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方法論記事

上皮誘導免疫調節のマウスモデル

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DOI:

10.3791/67578

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2025年6月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 2Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この研究は、皮外(EC)免疫を通じてマウスの免疫応答を調節する皮膚の役割を示しています。タンパク質抗原によるEC免疫は、接触過敏症の免疫応答を抑制したり、病原体に関連する分子パターンと組み合わせることで皮膚誘発性の抑制を逆転させることができます。EC免疫は、針を使わない効果的な免疫療法として有望視されています。

要約

皮膚は、人体において生体内で最大の器官であり、外部環境と接する役割を担っており、(1)生体異物や微生物から生体を守る、(2)体温調節を促進する、(3)水分と電解質のバランスを保つ、(4)ビタミンDを合成する、(5)免疫に関与する、など、重要な生理学的役割を果たしています。この論文では、免疫学的メカニズムにおける皮膚の重要な関与を強調し、免疫応答を抑制または増強することによって免疫調節する能力を示しています。これまでの知見から、マウスでは、抗原による皮外(EC)免疫を単独で、または病原体関連分子パターン(PAMP)と併用することで、免疫応答をそれぞれ抑制または増強できることが明らかになっています。具体的には、抗原を用いたEC免疫が、自己免疫疾患やアレルギー性接触皮膚炎の様々なマウスモデルにおいて免疫応答を抑制できることが観察されました。この結果から、抗原とPAMPsを併用したEC免疫は、病原体に対する免疫力を高めたり、ヘルパーT型2型リンパ球(Th2)依存性アレルギーを緩和したりするための有効な戦略として役立つ可能性が示されました。このプロトコルは、ヒトアレルギー性接触皮膚炎 (ACD) 接触過敏症 (CHS) のマウスモデルにおける抗原の皮下適用を介して皮膚抑制を誘導する方法を概説しています Th1細胞によって媒介されます。ただし、さまざまなマウス障害モデルにも適用できます。この記事では、EC誘導免疫調節を、さまざまな疾患に対する無針免疫療法の魅力的なマウスモデルとして紹介しています。

概要

この記事では、接触過敏症(CHS)のマウスモデルで耐性を誘導する方法(本書では「抑制」と呼ぶ)と、抗原単独または病原体認識受容体(PRR)のリガンドと組み合わせて抗原を皮外(EC)で適用することにより、この耐性を逆転させる方法(本書全体で「抑制」と呼ぶ)についてそれぞれ紹介します1.説明されているプロトコルでは、(a)ハプテン化マウス免疫グロブリン(TNP-Ig)は、接触過敏症を抑制するための抗原として、または(b)病原体関連分子パターン(PAMP)の抗原、Toll様受容体(TLR)およびヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン含有タンパク質(NOD)様受容体(NLR)のリガンドを使用して、皮膚誘発性の抑制を逆転させます2,3,4.この知見は、EC誘導性免疫調節が抗原非特異的Tサプレッサー(Ts)細胞と抗原特異的Tコントラサプレッサー(Tcs)細胞によって媒介されることを示しています。これらの細胞を養子細胞移植のマウスモデルで調べて、試験した反応のメカニズムを判断できます。現在のプロトコルでは、「養子移入IN」と「養子移入OUT」の2つの細胞移植モデルが記述されています。養子移行INは、CHSの求心性および遠心性期における免疫調節の試験に有用です。一方、「養子移籍OUT」は、CHSの遠心性期のみに免疫調節の効果を反映しています。

この記事では、ヒトアレルギー性接触皮膚炎(ACD)-Tヘルパー1型リンパ球(Th1)5によって媒介される接触過敏症(CHS)のマウスモデルにおける抗原の皮下適用による皮膚誘発抑制の方法について説明しています。しかし、このアプローチは、T細胞傷害性リンパ球1型(Tc1)媒介CHS6,7、コラーゲン誘発性関節炎(CIA)8,9などの自己免疫疾患、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)10,11、および潰瘍性大腸炎12の実験モデルの調節(抑制、耐性)におけるその有効性についてもテストされました. さらに、プロトコルは、CHS 13,14,15,16のマウスモデルにおけるPRRリガンドと共に抗原のEC適用による皮膚誘発性禁反抑制(逆抑制)の方法を説明しています。提示された結果は、EC誘導抗原非特異的抑制がTLR2、TLR3、TLR4、TLR9、およびNOD2リガンドを精製することにより逆転できることを示しています。この皮膚誘発性コントラ抑制法は、アトピー性皮膚炎(AD)の動物モデルでも採用され、非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド(CpG)を含む合成一本鎖DNA分子の存在下で抗原によるEC処理-TLR9のリガンドが、抗原特異的な方法でTh2媒介応答を抑制できる(免疫応答をTh1/Th17表現型にシフトさせる)ことを示しました17。.記載された方法は、肺炎球菌性肺炎でも試験され、ウシ血清アルブミンに結合した肺炎球菌多糖類(PC-BSA)によるEC免疫とCpGが、肺炎球菌に対する免疫を潜在的に強化できることを示しています18。

EC誘導免疫調節の重要な側面は、モデルの選択と抗原の性質です。この記事には、使用した抗原、抗原曝露時間、および試験したモデルのT細胞特異性を詳述した表が含まれています(表1を参照)。記載された免疫調節法は、抗原特異的Tリンパ球が関与する疾患を対象としている。この方法の有効性は、プロセスに適合する EC 適用抗原を利用することによって評価されました。抗原の適合性は、抗原が疾患プロセスに関与するTリンパ球と効果的に相互作用することを保証するために重要です。無傷の皮膚にタンパク質またはペプチドパッチを適用すると、表皮19,20を介した抗原の浸透が促進されます。この抗原浸透の増加は、ドレッシングの下の発汗の増加に起因しています。表皮透過性の変化は、パッチ適用から4〜10時間以内に発生しますが、EC誘発性免疫調節は最大2週間有効であり続ける可能性があります5,14。

EC治療は広く用いられていますが、この方法には多くのバリエーションが存在するため、疑問が生じる可能性があります。現在の理解では、抗原投与前の表皮損傷の程度が、結果として生じる免疫応答の性質に影響を与える可能性があることが示唆されている21。表在性表皮損傷は、ランゲルハンス細胞による抗炎症性サイトカインの放出を引き起こし、Th2応答の開始を促進します22。対照的に、より広範な表皮損傷は、炎症誘発性サイトカインの放出を促進し、真皮樹状細胞への抗原送達を促進する23。提示されたプロトコルは、(a)この方法を小型で活動的な動物、特にマウスに適用する際の課題の認識を強調しています。(b)カミソリ剃剃り後の皮膚の状態、物質の皮膚との適切な接触、曝露時間、EC治療中の皮膚の衛生状態などの要素を考慮して、治療の有効性を決定できる。抗原を塗布する前に、物理的であれ化学的であれ、皮膚の脱毛方法を検討することが重要です。なぜなら、さまざまな皮膚製剤が肌の状態にさまざまな影響を与えるからです。これらすべての処置は、皮膚免疫細胞を活性化し、皮膚感染症を引き起こしたり、病気の進行に影響を与えたりする可能性があることが認められています。脱毛後の皮膚の状態に対する潜在的な副作用は、脱毛方法を選択する際に主要な考慮事項である必要があります。研究者らは、カミソリで剃った背側の皮膚に抗原をECで適用することでT細胞を介した免疫抑制を誘導する方法を説明し、さまざまなマウスモデルの免疫応答に対する効果を実証しました。抗原のECアプリケーションは、PAMPとともに、抗原特異的Tコントラサプレッサー細胞を誘導します。さらに、提示されたEC適用方法、特に抗原またはPAMPへの繰り返しの曝露では、副作用は懸念されません。

記載されたプロトコルは、特にマウスのような小動物において、この方法で信頼性と再現性のある結果を達成するためのさまざまな要因の重要性を強調しています。このアプローチの非侵襲的な性質は、通常、皮内または注射可能な免疫技術と比較して、副作用(痛み、感染、瘢痕化など)のリスクが低くなります。経皮的免疫はユーザーフレンドリーで、非臨床環境で簡単に投与できるため、より侵襲的な方法と比較してアクセシビリティとコンプライアンスが向上します。

表1:異なるマウス疾患モデルにおけるEC誘導性免疫応答の調節。 略語:ACD =アレルギー性接触皮膚炎;AD =アトピー性皮膚炎;Ag =抗原;CIA = コラーゲン誘発性関節炎;CHS = 接触過敏症;CFA = フロイントのアジュバントを完成させる;COLL II = II型コラーゲン;DNFB = 2,4-ジニトロフルオロベンゼン;DNP-BSA = ジニトロフェニルをウシ血清アルブミンに結合;EAE = 実験的自己免疫性脳脊髄炎;EC = エピカテナシー;LPS =リポ多糖;OVA =オボアルブミン;PAMP = 病原体関連分子パターン;PC-BSA = ウシ血清アルブミンに結合した肺炎球菌多糖類。Th1 = ヘルパーT型1リンパ球;Tc1 = T細胞傷害性1型リンパ球;TNCB = 2,4,6-トリニトロクロロベンゼン;TNP-Ig = 2,4,6-トリニトロフェニル標識マウス免疫グロブリン;Ts = Tサプレッサー細胞;Tcs = Tコントラサプレッサー細胞。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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プロトコル

この記事で紹介されているすべての実験は、ポーランドのクラクフにある動物実験に関する第1回および第2回 地方倫理委員会のガイドラインに従って承認され、実施されました。この手順は、特に麻酔薬としてのケタミン/キシラジンまたはイソフルランの投与、かみそりの刃を使用したマウスの皮膚の剃毛、剃った皮膚と両耳側への物質/ハプテンの適用、および末梢免疫器官の収集に関して、地元の推奨事項に準拠していました。この研究では、体重が20〜25gの6〜12週齢のCBA/J(H-2k)オスとメスのマウスを使用しました。使用した試薬や機器の詳細については、 資料表に記載されています。

1.動物の調理

  1. ハツカネズミを一緒に。孤立が彼らの気分に悪影響を及ぼすのを防ぐことが重要です。統計的有意性のために、グループごとに10〜12匹の動物を使用してください。

2. 操作エリアの準備

  1. 手術台の70%エタノール溶液で洗浄し、すべての処置の前後に行ってください。マウスの使用に無菌状態が必要な場合は、すべての操作をバイオセーフティキャビネット内で行ってください。

3. Th1を介したCHS反応におけるサプレッサー細胞(Ts)の誘導

注: この手順を 図 1A に示します。

  1. 当日は「0」でマウスにプロピレングリコール中の30%イソフルランを麻酔します。マウスを左手で持ち、体の背側を露出させます。右手で、灰色の石鹸をたっぷりの水で泡立て、肌になじませます。
    1. 滅菌済みのカミソリの刃を使用して、2cm²の皮膚領域をやさしく剃ります。皮膚を傷つけないようにしてください。皮膚病変があると、マウスはさらなる処置から失格となります。
      注:グレーの石鹸は、優しい野菜ベースから作られた天然の低刺激性製品です。乾燥肌や敏感肌を効果的に再生し、潤いを与えます。この石鹸には、人工着色料、合成香料、動物由来の成分は含まれていません。成分には、パルミン酸ナトリウム、パーム核酸ナトリウム、アクア(水)、グリセリン、タンポポ花/葉/茎抽出物、パーム酸、パーム核酸、塩化ナトリウム、プロピレングリコール、EDTA四ナトリウム、エチドロン酸が含まれます。グレーの石鹸は、刺激や乾癬を起こしやすい敏感肌やデリケートな肌向けに設計されています。問題のある肌を効果的にクレンジングし、過度の乾燥やつっぱり感を防ぎます。この石鹸はまた、刺激を和らげ、潤いを与え、より速い肌の再生を促進します。重要なのは、皮膚の保護バリアを損なわないことです。
  2. マウスをケージに入れます。髭剃り後、少なくとも6時間待ってから抗原を塗布し、皮膚を乾燥させて動物が洗浄するのを待ちます。
  3. 「+1」の日に、無菌のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に、抗原2,4,6-トリニトロフェニル標識マウス免疫グロブリン(TNP-Ig)の1 mg/mL溶液を調製します。10匹のマウスに対して1200μLの抗原容量を調製します。使用直前に溶液を2mLバイアルに混合します。TNP-Igは、バイアルをアルミホイルで覆って光から保護します。
    注:ビヒクル(DPBS)のみで処理されたマウスのCHS対照群を含めて、シェービングと剃ったスポットへの溶媒の塗布によって引き起こされる非特異的炎症反応を評価します。Ts誘導には、抗原特異性をテストするために、別のタイプの抗原を使用する必要があります。マウス血清からマウス免疫グロブリン(Ig)を調製し、TNPハプテンと結合させた(Supplementary File 1)。Ig分子あたり40 TNP(TNP40-Ig)の置換レベルの単一の調製物が、24,25全体で使用されました。
  4. 同日、マウスにプロピレングリコール中の30%イソフルランを麻酔します。100μLの抗原(ステップ3.3で調製)に1cm2 のガーゼパッチを浸して、以前に剃ったスポットに抗原を塗布します。これを薄いプラスチックパッチ(2cm²)で覆い、布製粘着テープで固定します。CHS 制御グループでは、DPBS のみを適用します。
    注:プラスチックパッチには30μmの透明なドキュメントスリーブを使用できます。布製粘着テープは、簡単に取り外し可能で、柔軟性があり、体型に適合し、空気と水蒸気の透過性を許容する必要があります。
  5. 「+5」の日に、プロピレングリコール中の30%イソフルランでマウスを麻酔します。角が丸い安全ハサミでパッチを丁寧にカットし、粘着テープをそっと剥がします。マウスが自由に動き、自然に皮膚を少なくとも4時間きれいにするのを待ちます。必要に応じて、抗原適用部位で再生した毛を剃りますが、通常は必須ではありません。
    注:粘着テープは、抗原投与の領域(ガーゼとプラスチック領域)でのみ切断し、包帯の端でのみしっかりと接着します。抗原を塗布する前に少なくとも4時間待ってから、皮膚を乾燥させ、動物が洗浄できるようにします。
  6. 「+5」の日には、手順3.3と手順3.4を繰り返します。
  7. 「+8」の日には、手順3.5を繰り返します。これにより、抗原への1週間の皮膚曝露が完了しました。この期間の後、マウスを使用してCHS反応の抑制をテストする-in vivo 活性モデル(ステップ6)または「養子移入IN」(ステップ8)または「養子移籍OUT」(ステップ9)でTs細胞のドナーとして機能するようにマウスを使用します。

4. Th1を介したCHS反応におけるコントラサプレッサーT細胞(Tcs)の誘導

注: この手順を 図 1B に示します。

  1. 「0」の日に、手順3.1〜3.2を実行します。
  2. 「+1」の日に、100μgのDPBS中に100μgの抗原TNP-Igと100μgのLPS(PAMPの例)の混合物を調製します。使用直前に溶液を2mLのバイアルで調製し、抗原が感光性の場合はバイアルをアルミホイルで包んで光から保護します。
    注:コントラ抑制(皮膚誘発性抑制の逆転)を評価するには、抑制のコントロール(Tsコントロールグループ)を含める必要があります。ここで、マウスは抗原TNP-Igのみで処理されます。さらに、DPBSのみ(CHSコントロール)およびLPSのみ(PAMPコントロール)で治療されたマウスは、免疫応答の非特異的調節の程度を決定するために含める必要があります。LPSは、免疫刺激性粒子26の一例である。免疫刺激装置の特異的な特性は、使用するマウスモデル、研究対象の免疫応答に関与する免疫細胞の種類、および調査中の物質の薬物動態によって異なります。
  3. 同日、マウスにプロピレングリコール中の30%イソフルランを麻酔します。前の剃った皮膚に1 cm2 ガーゼパッチを貼り、100μLの混合物を含む溶液(ステップ4.2で調製)で飽和させます。ガーゼを薄いプラスチックパッチ(2cm²)で固定し、布製絆創膏で所定の位置に貼り付けます。対照群では、DPBS(CHS制御)またはLPS(PAMP制御)、またはTNP-Ig単独(Ts制御群)を適用します。
    注:プラスチックパッチには30μmの透明なドキュメントスリーブを使用できます。布製粘着テープは、簡単に取り外し可能で、柔軟性があり、体型に適合し、空気と水蒸気の透過性を許容する必要があります。
  4. 「+5」の日に、手順3.5を実行します。
  5. 「+5」の日に、手順4.2〜4.3を繰り返します。
  6. 「+8」の日には、手順3.5を繰り返します。LPSと混合された抗原への皮膚曝露の1週間が終了しました。この期間に続いて、CHS反応- in vivo 活性モデル(ステップ6)でマウスを試験するか、「養子移植OUT」(ステップ10)でTcs細胞のドナーとして役立つように安楽死させます。

5. Th1を介したCHS反応(CHSの感作期)におけるTエフェクター細胞(Teff)の誘導

  1. 「0」日目に、マウスの胸部と腹部(2 cm×2 cmの領域)を灰色の石鹸と水で剃り、続いてカミソリの刃で剃ります。刺激がないことを確認するために、ハプテンを適用する前に皮膚を6時間休ませてください。
  2. 同じ日に、使用直前に、ガラスバイアルにハプテン溶液(5%)を調製し、光から保護するためにアルミホイルで覆います:アセトン - エタノール混合物中の2,4,6-トリニトロクロロベンゼン(TNCB)(比率1:3)。
  3. 同日、以前に剃ったスポットに150μLのハプテンを塗布してマウスを感作します。ネガティブコントロール群にビヒクルのみ(アセトン-エタノール混合物)を適用して、非特異的炎症反応を評価します。.動物をケージに戻す前に、皮膚が乾くまで30秒待ちます。
    注意: 手袋を使用してください。TNCBは、ほとんどの人に重度のアレルギー反応を引き起こします。

6. アクティブモデル:Th1媒介CHS中のTs細胞またはTcs細胞の試験

注: この手順を 図 2 に示します。

  1. ステップ3およびステップ4に従って、TsまたはTcs細胞を誘導します。この手順は、「0」日目から「+8」日まで続きます。
  2. 「+8」の日に、ステップ5に従ってTeff細胞の誘導を開始します。
  3. 4日後、誘発フェーズ(チャレンジ)を実行してCHS応答を評価します。簡単に言うと、耳の両側にTNCBを塗ります。次に、マイクロメーターで耳を測定して、耳の厚さを定量化します。このテストと他の可能なエンドポイントの詳細な説明は、他の場所で報告されています(Zemelka-Wiacek M. et al.27)。

7. ドナーマウス由来のTeff、Ts、またはTcs細胞の単離

  1. 手術台を70%エタノール溶液で滅菌する。バイオセーフティキャビネット内ですべての手順を実施して、無菌性を維持し、滅菌された器具を使用します。「+8」の日にTs、Tcs、Teff細胞を単離するには、ステップ3、4、および5でそれぞれ説明したEC免疫マウスを使用します。
    注:ドナーとレシピエントの比率は1:1にしてください。
  2. ケタミン (90-120 mg/kg) とキシラジン (5-10 mg/kg) の混合物の腹腔内 (i.p.) 注射でドナーに麻酔をかけます。マウスが少なくとも5分間完全に麻酔されていることを確認してください。
  3. 麻酔をかけたマウスの腹部全体を70%エタノールで消毒し、腹部層(3〜4 cm)を切開して腹腔を露出させます。補助リンパ節と鼠径リンパ節 (ALN) と脾臓 (SPL) を滅菌鉗子で分離し、1% ウシ胎児血清 (FBS) を補給した滅菌 DPBS で満たされたチューブに分離します。すべてのドナーからのALNを1つのバイアルにプールし、SPLを別のバイアルにプールし、バイアルを氷上に保ちます。各腋窩には2つの腋窩リンパ節があり、1つの鼠径リンパ節は3つの血管に隣接する股関節領域にあります。SPLは、体の左側、腸と胃の後ろに配置されます。
    注:バイオセーフティキャビネットの下の滅菌ツールを使用して、滅菌状態を維持してください。この手順の後、マウスは施設で承認されたプロトコルに従って安楽死させなければなりません。
    1. 2つの顕微鏡スライドのつや消しの端の間に組織をつぶします。細胞懸濁液を70μmの細孔サイズの細胞ストレーナーで濾します。
  4. 1% FBSを添加した30mLのDPBSで細胞をすすぎます。300 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を取り除き、細胞ペレットを1〜5mLのDPBSに再懸濁します。
  5. 血球計算盤とトリパンブルーを使用して細胞の生存率をカウントします。10 μLの細胞懸濁液を90-990 μLのトリパンブルーと混合し、細胞数に基づいて容量を調整します。この希釈係数を生存率の計算に組み込みます。
  6. ALNとSPLの混合物を調製します(比率1:1)。細胞数を厳守する:1% FBSを添加したDPBS1 mLおよびDPBS1 mLに7 x 107 Teff細胞/レシピエントを1 mLのDPBSにレシピエント1人あたり最大5 x 10 7 TsまたはTcs細胞1個使用します。すべての細胞集団のドナー-レシピエント比を1:1に保ち、ドナー-DPBS比も1:1に保ちます。バイアルを細胞と一緒に氷の上に置いておきます。
    注:さらなる in vitro 実験の実施には、細胞ドナーの数に比例して増加する必要があります。
    注:さらに、単離されたTeff、Ts、およびTcs細胞は、表現型やサイトカイン分泌評価などのフローサイトメトリーを使用して、追加の精製または分析を受けることができます。また、細胞増殖能力を探索したり、培養上清中のサイトカインレベルを定量化したりするために、細胞培養を開始することも可能です。さらなる実験を行うには、それに比例して細胞供与者の数を増やす必要があります。

8. 養子縁組の移管IN:Th1媒介CHSにおけるTsの試験

注: この手順を 図 3 に示します。滅菌して作業し、すべての手順の前後に70%エタノール溶液を使用します。すべての細胞操作がバイオセーフティキャビネット内で行われることを確認し、無菌性を維持し、滅菌された器具を使用してください。

  1. ステップ3とステップ7に従って、Ts細胞(ドナー)を誘導および単離します。細胞を30mLのDPBSですすいでください。300 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を除去し、細胞ペレットをレシピエントあたり200 μLのDPBSに再懸濁します(ドナーとレシピエントの比率は1:1)。
  2. レシピエント(ナイーブ同系マウス):ケタミン(90-120 mg / kg)とキシラジン(5-10 mg / kg)の混合物の腹腔内(i.p.)注射でレシピエントを麻酔します。.マウスが少なくとも5分間完全に麻酔されていることを確認してください。
  3. 200 μL中の1-5 x 107 Ts細胞の調製混合物(ステップ8.2)を麻酔レシピエントに静脈内(i.v.)注射します。
  4. 同日に、Th1を介したCHS反応を誘導します。簡単に言うと、ステップ5.1-5.3で説明したTeff細胞(感作期)を誘導します。4日後、ステップ6.3で説明した誘発フェーズ(チャレンジ)を実行して、CHS応答を評価します。

9. 養子転院OUT:Th1媒介CHSにおけるTsの試験

  1. 手順3、5、および7に従って、TsおよびTeff細胞(ドナー)を誘導および単離します。単離したTsとTeffを2つの別々のバイアルに保管してください。Teff細胞を「Tsテストグループ」用と「CHSコントロール」用の2つのバイアルに分割します。
    注:滅菌状態で作業し、すべての手順の前後に70%エタノール溶液を使用してください。すべての細胞操作がバイオセーフティキャビネット内で行われることを確認し、無菌性を維持し、滅菌された器具を使用してください。Teff 細胞のみが投与されるレシピエントの対照群を含めます (「CHS コントロール」)。このグループでは、ドナーと受信者の比率が1:1になるように、追加のドナーを使用する必要があります。結果の質を高めるために、ドナーからEC溶媒溶液で処理したコントロール細胞をレシピエントに追加する必要があります。このアプローチには多くのマウスが必要であり、3Rの原則(Reduce、Refine、Replace)に準拠していないため、レシピエントとドナーのグループを追加する決定は慎重に計画する必要があります。
  2. 「Ts test group」の Teff セルに Ts セルを追加します。「CHSコントロール」バイアル中のTeff細胞に適切なDPBSを添加します。
    注:レシピエントごとに1〜5 x 107 Tsセルと7 x 107 Teffセルの数を保持します。
  3. すべてのバイアルを穏やかに混ぜます。バイアルをウォーターバス(37°C)に30分間入れ、5分ごとに穏やかに混合します。
  4. 細胞の各バイアルを、1% FBSを添加した30 mLのDPBSですすいでください。300 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清をデカントし、細胞のペレットを200 μLのDPBS/レシピエントに再懸濁します。
  5. 各細胞懸濁液を70 μmの細孔細胞ストレーナーに通します。必要に応じて、200 μLのDPBS/レシピエントの容量を調整します。
  6. レシピエント(ナイーブ同系マウス):ケタミン(90-120 mg / kg)とキシラジン(5-10 mg / kg)の混合物の腹腔内(i.p.)注射でレシピエントを麻酔します。.マウスが少なくとも5分間完全に麻酔されていることを確認してください。
  7. 調製した細胞の静脈内(i.v.)注射を投与します。
  8. 同日、ステップ6.3で説明したCHS(チャレンジ)の誘発フェーズを誘導します。「ネガティブコントロール」を含め、CHSチャレンジのみを実施します。

10. 養子縁組OUT:Th1媒介CHSにおけるTcsの試験

  1. ステップ3〜5、およびステップ7に従って、Ts、Tcs、およびTeff細胞(ドナー)を誘導および単離します。
    注:滅菌状態で作業し、すべての手順の前後に70%エタノール溶液を使用してください。すべての細胞操作がバイオセーフティキャビネット内で行われることを確認し、無菌性を維持し、滅菌された器具を使用してください。レシピエントの2つの対照群を含めます:Teff細胞のみを投与する「CHSコントロール」と、Teff細胞をTs細胞のみとインキュベートする「Tsコントロール」です。これらのグループでは、追加の寄付者を使用して、寄付者と受信者の比率を 1:1 に維持します。
  2. 単離されたTs細胞とTcs細胞を別々のバイアルに保管してください。Teff細胞を「Tcsテストグループ」、「Tsコントロール」、および「CHSコントロール」の3つのバイアルに分割します。
  3. 最初のインキュベーション:(a)「Tcsテストグループ」の場合、Ttcs細胞をTeff細胞に添加します。(b)「Tsコントロール」および(c)「CHSコントロール」については、Teff細胞に適切な量のDPBSを添加します( 表2を参照)。
    注:レシピエントごとに1〜5 x 107 Tcf細胞と7 x 107 Teff細胞の数を保持します。
  4. すべてのバイアルを穏やかに混ぜます。水浴(37°C)に30分間入れ、5分ごとに穏やかに混合します。
  5. 細胞の各バイアルを、1% FBSを添加した30 mLのDPBSですすいでください。300 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清をデカンタントし、細胞のペレットを1 mLのDPBSに1 mLに再懸濁します。セル混合物とDPBSの比率を1:1に維持します。
  6. 2回目のインキュベーション:(a)「Tcs試験群」では、インキュベート済みのTeff細胞とTcs細胞の混合物にTs細胞を添加します。(b)「Tsコントロール」では、プレインキュベートしたTeff細胞とDPBSとの混合物にTs細胞を添加します。(c)「CHSコントロール」では、インキュベート済みのTeff細胞に適切なDPBSを添加します。
    注:受信者ごとに1〜5 x 107 Tsセルの数を保持します。すべての実験グループ(a、b、c)でインキュベーションを実施し、洗浄および遠心分離手順中の細胞損失の均一性を確保します。
  7. すべてのバイアルを穏やかに混ぜます。水浴(37°C)に30分間入れ、5分ごとに穏やかに混合します。
  8. 細胞の各バイアルを30mLのDPBSですすいでください。300 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清をデカントし、細胞のペレットを200 μLのDPBS/レシピエントに再懸濁します。
  9. 各細胞懸濁液を70 μmの細孔細胞ストレーナーに通します。必要に応じて、200 μLのDPBS/レシピエントの容量を調整します。
  10. レシピエント(ナイーブ同系マウス):ケタミン(90-120 mg / kg)とキシラジン(5-10 mg / kg)の混合物の腹腔内(i.p.)注射でレシピエントを麻酔します。.マウスが少なくとも5分間完全に麻酔されていることを確認してください。
  11. 調製した細胞の静脈内(i.v.)注射を投与します。
  12. 同日、ステップ6.3で説明したCHS(チャレンジ)の誘発フェーズを誘導します。「ネガティブコントロール」を含め、CHSチャレンジのみを実施します。

表2:TCS「transfer OUT」中の細胞インキュベーションのスケジュール。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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結果

この研究では、皮膚 を介して 単独で適用される抗原、またはPAMPと組み合わせて適用される抗原が、それぞれCHS反応を調節するTs細胞またはTcs細胞を誘導できるかどうかを調べます。EC を介して CBA/Jマウスを100μgのTNP-IgまたはTNP-Igと100μgのLPSで免疫すると、それぞれTs細胞またはTcs細胞が誘導されます。その後、マウスを5%TNCBで感作し、4日後に同じハプテンで挑戦しました。反応は、チャレンジの前後に耳の腫れを測定することによって評価されました。各実験には、非特異的炎症反応を評価するために使用されるネガティブコントロールと、CHS応答の誘導を検証するCHSコントロールがあります。

図4は、CHS誘導前にTNP-Igに曝露されたマウスがCHSの有意な減少を示したことを示しています(図4A、Ts試験群 vs.CH...

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ディスカッション

この調査は、BALB/c、C57BL/6、HLADR4-Tg、DBA 1、B10.PL、SJLなどの多くのマウス系統を用いて、多くの異なる動物モデルを用いて行われ、割り当てられた抗原によるEC免疫化が、耐性を生み出し、望ましくない免疫応答を制御するための汎用性が高く、潜在的に無限の手段として役立つことを示しています。現在のプロトコルでは、(1)CHSの求心性および遠心性期の両方で免疫調節を評価するのに役立つ「養子移行IN」、および(2)遠心性期におけるその影響を特異的に評価する「養子移行OUT」の2つの細胞移植モデルの概要が示されています。さらに、すでに感作されたマウスにTs細胞を注入すると、CHS7,28がダウンレギュレーションされることが実証されています。この仮定は、多発性硬化症の患者グループにおける臨床試験の出発点として採用されました29,30...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、ポーランド科学研究委員会助成金3 PO5B 091 25、2PO5A 204 29、および国立科学センターN N401 3554 33からMSへの助成金によって支援されました。グラフはGraphPad Prismソフトウェア10.2.3を使用して描画し、図1〜3はBioRenderで作成しました。Zemelka-Wiacek、M.(2025):(1)https://BioRender.com/3ux2px;(2)https://BioRender.com/s0y8zs7;(3)https://BioRender.com/0qziglw。著者らは、マウスのコロニーの世話をしてくれたドロタ・ウォニアックに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2,4,6-トリニトロクロロベンゼン(TNCB)東京化学工業株式会社、日本C0307
2,4,6-トリニトロフェニル共役マウス免疫グロブリン(TNP-Ig)生物医学科学部、ヤギェウォ大学医科大学(クラクフ、ポーランド)
アセトン(ACS試薬、99.5%)メルクKGaA、ダルムシュタット、ドイツ179124
アルミホイルメルクKGaA、ダルムシュタット、ドイツZ185140  
分析的バランス&注;サトリウス計量技術有限会社(ドイツ、ゲッティンゲン)PRACTUM224-1、29105177
牛血清アルブミン(BSA)メルクKGaA、ダルムシュタット、ドイツA9418
CBA/J(H-2k) ヤギェウォ大学医科大学保健科学部生物医学講座の育種ユニット(クラクフ、ポーランド)
セルストレーナー、孔径70 & MU;mBIOLOGIX、中国15-1070
使い捨てピペット容量:5 mL、10 mL、25 mLメルクKGaA、ダルムシュタット、ドイツZ740301、Z740302、Z740303
ダルベッコ&プライム;リン酸塩緩衝生理食塩水(DPBS)サーモフィッシャー・サイエンティフィック、およびアメリカ合衆国マサチューセッツ州ウォルサム14190144
エッペンドルフ セーフロックチューブ 1.5mlエッペンフォルフ、ドイツ30120086
エッペンドルフ・セーフロックチューブ、2.0mlエッペンフォルフ、ドイツ30120094
エタノール100%(絶対アルコール)メルクKGaA、ダルムシュタット、ドイツ1.07017
エタノール96%メルクKGaA、ダルムシュタット、ドイツ1.59010
胎児用ウシ血清(FBS)サーモフィッシャー・サイエンティフィック、およびアメリカ合衆国マサチューセッツ州ウォルサムA3160802
ガラス顕微鏡スライド(サンドブラスト単一フロステッド)サーモサイエンティフィック、ニューハンプシャー州ポーツマス、アメリカ合衆国421-004T
グラフパッドプリズムグラフパッド・ソフトウェア株式会社v. 10.2.3
グレーソープ(ビアリー・イェレン石鹸バー)オストジェスカトのポレナ(オストジェス);w, プロデューセント・ヘミイ・ゴスポダルチェイ Sp. Z.o.o., Sp. K., ポーランド163057
血球計VWR、アヴァントール、アメリカ合衆国612-5719
インキュベーターヘラセル150iサーモ・エレクトロン LED Gmbh、ドイツ41071068
イソフルラン(エアラン)バクスター、イリノイ州ディアフィールド、アメリカ合衆国8AGG9623
ケタミン 100 mg/mL、注射用溶液Biowet Pulawy Sp. z o.o.、ポーランド・プラウィ猫。#利用不可
遠心分離機(ヘレウス・フレスコ21)サーモ・サイエンティフィック、ドイツ75002425
実験用遠心分離機(ヘレウス・メガフュージ 1.0R) サーモ・サイエンティフィック、ドイツB00013899
リポ多糖(LPS)メルクKGaA、ダルムシュタット、ドイツL-8274
マスク(FFP2)VWR、ペンシルベニア州ラドナー、アメリカ合衆国111-0917
マイクロメーター東京・三豊代市193-111
対物レンズ付き顕微鏡ライカ・マイクロシステムズCMS GmbH、ドイツDM1000、294011-082007
プロピレングリコール チェンプル、ピエカリー figure-materials-1カミソリの刃VWR、ペンシルベニア州ラドナー、アメリカ合衆国PERS94-0462
透明文書スリーブ30およびマイクロ;mスキーマ5906961126542
トリパンブルーメルクKGaA、ダルムシュタット、ドイツT8154
無菌チューブ15mLメルクKGaA、ダルムシュタット、ドイツCLS430055(コルニグ)
チューブ50mL、滅菌メルクKGaA、ダルムシュタット、ドイツCLS430290(コーニング)
バイアル、スクリュートップ、透明ガラス(バイアルのみ)22mLメルクKGaA、ダルムシュタット、ドイツ27173
ビスコプラスト・ポロヴィス、シルク接着剤、5×0.0125m3Mポーランド、ナダルジン、ポーランド7100231620
ウォーターバス AJLエレクトロニック、ポーランドLW102
注射用のキシラジン(キシラパン 20 mg/mL)溶液Vetoquinol Biowet Sp. z o.o.、ゴルジュフ・ヴィエルコポルスキ、ポーランド猫。#利用不可

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