生理食塩水鼻洗浄水を使用して、犬の鼻免疫微小環境をサンプリングできます。このアプローチは比較的非侵襲的であり、鼻組織を破壊しないため、連続して実行できます。鼻洗浄技術から収集された細胞とタンパク質は、さまざまな実験室分析のために処理できます。
この記事について
サマリー
要約
犬の鼻腔の局所免疫微小環境を評価することは、正常組織の健康状態と疾患状態、特に局所炎症に関連するものを調査するために重要です。私たちは、連続的な鼻洗浄を通じて犬の局所鼻免疫微小環境を評価する技術を最適化しました。簡単に言うと、麻酔下で犬を胸骨の横臥位に配置した状態で、温めた滅菌生理食塩水を柔軟な軟質ゴムカテーテルを使用して患部の鼻孔に洗い流します。流体の逆流は円錐形のチューブに集められ、このプロセスが繰り返されます。脱落した細胞やタンパク質を含む液体をプールし、プールした鼻洗浄サンプルを細胞ストレーナーでろ過して、大きな破片や粘液を取り除きます。サンプルを遠心分離し、細胞ペレットを分離して分析します。サンプルが処理された後、経鼻洗浄後の分析には、フローサイトメトリー、バルクまたはシングルセルRNA配列による細胞のトランスクリプトーム解析、および/または洗浄液中に存在するサイトカインの定量化が含まれます。
概要
犬は生涯を通じて炎症性の鼻の状態を日常的に発症します。犬の急性または慢性鼻炎の根本的な原因は、感染性(ウイルス性:インフルエンザ、パラインフルエンザ、ヘルペスウイルスなど、細菌性[ボルデテラ、マイコプラズマなど]、真菌性[アスペルギルス症、クリプトコッカス症など]、寄生虫性[鼻ダニなど])、腫瘍性(副鼻腔悪性腫瘍、最も一般的には癌腫または肉腫の組織型)、異物(異物、変位した歯の鼻腔内移動など)から歯周病までさまざまです。 犬の特発性炎症性鼻炎1,2,3,4,5,6,7と同様に。
身体検査に加えて、鼻の炎症のある犬の副鼻腔の状態を評価するために、さまざまなアプローチが使用されます。画像診断法には、X線写真(歯科、頭蓋骨)、コンピューター断層撮影(CT)、または磁気共鳴画像法(MRI)が含まれる場合があります。鼻腔を画像化する別のアプローチは、鼻鏡検査です。組織サンプリングには、鼻腔スワブ、ブラシサンプル、または組織生検の採取が含まれ、そこから細胞学的および/または組織病理学的評価を行うことができるほか、真菌または細菌培養のためのサンプル提出も行うことができます。これらのサンプルは、「ブラインド」サンプリングから、鼻鏡検査や高度なイメージングによる画像誘導まで、さまざまなアプローチで取得でき、鼻孔から、鼻咽頭から、または穿孔術、鼻切開術、または副鼻腔切開術の外科的アプローチで取得できます。
鼻腔内に滅菌生理食塩水を投与する鼻洗浄は、診断および治療目的で犬の鼻腔をサンプリングするためにも使用されています。鼻腫瘍に使用されている鼻洗浄技術の代替バージョンは、鼻水脈術と呼ばれ、強制的な鼻フラッシングと呼ばれ、診断評価のために大きな腫瘍サンプルを取り除くことができるだけでなく、鼻がんに関連する臨床徴候の改善のための治療的救済を提供することができます8。
ここでは、鼻免疫微小環境の細胞とタンパク質を収集および分析することを目的とした目的で、鼻洗浄技術の別のバージョンを紹介します。穏やかで比較的非侵襲的なアプローチにより、この鼻洗浄技術を連続的な鼻免疫微小環境サンプリングに最適化しました。炎症のない鼻腔、活動性ヘルペスウイルス感染、および副鼻腔腫瘍のある犬を対象とした試験では、下流アプリケーション9,10のサンプルの収集と処理に対する鼻洗浄の有用性を実証しました。
この原稿では、イヌの鼻免疫微小環境の連続サンプリングのための生理食塩水鼻洗浄の技術について説明します。組織への混乱を最小限に抑えて鼻洗浄サンプルを効果的に取得し、さまざまな分析のためにサンプルを処理するためのプロトコルの詳細を提供します。
プロトコル
この鼻洗浄手順は、コロラド州立大学の施設内動物管理および使用委員会および臨床審査委員会(IACUC #2425)によって承認されています。鼻洗浄法の概略図を 図1に示します。
1.鼻洗浄の準備
- 鼻洗浄手順の前日に、5つの20 mLシリンジに滅菌生理食塩水(0.9%塩化ナトリウム溶液)を満たし、キャップで閉じます。.シリンジを37 °Cに設定されたインキュベーターに入れて、一晩温めます。
2.鼻洗浄のために犬を配置する
- 処置のために犬に麻酔をかけます (例: IV カテーテルを介してデクスメデトミジン (1-4 μg/kg) とブトルファノール (0.2-0.5 mg/kg) を静脈内 (IV) 注射します)、続いて挿管の効果が得られるように滴定されたプロポフォール IV (2-5 mg/kg) を投与します。効果を得るために1〜2%の吸入イソフルランで麻酔を維持します。眼瞼の反応と顎の緊張を確認して、麻酔の適切な深さを確認します。
- 処置中の乾燥を防ぐために、目を滑らかにします。
- 手順全体を通して、心臓テレメトリー、血圧、カプノグラフィー、およびパルスオキシメトリの値を監視します。
- 麻酔をかけた犬を胸骨の横臥位に置きます。犬の頭を治療台の端から下向きの角度で自然かつ快適に角度をつけるように配置して、最適な鼻洗浄サンプル収集を行います。
- 気管内チューブのカフを膨らませて、気道をしっかりと密閉します。
3.鼻洗浄を行う
- 8 FR滅菌の赤いゴム製カテーテルを基部で切断し、温かい生理食塩水が入ったプレフィルド20mLシリンジの1つにぴったりと収まるようにします。滅菌済みの赤いゴム製カテーテルを測定して、カテーテルの遠位端が鼻孔から導入されたときに鼻腔のほぼ中央まで伸びるようにします。鼻腫瘍をサンプリングする場合は、画像診断または鼻鏡ガイダンスを使用して、鼻腫瘍の吻側の位置を推定し、赤いゴム製のカテーテルの長さを測定して、先端が腫瘍の吻側側面まで伸びるようにします。
- 次に、鼻腔に挿入したときに先端が適切な位置に着地するように、定義された鼻腔内カテーテルの長さだけカテーテルを先端で切断します。ただし、鼻孔の外側に伸びるカテーテルの基部には、追加の長さを許容してください(シリンジ固定点から鼻孔入口までのカテーテルの長さ、約3〜5 cm)。カテーテルの基部に油性マーカー付きのマークを貼って、鼻孔の入り口に対応する開始点を示します。所定のカテーテルの長さは鼻腔内に広がり、カテーテルの先端は鼻腔内の目的の場所に配置されます。
- 鼻洗浄手順を実行するには、2人の個人の参加が必要です。1人(Aさん)がカテーテルを鼻腔に供給し、洗浄液を投与する責任があり、もう1人(Bさん)が鼻から出るサンプルを収集するようにします。
- Aさんに犬の頭の前後の位置に座ってもらいます。手袋をはめた手で、Aさんに赤いゴム製のカテーテルの先端を鼻腔の内側にそっと導き、カテーテルのマークが鼻孔の外側と揃うまで進めます。このプロセス中に、カテーテルが温められた滅菌生理食塩水を含むシリンジに接続されていることを確認してください。患者 B に、カテーテルを所定の位置に固定した状態で、鼻孔の下に 50 mL の円錐形チューブを保持してもらいます。
- 人物Aは、反対側の鼻孔を優しく閉塞し、ゆっくりと安定した圧力またはパルス注入で生理食塩水を鼻腔に注入し始めます。犬の頭が下向きの角度に配置されているため、人Bは重力によって鼻腔から排出される液体を50mLの円錐形チューブに集めます。
- この鼻洗浄法を合計 5 回まで 20 mL 生理食塩水洗浄で繰り返し、必要に応じて円錐形チューブを交換して、プールされたサンプルを収集します。手順の完了後に注入された生理食塩水の量に対して収集された鼻洗浄液の総量を記録します。
- 完了したら、デクスメデトミジンで麻酔した場合は、デクスメデトミジンに使用したのと同じ量のアチパメゾールを筋肉内に投与し、犬が麻酔から回復するのを待ちます。注意するには、犬を胸骨に横たわらせ、頭を下にして、鼻洗浄からの残留生理食塩水の追加排出を促進します。
4.鼻洗浄サンプルの処理
- 円錐形のチューブ内に含まれる鼻洗浄液を静かにボルテックスおよび/またはピペットで渦巻くかピペットで動かし、破片や細胞の塊を分解します。プールした鼻洗浄サンプルを70 μmの細胞ストレインフィルターに通し、大きな破片や粘液を取り除きます。サンプルを300 × g で5〜10分間遠心分離し、細胞ペレットを形成します。
- ピペットで吸引して上清を採取し、目的のタンパク質を分析するためにきれいなチューブに沈殿させます。
- 細胞ペレットをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)または目的の細胞アッセイに適した溶液に再懸濁します。
- サンプルから赤血球を除去するために、アンモニウム-塩化-カリウム(ACK)溶解を行い、鼻洗浄11,12から有核細胞を採取する。
結果
この鼻洗浄法では、採取したサンプルはわずかに濁って見え、チューブが渦巻くと細胞の破片や粘液の破片が見える可能性があります。洗浄手順が誤って出血を誘発し、サンプルが赤みを帯びている場合、サンプルは末梢血で汚染されていると見なされます。注入された生理食塩水の一部は手術中に失われますが、注入された生理食塩水が鼻孔からチューブに逆流しない場合は、陰性の洗浄が考慮されます。考えられる原因は、ヘッドが効果的に逆流できるように十分に下向きに傾いていない、サンプルが反対側の鼻孔から尾側または横方向に排出されている、または赤いゴム製のカテーテルが注射器にしっかりと固定されておらず、生理食塩水が接続点から外側に漏れている可能性があります。
鼻がんの犬から鼻洗浄サンプルを成功裏に収集した場合、1 × 10 6-200 × 106 6 の範囲の有核細胞数が予想され、75-96% の生細胞が存在します。あるいは、鼻腔が健康で炎症を起こしていない犬から鼻洗浄サンプルを成功裏に収集した場合、細胞数は7 × 105-2 × 106の範囲にあり、6〜16%の生細胞があります。腫瘍発生犬の鼻洗浄サンプリングから得られた細胞標本の代表的な画像を図2に示します。さらに、健康な犬と腫瘍を抱えた犬の鼻洗浄サンプルから分析した細胞集団のフローサイトメトリー評価を図3に示します。これらの範囲よりも低い細胞数と生存率が、鼻洗浄手順とサンプル収集が失敗したことを示していると予想される。表1は、実施された処置の数、犬の数、鼻腔の状態(健康または腫瘍発生)、有核細胞数の収量、処置のために得られた細胞の生存率、および洗浄サンプルがダウンストリーム分析の成功または失敗と見なされたかどうかに関して、著者らが実施した鼻洗浄技術の結果をまとめたものです。表1に含まれる鼻洗浄サンプルを用いて行った実験の目的上、最小細胞数収量150,000を鼻洗浄サンプル採取の成功とみなした。
この鼻洗浄技術では、滅菌された0.9%生理食塩水を使用して細胞を収集します。あるいは、ハルトマンの解決策(乳酸リンガーの解決策)を検討することもできます。ただし、生理食塩水またはハルトマン溶液で採取したサンプルは、目的の細胞について同等の生存率と結果を確認するためにテストする必要があります。さらに、腫瘍を持たない犬に赤いゴム製のカテーテルを使用する代わりに、フォーリーカテーテルで鼻洗浄を行うこともできます。ここで紹介した鼻洗浄技術では使用されていませんが、フォーリーカテーテルを使用すると、カテーテルの先端でバルーンを膨らませ、鼻腔を閉塞し、尾側の水分の損失を防ぐことができます。また、ここで紹介した鼻洗浄処理アプローチでは検証されていないが、鼻洗浄サンプルにヒアルロニダーゼを添加すると、鼻洗浄サンプルに集まった粘液が分解され、より多くの細胞が分析のために解放されると考えることができる。これはまた、鼻洗浄処理手順にヒアルロニダーゼを追加することで結果が変わらないように最適化する必要があります。
イヌがんの臨床試験に登録されたイヌで実施された成功した鼻洗浄手順から得られた公開結果を 図310に示します。 図3 に示されている結果は、腫瘍が単独でまたは局所頸部リンパ節照射と組み合わせて照射された副鼻腔腫瘍の犬の局所免疫微小環境に対する選択的リンパ節照射の影響を調査した研究からのものです。経鼻洗浄剤を用いた臨床試験におけるイヌの鼻腔の連続サンプリングを通じて、採取した細胞のフローサイトメトリー解析により、放射線治療の最終日にエフェクターT細胞の集団が有意に減少したことが明らかになりました。これは、腫瘍を標的とした放射線療法を受けたイヌと比較して、副鼻腔腫瘍と同時に照射され、所属リンパ節が温存されたイヌと比較して明らかになりました。これは、洗浄液を使用して鼻腔を連続的にサンプリングして、さまざまなポイントやさまざまな治療条件での細胞集団の変化を調査することの有用性を示しています。
図1:鼻洗浄法の概略図。 麻酔をかけた犬の鼻腔に、赤いゴム製のカテーテルを使用して、温められた滅菌生理食塩水を注入します。鼻洗浄液は、鼻から排出されるときにチューブに集められます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:鼻腫瘍のある犬から採取した鼻洗浄サンプルの細胞組成。 鼻洗浄サンプリングから得られた細胞標本の代表画像(500倍倍、Modified Wright-Gimsa染色)。好中球(矢印)が優勢な細胞であり、いくつかの扁平上皮細胞(矢印)と小さな成熟リンパ球(四角いボックスで強調表示)も存在します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.健康な犬と腫瘍を抱えた犬から採取した鼻洗浄サンプルのフローサイトメトリー分析。 健康なイヌ(青、n = 3)と副鼻腔がんの担発犬(赤、n = 4)の生細胞、免疫細胞、好中球の存在量の比較。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:選択的リンパ節照射(ENI)が局所免疫微小環境に与える影響を調査する臨床試験に登録された犬の鼻洗浄から採取した細胞のフローサイトメトリー解析。 経鼻洗浄サンプルからのCD4(CD5+CD4+)およびCD8(CD5+CD8+)T細胞の定量。腫瘍照射と同時にENIで治療されたイヌ(n = 3)は、腫瘍のみを標的とした放射線で治療されたイヌ(n = 3)と比較して、放射線の最終日(3日目)にエフェクターCD4およびCD8T細胞が有意に減少しました。この図は、Darragh et al.10から修正されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 健康 (n=3) | 腫瘍担体 (n= 19) | |
| 実行された手順の数 | 3 | 80 |
| セル数 | 0.7 x 106 - 2.8 x 106 | 1.6 x 106 - 210 x 106;中央値: 8.7 x 106 |
| 細胞生存率 | 6.3 - 15.9% | 75% - 96%;中央値:87% |
| 成功率 | 100% | 98.80% |
表1:実施された経鼻洗浄手順の要約と得られたサンプルの細胞特性。
ディスカッション
鼻洗浄プロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。鼻洗浄処置を受けている犬に関しては、犬はカテーテル留置や洗浄投与に反応しないように、十分に深い麻酔面内にいなければなりません。麻酔下で反応性がある場合、洗浄サンプル収集の質と量が損なわれるだけでなく、鼻腔内カテーテルによる局所的な外傷による急性鼻組織の損傷や、洗浄液を吸引する犬のリスクが高まる可能性があります。
犬の頭の位置も、最適な鼻洗浄サンプル収集のために重要です。点眼された生理食塩水の重力依存性の逆流に対して頭の下向きの角度が不十分な場合、鼻洗浄液が尾側に流れ、サンプルが鼻咽頭を介して失われる可能性があります。さらに、鼻洗浄の手順では、AさんとBさんの間の明確なコミュニケーションが重要です。人Aが洗い流している間に液体が鼻孔から排出されるため、収集チューブの配置には人Bが迅速な調整が必要になる場合があります。処置中、コニカルチューブに流れ込む洗浄液の視認性は、AさんとBさんの両方にとって完全には明確ではない場合があるため、プロセス全体の積極的なコミュニケーションがサンプル収集を成功させる鍵となります。経鼻洗浄サンプルを採取した後、細胞の生存率を将来の分析のために保存するためには、0.9%生理食塩水や1x PBSなどの生理学的pH溶液で細胞を維持することが重要です。
鼻洗浄プロトコルは、収集および処理段階を通じて変更を加えることができます。サンプル採取中、犬が鼻洗浄に反応しないように、麻酔の深さを調整することができます。これは、麻酔ガスの割合を調整することによって達成できます(例:.、イソフルラン)または短時間作用型静脈内麻酔薬のボーラスを投与します(例:.、プロポフォール)。.
生理食塩水を鼻腔に注入した後、少量の液体のみがチューブに集められた場合は、犬の頭を下向きの角度に再配置して、テーブルの端から快適に休むようにし、重力の可能性を高めて体液が鼻から排出できるようにします。反対側の鼻孔から液体が排出されていることに気付いた場合は、次の洗浄のために反対側の鼻孔をしっかりと閉塞します。.プロセッシングフェーズで、初期サンプルの細胞数が少ない場合は、サンプルの上清部分を再遠心分離して、存在する可能性のある追加の細胞を回収し、総収量を増やします。
鼻洗浄法を利用して犬の鼻免疫微小環境を分析することには顕著な制限があります。この技術では、鼻洗浄サンプルは、簡単に外れてしまう鼻腔の表面細胞とタンパク質の集まりです。これらの表面細胞およびタンパク質は、イヌの鼻微小環境のより深い組織を完全に代表しているわけではないかもしれません。犬の鼻洗浄液の細胞プロファイルとタンパク質プロファイルを生検サンプルと比較し、2 つの鼻腔サンプリング技術間のこれらの要因の類似点と相違点を判断する取り組みが進行中です。
これらの制限にもかかわらず、犬の鼻免疫微小環境をサンプリングするための鼻洗浄技術は、既存の方法に代わるアプローチを提供します。組織生検や鼻鏡検査と比較すると、鼻洗浄は犬の患者にとって比較的非侵襲的です。組織生検と比較して、鼻洗浄を介して細胞とタンパク質を採取すると、臨床的に懸念される、長期にわたる、または重大な急性出血のリスクが減少します。鼻洗浄手順の後、鼻組織生検と比較して、局所的な炎症や不快感も少ない可能性があります。このため、経鼻洗浄を連続して行い、分析のために時間をかけて複数のサンプルを収集することがあります。さらに、下流の実験室方法およびアッセイのために、上清内のタンパク質から細胞成分を分離することに関して、組織生検サンプルと比較して、鼻洗浄サンプルの処理が比較的容易になります。
鼻洗浄法は、免疫微小環境に関連する研究分野での重要な応用の可能性を秘めています。がん研究では、鼻洗浄技術が使用されており10 、治療条件に対する腫瘍発生犬の鼻腔微小環境の連続的な変化を記録するために使用できます。これらの鼻洗浄サンプルは、がん治療に対する反応をよりよく理解するために、免疫微小環境の変化を相関させるのにも価値があることが証明される可能性があります。鼻の免疫微小環境における連続的な変化を調査する同様の側面は、多くの獣医学、臨床、トランスレーショナル、感染性、炎症性の研究分野で調査および調査される可能性があります。
開示事項
著者は、宣言する利益相反を持っていません。
謝辞
ここに記載されている犬の鼻洗浄技術は、K01 OD03109、CCTSI Colorado Pilot Grant Award、CSU CVMBS College Research Council Shared Resources Program、および CO HNC SPORE CA261605: Career Enhancement Program が支援するプロジェクトを通じて最適化されています。 図 1 は BioRender.com を使用して作成されました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL チューブ | Eppendorf | 05-402 | |
| 1000 & micro;L ピペット | VWR | 89079-974 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 20 mL シリンジ | VWR | BD302830 | |
| 50 mL コニカルチューブ | VWR | 89039-656 | |
| 70 & micro;m セルストレーナー | Fisherbrand | 22-363-548 | |
| 8FR 滅菌赤色ゴムカテーテル | Med Vet International | 50-252-2428 | |
| ACK 溶解バッファー | Gibco | A1049201 | |
| 遠心分離機 | Beckman Coulter | 366816 | |
| 食塩水 (0.9%) | Vetivex | 17033-492-01 | |
| Vortex | VWR | 〒10153-838 |
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