三次元オルガノイド培養および子宮筋腫生成のための処理技術

Summary

本プロトコルは、筋腫および子宮筋腫組織から幹細胞の3Dオルガノイド培養に埋め込まれたコラーゲン含有ハイドロゲルを手作業で作成する技術を示しています。

Abstract

子宮筋腫は、女性の子宮内で最も一般的な良性の単クローンの婦人科腫瘍です。これらの病理の研究に伴う一般的な障害を克服するため、コラーゲンを含むハイドロゲルを埋め込み足場として用いる三次元オルガノイドモデルの筋骨および子宮筋腫幹細胞を生成する戦略を考案することを目指しました。具体的には、低付着型V型底面96ウェルプレート内のコラーゲン含有ハイドロゲルを利用しました。この方法により、正常な筋量体と子宮筋腫を含む筋腫から、コラーゲンを含むヒドロゲルに埋め込み、適切な幹細胞増殖培地でオルガノイドを形成することで、2種類の幹細胞型の3Dオルガノイドを開発することが可能となりました。オルガノイドは成功裏に分化し、増殖し、複雑な構造へと自己組織化し、持続可能なシステムを構築しました。このモデルの重要性は、病態生理や病因の理解、そして子宮筋腫の予防や治療のための新薬試験に関わる点にあります。

Introduction

子宮筋腫、または平原筋腫は、子宮の最も一般的な良性腫瘍です^。生殖期に多くの女性に影響を及ぼしており、研究によると約77%の女性が一度は経験しているとされています。多くの女性は症状なしに筋腫を持っていますが、約25%は異常な子宮出血、骨盤痛、不妊などの症状を経験しています^。筋腫の発生と成長は、性ホルモン、成長因子、遺伝的変化、その他の生物学的メカニズムなど、さまざまな要因によって影響を受け^ます。

病因の研究と薬剤の有効性を検証するために、 in vitro および動物モデルが開発されています。2次元培養中の細胞は平らな表面で成長を強いられ、その形状が歪み、3D組織環境での挙動とは異なる挙動を生みます。2D培養の主な欠点は、3D培養に比べて組織内の自然な細胞環境を十分に表現できず、生物体で起こる複雑な細胞間および細胞-マトリックスの相互作用を正確に模倣できず、細胞の挙動や刺激反応の研究において不正確な結果を生む可能性がある^{ことです。}さらに、UF細胞と筋組細胞は2次^元培養でホルモン応答性を急速に低下させます。全体として、さまざまな動物モデルはUFの病態生理に関する関連情報^{を提供しています。}動物モデルと比べて、3Dオルガノイドは実験を簡素化し、リアルタイムイメージングと互換性があり、^{動物モデルでは}十分に反映されていないヒト特異的な発達や疾患の側面の研究を可能にするといういくつかの利点があります。一方で、霊長類のようなより高度な動物を使った実験は倫理的に正当化が非常に困難であり、高額な費用も伴^います。3Dオルガノイドモデルは、2D細胞培養よりも一般的に優れており、生 体内 の組織構造をより正確に模倣しつつ、動物モデルよりも制御され、効率的かつコスト効率的です。したがって、自然な細胞成長や病変組織の複雑さを正確に再現する、より効果的な代替モデルの開発が不可欠です。

私たちは、コラーゲンを含むヒドロゲルを用いて筋腫および子宮筋腫幹細胞の3Dカルガノイドを手動で行う手順を確立することを目指し、主な利点と限界を強調しました。

Protocol

このプロトコルはシカゴ大学民族委員会によって承認され、承認番号はIRB#20-1414です。シカゴ大学の組織バンクによると、組織を採取したすべての被験者からインフォームド・コンセントが得られました。

オルガノイドの培養1. 3D

1. ^前述の通り、単離・精製された筋層およびUF幹細胞(SC)を培養・維持します。
2. 液体窒素からサルトを入手し、解凍させます。培養プロセスのフローチャートは 図1に示されています。
3. あらかじめコーティングされたフラスコを準備するために、付着因子タンパク質5mLを加えます。37°Cで少なくとも4時間培養します。 その後、過剰な付着因子であるタンパク質を捨てます。
4. プレコートされた75 cm² フラスコで、デュルベッコ改良イーグル培地(DMEM)とF12を12%胎児用牛血清(FBS)で補足した培地10 mLで培養します。フラスコを37°Cの低酸素インキュベーターで酸素濃度2%で90%の合流点に達するまで培養します( 図2A参照)。
   注意:低酸素症は幹細胞の増殖と生存を促進するため、幹細胞の成長に重要な役割を果たします。
5. 合流に達したら、カルシウムやマグネシウムを含まず、HBSS中に25%トリプシン-0.1%EDTA溶液を用いて細胞を剥離します。
   1. そのためには、培地を除去してください。細胞を1倍のPBSで洗浄します。1 mLのトリプシンを25 cm²の細胞に加え、2〜3分間培養します。
   2. 細胞が剥離し始めたら、血清を混ぜてトリプシン反応を止めます。細胞溶液を15mLのチューブに吸引し、室温500 x g で5分間遠心分離機に入れます。
   3. 慎重に、上澄液を捨て、ペレットはそのままにします。
6. その後、細胞ペレットを1mLの血清フリー幹細胞増殖培地に再懸浮させます。優しくピペッティングすることで塊を乱してください。
7. 血液細胞計を使って細胞定量を行います。
   1. 細胞懸濁液100μLと0.4%トリパンブルー溶液10μLを混ぜます。
   2. 混合物を一時的に渦巻き、チャンバーノッチとガラスカバースリップの間のヘモサイトメーターチャンバーに10μLのトリパンブルーセル懸濁液をピペットで注入します( 図2B)。
   3. ボックス1から4のセル数を数え、以下の式を使ってセル数を計算します。
      細胞数/mL = (カウントされた細胞数/カウントされた箱数数) × 希釈係数 × 10,000
      サンプル中の総細胞数 = 細胞/mL×総サンプル体積
8. 約10,000個の細胞に2μLのコラーゲン含ヒドロゲルと98μLの血清無添加幹細胞増殖培養液を混合し、V型底面96ウェル^{プレートで}100μLの最終体積を得ます。
9. 細胞混合物を100μLピペットで、低いV型底96ウェルプレートの各ウェルに注ぎます。室温で100 x gの距離を5分間遠心分離機にします。
10. プレートを37°Cのインキュベーターに5%の_CO2 を入れて30分間置きます。
11. 各ウェルに追加で、コラーゲン含有ヒドロゲルなしの血清不使用幹細胞増殖培地100μLを追加し、臓器の成長に必要な栄養を提供します。
12. 過剰な蒸発が発生した場合、稀に発生する過剰な蒸発の場合は、各ウェルに10〜20μLの血清フリー幹細胞増殖ミディウムを加えて培地蒸発を補う。
13. オルガノイドの完全な成長のために細胞を7日間培養します(図2C-H)。血清フリー幹細胞の増殖培地を週2回交換し(古い培地を優しく吸引し、新しい培地を加える)、SC由来のオルガノイドの培養を最大21日間延長します。

2. 冷凍区切り

1. 96ウェルプレートから細胞を1.5 mLのマイクロ遠心分離管で採取します。
2. クリオセクションでは、オルガノイドをリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS;1回)で2回洗浄します。オルガノイドにPBSを500μL加え、遠心分離機で上清液を廃棄します。
3. オルガノイドを4°Cで60分間4%パラホルマルデヒド(PFA)500μLで固定し、再びPBS1回で洗浄します。
4. オルガノイドを2%メチレンブルー100μLに再懸浮させ、20分間染色します。PBS1回で洗い、30%ショ糖500μLに一晩懸液でクライオプロテクトを施します。
5. 翌日、遠心分離でショ糖溶液を除去します。オルガノイドを最適切削温度化合物(OCT)に埋め込み、−80°Cで急凍します。
6. OCTに埋め込まれたオルガノイドをクライオスタットで切断し、最適な切断深度は10μmで、すぐにスライドに各スライドに1セクションずつ配置します。
7. スライドは4°Cで保存し、以下の方法で免疫蛍光染色が行われます。
8. スライドを100μLの1xPBSで3回洗います。次に、室温で15分間、0.1%トリトンをPBSに100μL(1x)加えます。
9. オルガノイドを5% BSAを1x PBSに60分間ブロックし、希釈したSox-2およびα平滑筋アクチン(α-SMA)の一次抗体で1夜、最終濃度1 μg/mLで培養します。
10. オルガノイドを100μLの1xPBSで洗浄し、その後Alexa蛍光色素標識蛍光染料二次抗体(1:1000)で暗闇で1時間培養します。
11. 100μLの1xPBSで洗浄し、その後DAPI(1 ng/mL)を補足したアンチフェードマウンティングメディウムにマウントします。
12. 蛍光顕微鏡で20倍倍の画像を取得します。 図3A を参照し、バイオイメージング解析のためにソフトウェアで画像を解析してください。

3. 全マウントオルガノイド免疫蛍光染色

1. オルガノイドを培地から取り出します(ステップ1.11)マイクロ遠心分離機チューブに入り、500μLの1倍PBSで2回洗浄します。
2. オルガノイドを4%PFAの500μLで室温で60分間固定します。その後PFAを捨て、PBS500μLで3回洗います。
3. 固定オルガノイドを4°Cで一晩、ブロッキングバッファー0.5mLで透過します。
4. 翌日、ブロッキングバッファーを取り出し、希釈した1:500の1:500と希釈したAHRの一次抗体(300-500 μL)を加え、4°Cで一晩培養します。
5. オルガノイドを500μLの1xPBSで3回洗浄し、その後、2次抗体(ヤギ抗ウサギIgG594、ヤギ抗マウスIgG488)と共に夜間4°Cで夜間培養します。
6. オルガノイドを500μLの1xPBSで3回洗浄し、その後室温で5μg/mLの4′6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)を1xPBS(サンプルあたり300-500μL)で20分間培養します。
7. オルガノイドを500μLの1x PBSで3回洗浄し、共焦点顕微鏡で画像を撮影します(図3B)。

4. オルガノイド解離

1. 100 mgのパパンをフィルター滅菌活性化液で250 U/mLのストック濃度に再構成し、37°Cで30分間培養して酵素を活性化します
   注意:2〜8°Cで最大2週間保存可能です。
2. 使用直前に、30 U/mLのパパパンと125 U/mLのDNase Iをハンクスバランス塩溶液(HBSS)に浸して解離液を準備します。
3. オルガノイド(ステップ1.11)を24ウェルプレートに移し、解離溶液500μLを加えます。
4. サンプルは37°Cで30〜60分間、90rpmに設定された軌道シェーカーで孵化します。
5. 室温で1 mLピペッターを用いて断続的に5〜6回の三分割を行い、主に単一細胞からなる懸濁液を得る。
6. 細胞懸存液をプロテアーゼ阻害液(10 mg/mLの1 mL)を含む15 mL遠心分離管に加え、300 x g で5分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清液を捨てます。
7. 適切なバッファーにセルを再懸浮させると、得られる単一セルの懸濁液は 図2Iに示されています。

Results

種まきの初日には、SCが自己集まりを始め、図のようにオルガノイドを形成しました。最適な種まき密度は10,000 SCであり、定義された培養系で培養すると一貫してオルガノイドを形成しました。このシステムは、コラーゲンを含むハイドロゲルをECMスキャフォールとして、埋め込み幹細胞および幹細胞増殖培地を7日間、超低付着96ウェルプレート(図2C-G)で使用しました。この環境では、細胞は初日までに自己組織化し、オルガノイド構造へと進化します。7日間の間にこれらの構造は指数関数的に成長しました(図2H)。さらに、α-SMA(緑の上)とSox-2(赤い下^{部)に対して}免疫染色が行われました^9,10。代表的な画像は、

Discussion

オルガノイドは、小型化された臓器に似た三次元構造で、幹細胞や組織サンプルから得られる自己組織化された細胞で構成されています¹¹。患者の組織由来幹細胞オルガノイドは、UFの生理学^と疾患を正確に再現できる驚異的な能力により、生物医学研究と臨床応用に革命をもたらす可能性があります。本研究では、正常およびUF患者の両方からヒトSCから得られたオルガノイド培養システムを導入し、このギャップを埋めようと試みます。

コラーゲンを含むハイドロゲルを扱う際の重要なポイントは、常に4°Cの氷で保存し、培地と混合されるまで保管することです。室温では急速に凝固してゲルとなり、細胞培養用途には使えなくなります。これはコラーゲンを含むハイドロゲルを含むあらゆるプロトコルにおいて最も重要なステップと考えられています。

このチームは2022年に最初のUFオルガノイドを、以前に培養されていたUF...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2光子共焦点 顕微鏡	ライカ、アメリカ
アガローズI型	VWRコーポレーション、アメリカ	97062-248
Akura 96 球状マイクロプレート	インスフェロ	CS-09-004-03	低付着V型底板
Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス IgG	ライフ・テクノロジーズ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国	(A11029)	(1:1000)
Alexa Fluor 594ヤギアンチウサギIgG	ライフ・テクノロジーズ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国	(A11037)	(1:1000)
アンチ・アール[RPT]	GeneTex、台湾	(GTX227700a)	(1:1000)
抗α平滑筋アクチン抗体およびnbsp;	アメリカ合衆国マサチューセッツ州アブカム	(ab7817)	1 & micro;g/mL
抗コラーゲンIII抗体およびnbsp;	アメリカ合衆国マサチューセッツ州アブカム	(AB7778)	(1:500)
抗SOX1抗体および	アメリカ合衆国マサチューセッツ州アブカム	AB242125	(1:500)
アタッチメントファクター	ギブコ、アメリカ	S-006-100
ブロッキングバッファ	ダコ	X0909	5% 馬用血清 + 0.5% トリトン X-100 1X PBS
クライオスタット	フィッシャー・サイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州	マイクロム HM 550
DAPI(4′、6-ジアミジノ-2-フェニルリンドール)	サーモ・サイエンティフィック、ドイツ	62248	1 mg/mL
DNase I	サーモ・サイエンティフィック、リトアニア	EN0521
ドゥルベッコ改良型イーグル」sの中型DMEMおよびnbsp;F12	ギブコ、アメリカ	21041-025
胎児用牛血清	オメガ・サイエンティフィック、nbsp;マサチューセッツ州ウォルサム	NC0471611
マトリゲル(コラーゲンを含むハイドロゲル)	コーニング、コーニング、ニューヨーク州	356237
MesenCult-ACF Plus培地(血清フリー幹細胞増殖型培地	Stemcell Technologies、カナダ・バンクーバー	5446
OCTコンパウンド(最適切削温度コンパウンド)	サクラ、アメリカ	4583
オリンパスBX41顕微鏡	オリンパス・アメリカ、センターバレー、ペンシルベニア州
卵ムコイドプロテアーゼ阻害液およびnbsp;	ウォージントン・バイオケミカル・コーポレーション(米国)	LK003182
Papain	ウォージントン・バイオケミカル・コーポレーション(米国)	LK003176	活性化溶液(1.1 mM EDTA、0.067 mM メルカプトエタノール、5.5 mM L-システイン HCl)
PBS(リン酸緩衝生理食塩水)	ギブコ、アメリカ	70011	pH 7.4
PFA(パラホルムアルデヒド) 4%	インビトロジェン、アメリカ合衆国	FB002
クパス	バンクヘッド、P. ほか  QuPath:デジタル病理画像解析用のオープンソースソフトウェア。 科学的報告書 (2017).	https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5	バイオイメージング解析用ソフトウェア
タイムラプス顕微鏡
組織培養フラスコ	フィッシャー・サイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州	FB012937
トリプシン	ギブコ、アメリカ	A12859-01	カルシウムまたはマグネシウムなしのHBSSでは、0.25%のトリプシンおよび0.1%のEDTAおよびnbsp;
VECTASHIELD アンチフェード搭載メディウムにDAPIを補完	ベクター研究所、カリフォルニア州、アメリカ合衆国	# UX-93952-24	1 ng/mL