頸部食道を切断し、椎骨から解剖します。両側の鎖骨下静脈と動脈を切断します。最後に、横隔膜のレベルで食道と大静脈下を切断します。
       注意: 器具で肺の表面に触れないでください。少し触れると空気漏れの原因になります。
4. マウス肺の脱細胞化(3日間の手順)
   注:セクション1.4のすべての手順は、清潔なバイオセーフティキャビネットで実行する必要があります。
   1. 1日目
      1. 切除した心肺ブロックを直径 10 cm のプラスチック製シャーレに移し、心肺ブロックを滅菌 DI 水で 4 °C で 1 時間インキュベートします。
      2. 気管カテーテルから2mLの滅菌DI水を3倍注入し、PAカテーテルから5mLの滅菌シリンジで2mLの滅菌水を注入します。各注射後に一時停止して、肺が反動するときに液体が出てくるのを待ちます(図1C)。
         注:約0.5mL / sで水を注入します。
      3. 0.1% Triton X-100溶液を2 mLを気管カテーテルに、2 mLをPAカテーテルに注入します。
      4. 心肺ブロックをペトリ皿に入れ、Triton X-100溶液で4°Cで一晩静的にインキュベートします。
   2. 2日目
      1. ステップ1.4.1.2で説明されているように、滅菌DI水でTriton X-100溶液を肺から取り出します。.
      2. 2 mLの2%デオキシコール酸ナトリウム溶液を気管カテーテルに注入し、2 mLをPAカテーテルに注入します。.デオキシコール酸溶液中で4°Cで24時間インキュベートします。
   3. 3日目
      1. ステップ1.4.1.2で説明されているように、滅菌DI水でデオキシコール酸ナトリウム溶液を肺から取り出します。.
      2. 2 mLの1 M NaCl溶液を気管カテーテルに注入し、2 mLをPAカテーテルに注入します。NaCl溶液中でRTで1時間インキュベートします。
      3. ステップ1.4.1.2で説明されているように、滅菌DI水でNaCl溶液から取り出します。
      4. 2 mLのDNAse Iワーキング溶液を気管カテーテルに注入し、2 mLをPAカテーテルに注入します。DNaseワーキング溶液中でRTで1時間インキュベートします。
      5. ステップ1.4.1.2で説明されているように、DNase溶液を肺から除去しますが、滅菌PBSを使用します。脱細胞化処置後の肺が白く、端が透明であることを確認します。
         注:脱細胞化手順が進行するにつれて、肺はより脆弱になります。心肺ブロックは常に注意して取り扱い、肺の表面に触れないようにしてください。脱細胞化後、心肺ブロックは4°CでPBS/抗生物質に最大3週間保存できます。

2. ヒト初代細胞の培養

1. 内皮細胞増殖培地-2(EGM2)とウシ胎児血清(最終濃度、2%)、ヒドロコルチゾン(最終濃度、0.2 μg/mL)、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子(最終濃度、4 ng/mL)、血管内皮増殖因子(2 ng/mL)、R3-インスリン様成長因子-1(最終濃度、5 ng/mL)、アスコルビン酸(最終濃度、75 μg/mL)、ヒト上皮成長因子(最終濃度、 10 ng/mL)、ゲンタマイシン/アンホテリシン-1000(最終濃度、ゲンタマイシン:30 μg/mL、アンホテリシン:15 ng/mL)、およびヘパリン(最終濃度、1 ng/mL)です。
2. 凍結バイアル中の2 × 10⁶ ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を37°Cの水浴中で解凍します。
3. 15 mLのコニカルチューブで細胞をEGM2と混合し、500 × g で5分間遠心分離します。
4. 細胞をカウントし、適切な細胞密度(2.0 x 10⁴ 細胞/cm² を推奨)で継代培養します。6ウェルフォーマットのプレートから始めて、T75フラスコに移します。
5. 必要な数の細胞が得られるまで細胞を継代します。
   注: HUVEC を使用して完全な肺血管カバレッジを得るには、3 × 10⁷ HUVEC が必要になります¹⁹。

3. バイオリアクターのセットアップと灌流臓器の培養

1. 臓器室と細胞リザーバーの調製
   1. 図2Aに示すように、コルク穴あけ器を使用してシリコンストッパーに穴を開けます。穴のサイズは 5 mm (i、ii、iii) と 7 mm (iv と v) です。図 2A の各穴番号 (i-v) は、図 2B の穴番号に対応しています。
   2. 図2Bに示すように、ポンプチューブをシリコンストッパーに挿入します。
   3. コルクボーラーを使用して、オープントップスクリューキャップのシリコンセプタムに5mmの穴を開けます。L/S 14 プラチナ硬化チューブを穴に挿入します (図 2B、C)。
   4. シリコンストッパーとチューブ、ガラスキャニスター、GL-45スクリューキャップとチューブ、250 mLオートクレーブ可能なガラスボトル、ルアーフィッティング付きL/S 14チューブ( 図3AのチューブBとチューブC)など、上記の材料を121°Cで20分間オートクレーブ処理します。 適切なルアーフィッティングを選択して、チューブBとCがループを形成するようにします。
      注:ガラスキャニスターは臓器室に使用され、250mLのガラス瓶は細胞リザーバーに使用されます。
2. 灌流ベースのバイオリアクター回路の組み立て
   注意: 次の手順は、クリーンベンチで実行する必要があります。
   1. グラスキャニスターに70mLの培地を加え、シリコンストッパーをグラスキャニスターの上に置きます。
   2. 図 3A に示すように、シリコン ストッパー、ガラス キャニスター、チューブ付き GL-45 スクリュー キャップ、250 mL オートクレーブ可能なガラス ボトル、および L/S 14 チューブとルアー フィッティングを組み立てます。GL-45スクリューキャップのシリコンセプタムに20Gの針を挿入します。
   3. ストップコック i) および iii) に接続された 10 mL シリンジで、チューブ A、B、C に培地を充填します (1 m のチューブを充填するには、~3 ~ 5 mL の培地が必要です)。10 mLシリンジを三元ストップコックに通して培地の注入と回収を繰り返し、チューブ内に気泡がないことを確認します。
   4. 脱細胞化心肺ブロックのPAカテーテルを、チューブCに接続されたルアーフィッティングを介して取り付けます。
   5. EGM2でHUVECを0.5-1×10⁶ 細胞/mLの密度で回収し、再懸濁します。ステップ2.5の細胞懸濁液を細胞リザーバーに加えます。
      注:細胞懸濁液は、ステップ3.2.4と3.2.5の間に調製することが好ましい。セルリザーバーに攪拌バーを入れます。
3. 内皮細胞の重力駆動型注入
   1. HUVECを含むセルリザーバーをマグネチックスターラーの上に置きます。細胞リザーバーの底が臓器室から30cm上にあることを確認します(図2D および 図3A)。
   2. マグネチックスターラーを約120rpmの速度でオンにします。
   3. ストップコックi)およびii)を開き、細胞懸濁液をチューブA、チューブC、およびPAカテーテルを介して脱細胞化した足場に注入できるようにします。
      注:細胞密度が1 × 10⁶細胞/mLの細胞密度で3個×10 7^{個の細胞を}注入する場合、細胞懸濁液の容量は30 mLである必要があります。一般的な注入速度は1〜2mL /分です。
   4. 細胞懸濁液を完全に注入した後、チューブAをストップコックii)から取り外します。
      注:このステップでは、細胞数カウントを実行して、脱細胞化した足場の細胞保持率を測定できます。典型的な細胞保持率は、注入された細胞の数に関係なく80〜90%である¹⁹。
      脱細胞化した肺足場の品質は、細胞の保持率を厳密に決定します。脱細胞化した肺からの漏出(例えば、メインPAや肺表面からの漏出)は、細胞保持率の低下につながります。灌流ベースのバイオリアクターのストップコックの1つに接続された滅菌シリンジを使用して2〜3 mLの培養培地を注入することにより、脱細胞化した肺からの明らかな漏出がないことを確認し、培地が注入されると脱細胞化した肺がわずかに拡張することを確認します。
4. 灌流臓器培養
   1. 臓器室をCO₂ インキュベーターに入れます。
   2. チューブBを拍動性ポンプに接続されたポンプヘッドに固定します。
   3. CO₂ インキュベーターのガラスドアを閉じます。チューブがガラスドアとゴム製シールの間に正しく配置されていることを確認してください(図3B)。
   4. 脱細胞化した足場を37°Cで3時間インキュベートし、注入した内皮細胞を足場に定着させます。
      注意: ステップ3.4.1と3.4.4の間で、拍動ポンプが常にオフになっていることを確認してください。
   5. ポンプを 6 rpm の速度で始動すると、L/S 14 チューブを使用して 2 mL/分の培地灌流が得られます。メディア灌流により、脱細胞化した肺がわずかに拡張される様子をご覧ください。
   6. インキュベーターのドアを閉じます(図3C)。
   7. Stopcock iii)を使用してメディア交換を行います。メディアの半分は2〜3日ごとに交換します。
      1. ポンプ駆動を停止し、50 mLの滅菌シリンジをストップコックiii)に取り付け、50 mLの培地をチャンバーから引き出します。
      2. 別の50 mL滅菌シリンジに50 mLの予熱培地を満たし、活栓iii)を介して培地をチャンバーに移します。ストップコックを適切に切り替えてから、拍動ポンプを始動します。
   8. 再細胞化した心肺ブロックを、少なくとも2日間の灌流臓器培養後に採取します。
      注:私たちの研究では、2日間の灌流培養は、3×10⁷ HUVECを使用して脱細胞化肺足場を均質に血行再建するのに十分でした。使用するHUVECが3×10⁷ 未満の場合、再細胞化の効率を向上させるために、より長いインキュベーションが必要になる可能性があります。

4. バイオエンジニアリング肺の同所性移植

1. 薬物調製
   1. ミダゾラム (最終濃度、4 mg/kg)、メデトミジン (最終濃度、0.75 mg/kg)、酒石酸ブトルファノール (最終濃度、5 mg/kg) を臨床グレードの生理食塩水と混合して、MMB 配合麻酔薬を調製します。
   2. ヘパリン溶液を臨床グレードの生理食塩水(最終濃度、1000 U/mL)と混合して調製します。
   3. セファゾリンナトリウムを臨床グレードの生理食塩水(1回分、30 mg / kg)と混合して調製します。.
2. 手術
   1. 袖口の準備
      1. 3種類の血管カテーテルを細かいサンドペーパーで軽くこすり、血管がカフをかけられたままになるようにします。
      2. 長さ1mmの20Gテフロン血管カテーテルから#11メスを使用して気管支カフを準備します。血管カテーテルを切断する前に、#11メスの背面を使用して血管カテーテルにくぼみを作り、10-0ナイロンを結びます。
      3. 長さ 0.8 mm の 22 G テフロン血管カテーテルから肺静脈 (PV) カフを準備し、長さ 0.6 mm の 24 G テフロン血管カテーテルから PA カフを準備します。
         注:この準備は、実験日の前に行うことができます。
   2. バイオエンジニアリングされた肺へのカフの取り付け
      1. 冷たい生理食塩水で湿らせた滅菌ガーゼの上に心肺ブロックを置き、その下に別の乾いたきれいなガーゼを置き、きれいな氷で満たされた発泡スチロールの箱にシャーレを入れます。
         注意: 乾いたガーゼを置くと、心肺ブロックが誤って凍結するのを防ぎます。
      2. 動脈瘤クリップを取り付けて、気管とガーゼを固定します(図4A)。心臓にガーゼの小片を置き、右肺も覆います。左肺に別のガーゼを置きます。この収縮を湿らせたガーゼで調整して、左の門をできるだけはっきりと露出させます。
      3. 好みに応じて、まっすぐまたは角度のあるマイクロ鉗子を使用して、肺門構造を互いに慎重に解剖します(図4B)。迷走神経に沿って肺靭帯から解剖を開始します。PVの下の内臓胸膜を切開し、下行する大動脈と迷走神経を一緒に左肺門の後ろから脳側に移動します。
      4. 左メインPAを肺幹から左肺の縁まで解剖します(図4C)。次に、PAを肺幹のレベルで分割して、適切な長さを取得します。
      5. 左心房の左側から左肺の非常に端まで左PVを解剖します(図4D)。左のPVを左のアトリウムのレベルで分割して、適切な長さにします。
      6. 安定化クランプを使用してPAカフをPAのすぐ上に吊り下げ、PAをカフの内側に挿入します(図4E)。PAを袖口の上に折ります)、内皮表面を露出させます。袖口の周りを10-0ナイロンタイで固定します(図4F)。カフをPVに同じように配置します(図4G、H)。
      7. 左気管支をカリーナのレベルで分割します。カフを気管支に同じ方法で配置します(図4I)。
   3. 受信者マウスの手順
      1. MMB i.p.と27Gの針の混合物でレシピエントマウスに麻酔をかけ、顕微鏡の下に20Gのポリウレタン血管カテーテルを挿入して挿管します。レシピエントマウスを温度調整可能な電気ウォーマーの右側褥位に置き、血管カテーテルを呼吸器に接続します。.人工呼吸器の設定を次のように設定します: 酸素2 L / min、呼吸数120 bpm、一回換気量0.5mL。胸壁を70%エタノールで滅菌し、セファゾリン混合物s.c.を注入します。
      2. ハサミで皮膚を切開します。焼灼器で皮下組織と筋肉を切断します。3^番目の 肋間スペースから胸を開き、胸部リトラクターを配置します。
         注:開胸術は移植に十分な大きさである必要がありますが、大量の出血につながる可能性のある内乳動脈を傷つけないでください。
      3. 綿棒と大きなスプリングハサミで肺靭帯を解剖します。レシピエントの左肺に湾曲した動脈クレンザーを装着して、肺を簡単に引っ込めます。角度のついたマイクロ鉗子を使用して、左肺門の周りの縦隔胸膜を解剖します。
         注:胸膜の解剖の基礎は、人間の解剖学的肺切除に似ています。
      4. 縦隔から左肺の非常に端まで湾曲したマイクロ鉗子を使用して、気管支からPAを解剖します(図5A)。同様の方法でPVから気管支を解剖します。
         注:前の操作で胸膜を解剖すると、解剖が簡単に行えます(ステップ4.2.3.3)。
      5. PAの基部に10-0シルクのスリップノットを配置して閉塞します(図5B)。PVと気管支の基部にスリムな角度の動脈瘤クリップを配置します(図5C)。
      6. 気管支、PA、PVの周りに10-0ナイロンをループし、次の手順で袖口を固定するために緩めたままにします。
      7. マイクロスプリングハサミを使用して、レシピエントの左肺の端でレシピエントのPA、気管支、およびPVを切開します(図5D)。PAとPVをまっすぐなマイクロ鉗子を使用して穏やかに拡張します。1 mLシリンジと24 G血管硬化剤を使用して、生理食塩水でPAおよびPV中の血液を除去します。
         注:PA、気管支、PVの切開は、約3分の1のところにあります。ストレートマイクロ鉗子は優しく、拡張に適しています。
      8. 湿らせたガーゼで覆われたバイオエンジニアリングされた肺を、レシピエントの左肺(図5E)の上に、レシピエントの縦隔にできるだけ近づけて配置します。
      9. ドナーPAカフをレシピエントPAに挿入します(図5F)。
         注:ドナーPAにはいくつかのストレッチがあります。PA切開サイズが適切であれば、ドナーのカフが外れる可能性が低くなります。また、バイオエンジニアリングされた肺を縦隔に近づけると、ドナーのカフが外れるのを防ぐことができます。
      10. 10-0ナイロンタイで袖口の周りを固定します(図5G)。同様に、ドナー気管支(図5H)とPVカフ(図5I、J)を挿入して固定します。
      11. スリムアングルの動脈瘤クリップを取り外します(図5L)。血液がPVカフを超えて逆流しているのを観察し、PAのシルクタイを外して、バイオエンジニアリングされた肺への順行性血流を再開します。

結果

脱細胞化プロトコルに従うと、マウスの肺は目に見えて白く半透明になります(図6A)。細胞成分は完全に除去されるべきですが、組織学的観察では肺胞構造は無傷のままです(図6B、C)。3 × 10⁷ HUVECと2日間の灌流ベースのバイオリアクター培養を用いた再細胞化マウス肺は、HUVECの均一な分布を示しています(図7A)。HUVECは末梢歯槽領域に移動し、毛細血管網を形成します(図7B)。同所性移植とバイオエンジニアリング肺の再灌流後、赤血球を含む血流がバイオエンジニアリング肺で均一に観察されます(図8A、B)。

ディスカッション

臓器バイオエンジニアリングは要求の厳しい企業です。コストのかかるスクリーニングプロセスが、この分野の研究開発サイクルを妨げてきました。マウスを実験プラットフォームとして使用することにより、以前に使用されていたラットプラットフォームと比較して、スペース、細胞、および培地が大幅に削減されます。ガス交換、血管抵抗、肺コンプライアンスなどの詳細な物理的パラメータの測定はまだ達成されていませんが、マウス肺モデルでは、実験プロトコルの迅速な反復や、細胞の生存率、統合、足場の相互作用の試験が可能になるため、研究のタイムラインを短縮することができます。マウスは迅速に繁殖し、多数の遺伝子改変株で利用できるため、in vivoでさまざまな遺伝子および細胞修飾を柔軟に研究できます。仮説を迅速に検証し、プロトコルを最適化するこの能力は、肺バイオエンジニアリングの成功に必要な最適な細胞環境と培養技術についての理解を深めるのに役立ちます。マウスモデルの技術を改良することで、研究者はスケーラブルな方法とプロトコルを確立し、後でより大きな動物モデルに変換し、最終的には人間への応用に応用することができま...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
脱細胞化
27 G x 1/2 インチBD PrecisionGlide Needle	BD	305109	または同等品 27 G 注射針
BD Insyte IV カテーテル 20 GA X 1.8 8IN	BD	381237	または同等品 20 G IV カテーテル
ブレードシルク縫合糸 (4-0)	Nesco	GA04SB	または同等品
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
ラット頸静脈用カテーテル、PU 2Fr 10 cm	Instech	C20PU-MJV1301	体重30g以下のマウスにおすすめです。
ラット頸静脈用カテーテル、PU 3Fr 10 cm	Instech	C30PU-RJV1307	30gを超えるマウスに推奨されます。
DNase I	シグマ・アルドリッチ	DN25
MgSO4	シグマ・アルドリッチ	M7506
NaCl	シグマ・アルドリッチ	S3014
ピンポート インジェクター	インステック	PNP3M
ピンポート、22 G	インステック	PNP3F22-50	C30PU-RJV1307
ピンポートに適合、25 G	インステック	PNP3F25-50	C20PU-MJV1301に適合
デオキシコール酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	D6750
滅菌シリンジ、5 mL	ジェネリック
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5
CELL CULTURE
EGM-2 内皮細胞増殖培地-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
HUVEC –ヒト臍帯静脈内皮細胞	Lonza	C2519A
灌流ベースのバイオリアクター
20 G 針	ジェネリック
3 ウェイ活栓	ジェネリック
コルクボーラー	ジェネリック		リングサイズ、6-10 mm
EasyLoad III ポンプヘッド	Cole-Parmer	243934
ガラスキャニスター	ハリオ	SCN-200T	内径: 80 mm
加熱マグネチック スターラー	ジェネリック
ルアー フィッティング、PVDF、ソフト チューブ用	ノードソン メディカル	2-9965-01	メス、内径 1.5 mm (L/S 14) のチューブに適合
ルアー フィッティング、PVDF、ソフト チューブ用	ノードソン メディカル	2-9964-01	オス、内径 1.5 mm (L/S 14) のチューブに適合)
ルアー フィッティング、PVDF、ソフト チューブ用	ノードソン メディカル	2-9965-03	メス、内径 3 mm (L/S 16) のチューブに適合ル
アー フィッティング、PVDF、ソフト チューブ用	ソン メディカル	2-9964-03	オス、内径 3 mm (L/S 16) のチューブに適合磁
気撹拌バー	ジェネリック
Masterflex L/S リモート I/O およびベンチトップ コントローラー付きデジタル精密モジュラー ドライブ	Cole-Parmer	07557-00
Masterflex L/S 精密ポンプ チューブ、PharMed BPT、L/S 16	Cole-Parmer	06508-16
Masterflex L/S Pricision ポンプ チューブ、プラチナ硬化シリコン、L/S 14	Cole-Parmer	96410-14
Millex-GP シリンジ フィルター ユニット、0.22 &m、ポリエーテルスルホン、33 mm、ガンマ線滅菌	リポア	SLGPR33RS
レックス 250 mL グラスボトル、GL-45 スクリューキャップ	Corning	1395-250
GL45 オープントップ用シリコンセプタム PBT スクリューキャップ	Corning	1395-455S
シリコンライトストッパー	IMG	07763-18	上径:87 mm、下径:75 mm
菌シリンジ、10 mL、50 mL	ジェネリック
マウス手術 (心肺ブロックの分離 |肺移植)
10-0 ナイロンタイ	河野製作所	N/A
10-0 シルクタイ	河野製作所	N/A
4-0 シルクタイ	河野製作所	N/A
クランプ、45 mm 湾曲、溝付き	目製作所	C-17-45
BD Insyte IV カテーテル 24GA	BD 381512		または同等の 24G i.v. カテーテル
ブルドッグ血管鉗子 45mm 湾曲した	夏目製剤	M2
石酸ブトルファノール	明治精化製薬	N/A
セファゾリンナトリウム	大塚製薬	N/A
デュモン鉗子 #5/45	ファインサイエンスツール	1251-35
ファイン	サイ	15403-08	45度、先端、0.01×0.06mm
ミニ焼灼キット	ハーバード装置	RS-300
Halsted-Mosquito クランプ 湾曲した先端、125 mm	バイオリサーチ センター	16181670
Hegar ニードルホルダー、150 mm	B Braun/Aesculap	BM065R
ヘパリン溶液	持田製薬	N/A
メデトミジン	日本善業工業	N/A
マイクロ鉗子ストレート	B ブラウン/エスキュラップ	BD33R
ミダゾラム	サンド	N/A
マウス人工呼吸器	バード	モデル 687™
生理食塩水、臨床グレード	大塚製薬	N/A
ペトリ皿、60 x 15 mm	BD	351007
Safelet Cath PU 20ゲージポリウレタンカテーテル	Nipro	09-031
榊ステンレスハサミ 湾曲 14 cm	バイオリサーチセンター	64152034
メスホルダー	バイオリサーチセンター	16101040
小動物の引き込みシステム	ファインサイエンスツール	18200-20
スペアブレードメス #11	村中医療機器	567-001-03
スプリングハサミ、15cm	バイオリサーチセンター	PRI13-3736
実体顕微鏡	ライカマイクロシステム	M525	フレキシブルアームシステムを備えた臨床グレードの手術用顕微鏡が望ましいです。
杉田チタン動脈瘤クリップ カーブスリム No.98	みずほメディカル	17-001-98
杉田チタンクリップアプライヤー 110mm	みずほメディカル	17-013-53
温度調節可能な電気ウォーマー	ジェネリック
ウルトラファ	ジェネリック
血管・気管支カフ
ファインサンドペーパー	ジェネリック
Venula 20 ゲージ テフロン血管カテーテル	トップ	1160
Venula 22 ゲージ テフロン血管カテーテル	トップ	1161
Venula 24 ゲージ テフロン血管カテーテル	トップ	1124