トランスレーショナルリサーチのためのハイスループット自動マルチプレックス免疫蛍光アッセイ(英語)

サマリー

このレポートでは、自動スライドステーナーでのマルチプレックス免疫蛍光(mIF)アッセイの自動化プロトコルについて説明します。これは、標準的なハイスループット組織オートステイナーおよびホールスライド蛍光イメージャーでの空間プロテオミクスの高い再現性を実証しており、トランスレーショナルリサーチにおける多数の組織スライドにわたるカスタムmIFアッセイに最適です。

要約

マルチプレックス免疫蛍光法(mIF)は、1つのセクション内の複数のタンパク質バイオマーカーを可視化することで、組織サンプルの詳細な空間分解分析を可能にする高度な技術です。しかし、ほとんどのmIFテクノロジーは、マルチプレックス化時に感度とスループットの間に大きなトレードオフに直面しており、複数の組織切片にわたって低存在量のバイオマーカーを確実に検出するには重大な制限が生じています。mIFの新しいアプローチでは、抗体にリンクされた独自のDNAバーコードを使用し、これを並列の単一分子増幅メカニズムで増幅します。この方法は、臨床グレードの免疫組織化学(IHC)に匹敵する染色品質を達成し、高いマルチプレックス機能とハイスループットのホールスライドイメージングを提供します。このアッセイでは、組織上のDNAバーコード付き抗体のカクテルを増幅し、その後、検出ステップを連続して行い、サイクルごとに4つの蛍光標識オリゴヌクレオチドを視覚化します。したがって、このプロセスにより、組織サンプルごとに8つ以上のバイオマーカーを検出できます。この方法の主なステップには、自動組織調製、DNAバーコードで標識された一次抗体の適用、シグナル増幅、検出、イメージング、シグナル除去の反復サイクルが含まれます。画像取得に続いて、AIで強化された空間画像データサイエンスプラットフォームを使用した画像レジストレーションとシングルセル解析が行われます。この研究では、プロトコルをホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)多組織マイクロアレイ(TMA)に適用しました。これには、扁桃腺、黒色腫、結腸、および三重のリンパ節コアが含まれます。高度なmIFテクノロジーは、腫瘍反応、腫瘍微小環境、および免疫ランドスケープについてより多くの洞察を提供します。感度、マルチプレックス機能、イメージングスループットの間の固有のトレードオフを克服することで、研究者は、治療応答の困難な分子シグネチャとバイオマーカーの不均一性を理解することを目指すことができるようになりました。

概要

高度にマルチプレックス化された免疫蛍光法(mIF)は、単一の^{組織切片1,2}内の複数のタンパク質バイオマーカーを同時に可視化することを可能にすることにより、組織分析の分野に革命をもたらしている高度な技術です。この機能は、比類のないレベルの詳細と空間分解能を提供し、これは多くの場合、複数の空間スケールにわたる組織微小環境内の複雑な形態を持つ細胞タイプ間の相互作用を理解するために重要です³。この技術は、腫瘍バイオマーカー、タンパク質薬物標的、局所免疫およびチェックポイント状態、異なる細胞タイプ間の相互作用、さらには組織内の薬物代謝に関連する細胞内共局在パターンを共局在化するために使用できる腫瘍学研究において特に価値があります^4,5,6。

その可能性にもかかわらず、ほとんどのmIFテクノロジーは、特に多重化機能と感度とスループットのバランスをとる際に、依然として大きな課題に直面しています。この制限は、HER2 や PD-L1 ^7,8,9 など、非常に低い発現を示す可能性のある臨床バイオマーカーの検出にとって特に重要です。その理由を理解するには、mIFの他のモダリティを理解することが不可欠です。これらの従来の方法は、より洗練されたmIFプラットフォームへの道を開きましたが、それらには独自の利点と制限があります。

直接免疫蛍光法(DIF)は、蛍光色素に直接結合した抗体、または蛍光色素を動員できるオリゴヌクレオチド¹⁰を使用します。この方法はマルチプレックス化が容易ですが、感度が低く、組織の背景や染色アーチファクトからのシグナルの分解が困難です。

間接免疫蛍光法(IIF)は、一次抗体に結合する二次抗体を使用します。これにより、プライマリベースのDIFと比較して信号が増加しています。改良されたフローセル設計と組み合わせることで、シーケンシャルIIFは1回のアッセイで最大40のバイオマーカーを検出できます^2,11。しかし、これらは依然として、免疫組織化学(IHC)技術に見られるような酵素ベースのシグナル増幅戦略と比較して、感度が相対的に不足しています。

酵素触媒に基づく免疫蛍光法は、発色性(DAB)または蛍光色素沈着(チラミドシグナル増幅(TSA)など)に西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を使用するIHC法で最も頻繁に見られます。これらのアッセイは同じ触媒酵素に基づいているため、検出感度は類似しており、マルチスペクトルTSAベースのmIFアッセイは臨床アプリケーションに適しています^2,12。DNAベースのシグナル増幅の利点は、優れたシグナル増幅とモジュール性を維持しながら、高度なマルチプレックス化が可能なことです。対照的に、HRP ベースの分析法はモジュール化が難しく、最適化が難しいため、追加のパネル開発および試験サイクルが必要になります。

DNAバーコード付き抗体免疫蛍光
ここで示すmIFアッセイでは、DNAポリメラーゼを使用してDNAバーコード付き抗体を同時に増幅し、その後、イメージングラウンドごとに4つの蛍光オリゴヌクレオチドを使用したレポータープローブの染色と脱染色のサイクルを行います(図1)。

図1:マルチプレックス免疫蛍光アッセイプロトコルの図解。 バーコード標識抗体を1ステップで添加し、同時にバーコードを増幅します。各サイクルに4つの蛍光プローブのグループが追加されるため、4つのマーカーを一度に視覚化できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

このシングルラウンド抗体の添加とシングルステップ増幅により、アッセイプロトコルが大幅に簡素化されます。このプロセスは、自動化されたハイスループット染色およびスキャンシステムによって促進され、臨床試験で利用される多数のサンプルでスライド間およびバッチ間で再現性のある結果が得られます¹³。

この技術の主な利点の1つは、高感度を維持しながら広範な多重化^{を可能にする能力です2}。また、このワークフローにより、イメージングスループットを高く保つことができるため、臨床試験における高度にマルチプレックス化されたmIFテクノロジー(> 8バイオマーカーなど)の主要な制限の1つに対処します。これは臨床研究では特に重要であり、患者間での低存在量の薬物標的(低HER2など)の微妙な変動が治療反応に関する重要な洞察を提供する可能性があります。

これらの主要な特性に加えて、このアッセイは、パネル設定可能性、ハイスループットのホールスライドイメージング機能、および細胞内プロセスとコンパートメント、およびマクロファージと樹状細胞に関連する細胞突起の研究に必要な光学分解能も提供します。複雑な細胞表現型を複数の空間スケールで調査できることは、イメージングマスサイトメトリー(IMC)ベースの方法と比較した場合の光学イメージングの重要な利点です²。

この研究では、8プレックスmIFアッセイのプロトコルを、オートステイナーとホールスライドスキャナーを使用して提示します。このアッセイには、CD3、CD4、CD8、CD68、FOXP3、PD-1、PD-L1、および汎サイトケラチン¹⁴の8つの一次抗体のパネルが含まれています。このマーカーパネルにより、腫瘍組織の免疫プロファイリングと、腫瘍または間質環境で見つかった細胞の同定が可能になります。このプロトコールでは、初期染色とプローブ交換ラウンドに自動スライドステイナーを使用し、染色とイメージングは2日以内に完了できます。mIFアッセイの検証方法と、得られた画像の解析方法も示されています。

プロトコル

すべての実験は、機関のヒト研究倫理委員会のガイドラインに従わなければなりません。このプロトコルで採用されたすべての組織切片は、外部の組織提供者から入手しました。

1. 組織サンプル調製

1. mIFアッセイを使用して染色するFFPE組織ブロックを選択します。FFPE組織スライドを使用する場合は、サンプルの厚さが3〜5 μmで、正に帯電したスライドガラスに取り付けられ、最終結果に悪影響を与える可能性のあるしわやその他の裂け目がないことを確認してください。
   注:最良の結果を得るには、2か月以上前に切片化された組織サンプルの染色は避けてください。また、10年以上保管されているブロックや、見た目が乾燥しているように見えるブロックは避けてください。
2. FFPE組織ブロックを使用する場合は、ミクロトームを使用して必要な数の組織スライドを4μmの厚さで切断し、プラスに帯電したスライドガラスにスライドを取り付けます。最も一貫した結果を得るには、すべてのスライドを同じ向きに取り付けます。ティッシュにシワや破れがないことを確認してください。
3. サンプルをすぐに染色しない場合は、窒素下のスライドボックスに最大2か月間保管してください。

2. 初期設定のための補助試薬および一次抗体の登録

1. オートステイナーソフトウェア内で、画面上部の[試薬セットアップ]タブに移動します。 [追加 ]をクリックして、新しい試薬を追加します。
2. 染色および交換アッセイでは、 表1に記載されている情報に従って、9つの試薬コンテナを使用します。たとえば、Wash Bufferという名前の最初の試薬(略称ISPWsh1)に使用するには、次の手順に従います。タイプとして [補助] を選択し、[互換性のあるバルク] の下に *BWash と DI の両方がリストされていることを確認します。保存する前に 、[優先] チェックボックスをオンにします。
3. 残りの補助試薬についても、 表1に記載されている名前と略称を使用して、このプロセスを繰り返します。
   1. 増幅溶液試薬(ULTAmp1)は、ボンドウォッシュとは互換性がありません。この試薬セットアップウィンドウで、 *BWash を選択し、 << ボタンをクリックして、この試薬を互換性のある試薬リストから使用可能な試薬セクションに移動してください。増幅溶液試薬の適合試薬としてBond Washを除去しないと、アッセイの染色性能が大幅に低下する可能性があります。
4. すべての試薬コンテナを登録したら、最初のランを開始する前に研究検出キットを作成します。検出キットには、30 mL滴定容器が1つ必要です。
5. 30 mL滴定容器を検出キットに加えます。2つが分離するのを防ぐために、滴定容器をワンドにテープで固定します。
6. 検出キットの左側にあるバーコードをスキャンします。次のポップアップウィンドウで、検出キット(例:InSituPlex Kit)に名前を付けます。有効期限を登録日から10年に設定します。
   注:ここで設定する有効期限は、試薬に記載されている日付ではなく、滴定容器内の試薬の有効期限です。有効期限を遠い将来に設定することで、キットが不必要に期限切れにならないようにします。
7. キットの最初の試薬の位置については、ドロップダウンメニューから試薬として Wash Buffer を選択します。
8. この試薬位置の バーコードフィールド をクリックし、テープで留められた30 mL滴定容器のバーコードをスキャンして、この容器を洗浄バッファーとして登録し、試薬容器を検出ワンドにリンクします。
9. 滴定コンテナがキットにリンクされたら、[ Add ]ボタンをクリックして保存し、ポップアップウィンドウを閉じます。
10. 滴定容器に30 mLの1x Bond Washを入れ、染色の合間に4°Cで冷蔵保存します。

表1:セットアップ用の補助試薬。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

3. プロトコルの初期設定

1. すべての試薬コンテナが正常に登録されたら、autostainerソフトウェア画面の上部にある[Protocol Setup]タブに移動します。
2. 現在実行中のソフトウェアのバージョンを確認するには、画面右上の ロゴ をクリックします。表示されるポップアップには、ソフトウェア情報の見出しの下に現在インストールされているソフトウェアのバージョンが表示されます。
3. ソフトウェアがバージョン7.0以降の場合、染色プロトコルのテンプレートがプリインストールされています。画面の下部で、[優先ステータス] の選択が [すべて] に設定されていることを確認します。テンプレートプロトコルに *ISP Staining Assay という名前を付けます。以前のバージョンのソフトウェアの場合、プロトコルは 表 2 にあります。
4. *ISP Staining Assay を右クリックし、プロトコルをコピーします。表示されるポップアップウィンドウで、プロトコルの名前を Staining Assay 1 と略して (ISP_IHC1) に変更します
5. 優先検出システムの下で、ステップ 2.6 の試薬の初期セットアップ中に作成されたものを選択します。

表2:マルチプレックス免疫蛍光染色プロトコルのプロトコル。 ※MARKERは抗体溶液、Wash BufferはBOND Wash溶液に対応しています。他のすべての補助試薬には、対応する名前のキットコンポーネントがあります。このプロトコルは、ソフトウェアバージョン7.0以降、BXD39以降と互換性があります。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

4. 試薬のセットアップ

1. 抗体コンジュゲート、増幅酵素、交換開始剤、交換中和剤を除くすべてのキット試薬を室温で解凍します。残りのキットコンポーネントは、使用するまで-20°Cで保管してください。
2. まだ行っていない場合は、ステップ2.3で定義した各試薬に新しい滴定コンテナを登録します。それぞれに新しい滴定インサートを配置します。
3. ステップ 2.6 で登録した研究検出システムを使用し、関連する洗浄バッファー容器に 1x Bond 洗浄溶液を 30 mL 充填していることを確認します。各試薬の滴定容器をシステムに入れます。
4. Ab希釈液を対応する容器に調製します。必要容量は350+(150μL×スライド枚数)で、付属の抗体希釈液で構成されています。解凍後にバッファーをボルテックスして混合します。
5. 抗体染色液1容器に抗体染色液を調製します。提供された抗体希釈液ですべての抗体を1:100に希釈して加えます。必要量は350+(150μL×スライド枚数)です。抗体ストックや完全な抗体染色溶液をボルテックスせず、ピペッティングのみで混合してください。
6. 増幅前ミックス容器に増幅前ミックスを調製します。必要容量は350+(150μL×スライド数)で、提供されているプレアンプミックスで構成されています。解凍後にこの溶液を渦巻きにします。
7. 増幅溶液容器に増幅溶液を調製します。必要容量は350+(150μL×スライド枚数)で、増幅酵素を増幅バッファーで1:10に希釈したもので構成されています。増幅酵素や完成した増幅溶液をボルテックスせず、ピペッティングのみで混合してください。
8. 核対比染色を核対比染色容器に調製します。必要容量は350+(300μL×スライド枚数)で、超純水で1:100に希釈した付属の核対比染色液で構成されています。ボルテックスで混ぜます。
9. 最初のイメージングに対応する蛍光プローブミックスを蛍光プローブ容器に調製します。必要容量は350+(450μL×スライド枚数)で、蛍光プローブ1溶液をプローブバッファー内で1:20に希釈したもので構成されています。解凍後の成分と最終的な完全な混合物をボルテックスします。
10. すべての試薬が準備され、対応する容器に入れられたら、試薬の体積を測定するために、完全な試薬ワンドをソフトウェアに入れます。

5. セットアップを実行する

1. すべての試薬の準備ができたら、ソフトウェアの上部にあるスライドセットアップタブに移動し、 New Study ボタンを選択します。必要に応じて、スタディID、スタディ名、およびスタディコメントを追加します。例として 、図 2 を参照してください。
2. 分注量で、調製プロトコルとして 150μL と *Dewax 4ステップ を選択します。*Dewax 4 steps がドロップダウンメニューに表示されない場合は、Protocol Setupメニューでこのプロトコルを探し、 Preferred ボックスにチェックを入れてください。 [OK]を押します。
3. スタディが作成されたら、スライド設定画面の右側にある[ スライドの追加 ]ボタンを選択します。[スライドのコメント] で、スライドに一意の名前を付けます。
4. この画面の追加フィールドでは、[Tissue Type] を [Test Tissue] に設定し、分注量を 150 μL に設定し、左側のドロップダウンで [Staining] モードを [Single] に、右側のドロップダウンで [Routine] にします。プロセスで IHCを選択し、マーカーを抗体染色溶液とします。
5. 「スライドの追加」ウィンドウのプロトコールセクションで、染色には 「Staining Assay 1 」を選択し、調製には 「* Dewax 4 steps 」を、HIER として「ER2」を「*HIER 20 min」 を選択します。Enzymeプロトコルは残ります *----.これが完了したら、[ スライドの追加] をクリックします。例として 、図 2 を参照してください。
6. スタディで実行するスライドの数に応じてこのプロセスを繰り返し、追加された各スライドのスライドコメントフィールドが更新され、後で一意に識別できるようにします。すべてのスライドを追加したら、[スライドの追加] ウィンドウを閉じ、すべてのラベルを印刷して、対応する組織切片に貼り付けます。
7. 各スライドをトレイにセットし、各セクションの上にカバータイルを配置してから、トレイをソフトウェアにロードします。試薬とスライドを追加したら、ソフトウェアの右側にある 対応するオートステイナー を選択します。これを選択すると、3つのスライドトレイすべてと、バルク試薬や試薬調製中に追加された試薬など、ソフトウェア上のすべての試薬の情報が表示されます。
8. バルク試薬容器が充填されていること、および廃液容器に実行を完了するのに十分な容量が残っていることを確認してから、 再生 ボタンを押して実行を開始します。
9. 各ランの完了には約5時間15分かかります。停止時間をメモし、プロトコールが完了したらすぐにスライドをオートステイナーから取り除いてください。

図2:ソフトウェアのプロンプト (A)Autostainerソフトウェアの新しいスタディプロンプトで、マルチプレックス免疫蛍光(mIF)染色プロトコルの正しい設定を示しています。(B)ソフトウェアにスライドプロンプトを追加し、mIF染色プロトコルの正しい設定を表示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

6. イメージング

1. 染色プロトコールが完了したら、封入剤中の染色スライドとカバースリップを取り出します。封入剤を暗闇で硬化させ、カバーガラスが所定の位置にしっかりと固定されるまで待ちます(通常は1時間以上、一時停止ポイント)。
2. 蛍光顕微鏡またはホールスライドスキャナーで、アッセイに適したフィルターを装着した画像スライド。このアッセイで使用される色素は、通常、DAPI、FITC、TRITC、Cy5、およびCy7のフィルターに適合します。
3. 画像は 図 3A のように表示されます。組織のすべての領域に適切に焦点を合わせ、信号が適切な強度レベルで表示されることを視覚的に確認します(露出過多/露出不足ではありません)。必要に応じて、異なる露出設定でスライドのイメージを再作成します。
4. イメージング後、追加のイメージングラウンドが必要な場合は、カバーガラスが自然に剥がれるまでスライドを1x PBSに浸します。(一時停止ポイント)

7. 取引所プロトコルの初期設定

1. ソフトウェアがバージョン7.0以降の場合、autostainerプロトコルのテンプレートがプリインストールされています。画面の下部で、[優先ステータス]の選択が[すべて]に設定されていることを確認します。テンプレート・プロトコルの名前は *ISP Signal Exchg です。以前のバージョンのソフトウェアの場合、プロトコルは 表 3 にあります。
2. *ISP Signal Exchgを右クリックし、プロトコルをコピーします。表示されるポップアップウィンドウで、プロトコルの名前を「Exchange Protocol 1」に短縮ISPEXCH1に変更します。続行する前に、Preferredボックスがオンになっていることを確認し、ステップ2.6で設定したものと同じキット名を割り当てます。

表3:マルチプレックス免疫蛍光シグナル交換プロトコルのプロトコル。 Wash BufferはBOND Wash溶液に対応しています。他のすべての補助試薬には、対応する名前のキットコンポーネントがあります。このプロトコルは、ソフトウェアバージョン7.0以降、BXD39以降と互換性があります。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

8. Exchange プロトコルのセットアップと実行

1. 交換バッファーを室温で解凍します。交換中和剤と交換開始剤は、使用するまで-20°Cに保ちます。交換プロトコルを実行するには、2つの試薬滴定容器と検出キットが必要です。
2. 対応する容器に交換溶液を準備します。必要容量は350+(450μL×スライド枚数)で、交換バッファー中で1:500に希釈した交換開始剤で構成されています。交換酵素や完成した交換溶液をボルテックスせず、ピペッティングのみで混合してください。
3. 蛍光プローブ2容器に第2の蛍光プローブを混合して調製する。必要容量は350 + (450 μL x スライド数) で、プローブバッファー 2 内で 1:20 に希釈した蛍光プローブ 2 溶液と 1:40 に希釈した交換中和剤で構成されています。蛍光プローブミックスとプローブバッファーはボルテックス化できますが、交換中和剤と最終結合溶液はピペットで混合する必要があります。
4. すべての試薬が準備できたら、フルワンドをオートステイナーに置き、試薬を機械でディップテストします。
5. 手順 5 に従って、すべてのスライドを追加します。スライドの追加時には、マーカーを*Negativeに変更します。Preparation、HIER、およびEnzymeには、交換プロトコルに脱ワックスや抗原賦活化が不要なため、*----オプションを選択します。これが完了したら、[ スライドの追加] をクリックします。
6. スタディで実行するスライドの数に応じてこのプロセスを繰り返し、追加された各スライドのスライドコメントフィールドが更新され、後で一意に識別できるようにします。
7. すべてのスライドを追加したら、[スライドの追加] ウィンドウを閉じ、すべてのラベルを印刷して、対応する組織切片に貼り付けます。
8. 各スライドをトレイにセットし、各セクションの上にカバータイルを配置してから、トレイをソフトウェアにロードします。
9. すべての試薬とスライドを追加したら、ソフトウェアで 対応するAutostainer を選択します。これは右側にあります。これを選択すると、3つのスライドトレイすべてと、バルク試薬や試薬調製中に追加された試薬など、ソフトウェア上のすべての試薬の情報が表示されます。
10. バルク試薬容器が充填されており、廃液容器にランを完了するのに十分な容量が残っていることを確認してください。
11. これを確認したら、 再生 ボタンを押して実行を開始します。プロトコルは完了するまでに約90分かかります。停止時間をメモし、実行が完了したらすぐにスライドが取り外されていることを確認してください。

9. イメージング

1. ステップ5のように、新しいプローブラウンドのイメージングを繰り返します。画像は 図3Bのようになります。

10. スタッキング(>4-plexタンパク質イメージング用)

1. これで、同じスライドに複数の画像が存在します。画像共登録ソフトウェアで画像を組み合わせて、スタックされた8プレックス画像を生成します。
2. 各ラウンドの画像を以下のように共同登録します。
   1. 各ラウンド イメージには、_ という名前が付けられます。ここで はスライド (バーコード) の一意の名前で、 は、アルファベット順に並べ替えると、ラウンド 1 のイメージが最初に、ラウンド 2 のイメージが 2 番目になる文字列です。たとえば、 = 1234ABC の場合、ファイルの名前は 1234ABC_Round1 と 1234ABC_Round2 で、すべてのファイルにスキャナーの適切な拡張子 (.czi など) を付けることができます。丸い画像をすべて、Source Imagesなどと呼ばれる1つのフォルダに入れます。
   2. 共同登録ソフトウェア内で、ユーザーインターフェイスのソース画像ディレクトリセクションにある [設定] ボタンをクリックし、求められたら、 上記で作成したフォルダを選択します。
   3. [ソース画像] セクションのファイルタイプをソース画像の拡張子 (.czi、.qptiff など) に設定します。ソフトウェアは、スライド1234ABCに2つの丸い画像があることを示す表に、2つの丸い画像をまとめて表示します。
   4. 必要に応じて、ユーザーインターフェイスのスタックイメージディレクトリセクションにある[設定]ボタンを使用して、出力スタックイメージの場所をソースイメージフォルダとは異なるディレクトリに設定し、要求された場合は [目的の出力 ]フォルダを選択します。それ以外の場合は、デフォルトでソース画像フォルダが使用されます。
   5. デフォルトでは、スタックの .afi ファイル表現のみが作成されます。インターフェイスの処理オプションセクションで、スタック全体のOME.tifファイルを保存するオプションをオンにします。
   6. サンプル全体の共レジストレーションの精度を検証するには、インターフェイスの出力セクションにある [Validation ] オプションをオンにします。
   7. STARTボタンを押すと、画像の同時登録が開始されます。

11. 画像解析

1. スライドを画像化した後、UltivueのSTARVUE画像処理スイートやQuPath¹⁵など、任意の解析方法を使用してスライドを視覚化および解析します。

結果

上記のプロトコルに従って、FFPE組織を複数のターゲットで染色し、4つのグループ内のすべてのマーカーの高品質画像が取得されています(図3A、B)。画像共登録ソフトウェアを使用すると、 図3Cに示すように、同じスライドの画像を結合して共登録できます。同様の結果を、結腸直腸癌(CRC)組織スライドの 図4 に示します。

プロトコルの成功は、予想される染色パターンを評価することによって判断する必要があります。示されているCRCの例では、染色された各ターゲットは、予想される細胞内コンパートメント、例えば、核FoxP3、膜状CD3、細胞質CD68で発現している(図4B-D)。PD1とCD3の共局在の例、またはPDL-1とCD68の例で示されるように、各機能的標的は適切な細胞型で発現しており、それぞれ消耗したT細胞と免疫抑制マクロファージを示しています。良好なシグナル対バックグラウンド比の評価は、真の陽性シグナルと潜在的なバックグラウンドノイズをうまく区別できるように、通常、病理学者または画像分析の専門家によって定性的に行われ、染色の品質を確認し、画像分析を成功させることができます。染色の品質と性能をさらに確認するために、シリアル切片のゴールドスタンダードIHC(発色性DAB)との比較(図5の例を参照)や、ほとんどの免疫標的にとって染色の成功を確認するのに役立つヒト扁桃腺などのポジティブコントロール組織サンプルを追加することができます。がんはヒト扁桃腺¹⁶よりも標的の発現が低い場合があることに注意してください。

定性的に結果を確認した後、定量分析を行うことができます。この研究では、これは主に、特定のターゲットを発現するさまざまな表現型(細胞数/ mm²)の細胞密度を計算することと、幅広いダイナミックレンジの発現を示すことができる機能ターゲットの平均強度レベルを計算することで構成されます。mIFアッセイの精度を評価する場合、同じマーカーで染色したシリアル切片は、スライド間で同等のシグナルを示すはずであり、 これは図6で定性的に示すことができます。さまざまな組織タイプにおける単一マーカー密度の定量結果の例を 図7に示します。これらの画像に対する画像解析により、陽性細胞を同定し、各マーカーに対応する陽性細胞密度、および陽性細胞あたりの平均シグナル強度を計算できます。これにより、各マーカーの変動係数(CV)を計算して、マルチプレックスアッセイの精度を評価できます(表4)。

図3:8プレックス免疫蛍光プロトコルでの連続染色ラウンドから得られた組織マイクロアレイ(TMA)コアの画像。 (A)マーカーCD8、PD1、PD-L1、およびCD68を特徴とする最初のイメージングから得られた画像。交換プロトコル後、(B)はマーカーCD3、CD4、FoxP3、およびCK/SOX10の2ラウンド目を同じスライド上に示し、(C)は(A)と(B)の画像を組み合わせた共登録画像を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:8プレックス免疫蛍光染色による結腸直腸癌(CRC)組織の代表的な染色。 この図は、同じ細胞内の複数のターゲットを共局在させることで同定できる細胞表現型を示しています。(トップ)大腸がん組織の全スライド画像。(下)(A)T-reg細胞(CD3+/CD4+/FOXP3+)、(B)腫瘍および間質内のPD-1-およびPD-L1-発現細胞、(C)疲弊した細胞傷害性T細胞(CD3+/CD8+/PD-1)、(D)免疫回避腫瘍細胞(PD-L1+/CK+)および免疫抑制性マクロファージ(CD68+/PDL1+)を強調表示する組織領域の詳細な図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:免疫組織化学染色(IHC)染色と免疫蛍光染色(IF)染色の定性的比較。 シングルマーカー免疫組織化学染色(DAB、上段)、シングルマーカー免疫蛍光染色(ISPモノプレックス)、およびマルチプレックス免疫蛍光のシングルチャンネルビュー(ISPマルチプレックス)で染色したシリアル切片は、異なる染色方法間の定性的な一致を示しています。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:シリアル切片染色(A)マルチティッシュTMAのレイアウトを示す図。(B)TMAにおける各組織タイプの組織コアの代表的な8プレックス画像。(C)1回のランで染色された6つの連続TMA切片にわたる扁桃腺コアのCD8の代表的な画像。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:TMAに含まれる組織タイプごとの単一マーカー密度定量。 組織あたりの密度は、TMA スライド上の各組織タイプの 3 つの代表的なコアの平均密度です。y軸は、x軸上のさまざまな組織タイプの単一マーカー密度を、陽性細胞/mm²の単位で表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図8:このプロトコルに記載されている増幅されたISP mIFと間接IFを比較した相対蛍光シグナルの関心領域(ROI)解析。 (A)CK(左)またはPD-L1(右)用に染色された代表的なスライドで、5つのROIが示されています。(B)CK(上)とPD-L1(下)の代表的なROI画像。増幅されたmIF(紫)と間接IF(青)で、(C)CKと(D)PD-L1の5つのROIで達成された平均シグナル強度(それぞれ100μm x 100μm、約200個の細胞を含む)。Y軸の値は任意の蛍光単位を示し、エラーバーは標準偏差(n = 3)を示します。(E)増幅されたISP mIF(紫)と間接IF(青)で達成される相対信号強度は、すべてのROIで平均増幅されたmIF信号と平均間接IF信号の比を取ることによって計算されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表4:計算された分散係数(CV)。 扁桃腺画像の正の細胞密度と平均信号強度のCVを 図6に示します。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

このレポートでは、オートステイナーを使用したハイスループット、高感度のマルチプレックス免疫蛍光染色ランのプロトコールについて説明します。このプロトコールを実施する際には、試薬調製ステップが重要であり、注意が必要です。試薬を適切かつ正確に混合して、同じ分析の異なるスライド間、または同じ成分を使用する異なる分析間での染色のばらつきを最小限に抑える必要があります。

このプロトコールを実施する際の一般的な問題には、ロード前に試薬を適切に混合しないことや、不適切なデカバースリッピング手順による組織損失の可能性などがあります。この染色プロトコルは、がんタイプを含むあらゆるFFPE組織タイプに適用できますが、一部の組織タイプ(高脂肪含有量の組織など)では、より慎重な取り扱いが必要な場合があります。組織の損失を防ぐために、カバースリップしたスライドを十分に長い時間浸し、カバースリップが自然に剥がれるようにします。.カバーガラスを無理に外したり、ガラスをこじ開けたりしないでください。

制限は、免疫腫瘍学で最も一般的に使用されるターゲットの多くが検証され、すぐに使用できる一方で、一部のターゲットはマルチプレックスパネルに含める前にアッセイ開発が必要な場合があることです。このプロセスは比較的高速ですが、カスタムマルチプレックスパネルを使用できるようになるまでには、さらに数週間かかる場合があります。

このアッセイと他のマルチプレックス免疫蛍光技術との間には、いくつかの違いがあります。直接および間接の免疫蛍光ベースの技術と比較して、ここで実証されたアッセイは増幅レベルが大幅に高く、特にFITCチャネルなどの組織自家蛍光を示す傾向があるチャネルで、S/N比を大幅に改善できます。その結果、全スライド強度分析と手動ROIベースの分析を使用して定量化したところ、直接免疫蛍光法よりも~30倍、間接免疫蛍光法よりも~10倍強いシグナルが得られます(図8)。この方法により、大幅に短い露光時間ではるかに感度の高い標的タンパク質の検出が可能になり、低強度のシグナルを除去するリスクを伴うバックグラウンドの減算を含む画像操作が不要になります。

酵素触媒による増幅に基づくmIFアッセイと比較して、ここで示すアッセイは、ワークフローが簡素化され、一般的にアッセイの実行時間が短いことに加えて、マルチプレックスを実行する能力が大幅に向上しています(図1)。このアッセイでは、抗体を1つのステップで一緒に添加し、同時に増幅するため、アッセイのプロトコルが大幅に簡素化されます。さらに、チラミドシグナル増幅(TSA)などの一部の酵素ベースの技術は、アンブレラ効果12,17,18と呼ばれる、異なる抗体間の干渉を示すことができる。ここで使用した増幅技術により、この問題を回避し、図4に示すように、同じ細胞上に複数の共局在および共発現マーカーを検出できます。

ヒトのがんの約90%は上皮細胞から発生しています¹⁹。これは、それらが外部環境に対する防御の最前線を形成し、より速く増殖し、潜在的に発癌性の突然変異のより速い蓄積につながることが多いためです。ここでは、炎症が腫瘍形成、進行、播種に重要な役割を果たしています。過去10年間で、免疫チェックポイント阻害剤と免疫細胞を標的とする多くの治療法が、多くの腫瘍タイプ^5,20,21に対する強力な武器として浮上してきました。しかし、患者のかなりの部分はまだ反応しません。腫瘍微小環境(TME)と局所免疫ランドスケープが重要な役割を果たしている可能性があります。多くの患者間で異なる薬物反応に関連するTME分子シグネチャをプロファイリングすることにより、治療バイオマーカーをより適切に定義できる可能性があります。このレポートは、mIFテクノロジーを使用して、数百の全サンプルスライドまたは腫瘍マイクロアレイにわたって、低発現のマーカーを含む複数のタンパク質バイオマーカーを並行してプロファイリングできることを示しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗CD3	Ultivue		ローンBC33(BioCare)。ULT50801
抗CD4	Ultivue		ローンSP35(Abcam)の一部。ULT50801
抗 CD68	Ultivue		クローン KP1 (BioCare) の一部。ULT50801
抗 CD8	Ultivue		クローン C8/144B (BioCare) の一部。ULT50801
抗サイトケラチン + 抗 SOX10	Ultivue		クローン AE1/AE3 (Bethyl Labs) および BC34 (BioCare) の一部。ULT50801の一部、混合物として提供される抗
FOXP3	Ultivue		Clone 236A/E7(Thermo)。ULT50801
抗PD1	Ultivue		ローンCAL20(Abcam)の一部。ULT50801
抗PDL1	Ultivue		ローン73-10(Abcam)の一部。ULT50801
Axioscan.Z1 顕微鏡	ツァイ		光顕微鏡と呼ばれ、本文で
ド脱ワックス溶液	ライカ	AR9222
ボンド エピトープ回収溶液 2	ライカ	AR9640
ボンド オープン コンテナ、30 mL	ライカ	OP309700
ボンド研究検出キット	ライカ	DS9455
ボンド滴定インサート	ライカ	OPT9049
ボンド滴定キット	ライカ	OPT9719
ボンド ユニバーサル カバータイル	ライカ	S21.4611
ボンドウォッシュ ソリューション 10x 濃縮液	ライカ	AR9590
BondRX オートステイナー	ライカ		テキストで「オートステイナー」と呼ばれています
BondRX ソフトウェア	ライカ		バージョン6.0以降
カバースリップ、#1.5厚さ	Corning	2980-244
エタノール、200プルーフ	VWR	89370-084
FFPE組織ブロック	BioIVT		組織の種類はさまざま
OmniVUE 8-plexアッセイ(CD3、CD4、CD8、CD68、FOXP3、PD-1、PD-L1、汎サイトケラチン/SOX10)	Ultivue	ULT50801	、他のすべてのUltivue成分が含まれています
酸緩衝生理食塩水(PBS)	Boston BioProducts	C-9911F	(pH 7.4、2.7 mM KClおよび137 mM NaCl)
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo	P10144は	、本文
UltiAnalyzer.AI Ultivue
UltiStacker.AI	Ultivue
Ultivue Ultivue Amplification Buffer	Ultivue		ULT50801
Ultivue抗体の一部 希釈剤	Ultivue Ultivue
Ultivue 交換バッファー	Ultivue		ULT50801
Ultivue Exchange Initiator	Ultiv	ULT50801
Ultivue Neutralizer	Ultivue		ULT50801
Ultivue 蛍光プローブの一部 1	Ultivue		ULT50801
Ultivue蛍光プローブの一部 2	Ultivue		ULT50801
Ultivue Pre-Amplification Mix	Ultivue Ultivue
Probe	Buffer Ultivue		ULT50801
純水	Sigma-Aldrich	W4502