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方法論記事

マウス由来骨髄間葉系幹細胞の精製、増殖、およびフローサイトメトリーに基づく表現型解析

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DOI:

10.3791/67600

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2025年7月11日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Central Laboratory for Science and Technology, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルは、マウス由来の非常に均質な骨髄間葉系幹細胞(BMSC)を精製、増殖、および特徴付けるための費用対効果の高い方法を説明しています。このアプローチにより、高い増殖と分化の可能性のある大量のBMSCの取得が容易になり、マウスモデルをサポートし、前臨床研究を前進させることができます。

要約

間葉系幹細胞(MSC)は、自己複製して複数の細胞系統に分化できる幹細胞の集団です。その中でも、骨髄中葉系幹細胞(BMSC)として知られる骨髄に含まれるMSCは、骨形成、造血サポート、ホーミング/遊走、および免疫抑制に重要な役割を果たします。BMSCは、細胞治療戦略の可能性、入手のしやすさ、遺伝的安定性、免疫原性の低さから、細胞生物学や組織工学の研究に広く使用されています。造血幹細胞(HSC)とBMSCは骨髄に共存しますが、前駆細胞は異なります。骨髄から細胞を抽出すると、通常、複数の細胞タイプが得られるため、細胞集団の不均一性が生じ、バイアスが生じたり、高い実験基準を満たさなくなったりする可能性があります。したがって、in vitroでBMSCの均質性と収量を改善するための効果的な技術を開発することが重要です。この研究は、BALB/cマウスから得られたBMSCの精製、増殖、およびフローサイトメトリーベースの表現型解析のための詳細なプロトコルを示しています。第3継代BMSCの均質性と幹細胞表現型をフローサイトメトリーを用いて特徴付け、CD29、CD44、Sca-1の陽性、CD45、CD31の陰性を示し、それらの骨形成能力と脂肪形成能力を確認しました。この費用対効果の高いプロトコールは、マウスモデルの研究や広範な前臨床研究を進めるために不可欠な、高い増殖および分化のポテンシャルを持つ十分な数の均質なBMSCを得るための簡単で効率的な方法を提供します。

概要

骨髄間葉系幹細胞(BMSC)は、その多能性で知られており、自己再生可能、分化、および免疫調節特性により、さまざまな疾患の治療に広く使用されています1,2。BMSCは容易に入手でき、広範囲にわたる増殖が可能で、免疫抑制特性を示し、即時の免疫反応を引き起こさない3ため、組織工学への応用や細胞治療の効果的な担体として有望です。

骨髄では、2つの主要な幹細胞集団とその子孫である造血幹細胞とBMSCが主要な居住者です4。従来、BMSCは標的骨髄吸引によって得られ、 in vitroでプラスチック接着細胞として同定されます。しかし、この方法は、BMSCを他の骨髄亜集団(内皮細胞、周皮細胞、白血球、造血幹細胞など)と区別するには不十分である5。したがって、BMSCの分離のための簡単で効果的なプロトコルが必要です。

現在の研究では、BMSCがプラスチック細胞培養プレートに物理的に付着することによるBMSCの分離と精製について詳しく説明しています。フローサイトメトリー実験は、International Society for Cell & Gene Therapy(ISCT)のMesenchymal Stromal Cell(MSC)委員会6で概説されているように、表面マーカーCD29、CD44、およびSca-1を使用して、第3継代BMSCで実施されました。ISCTの基準によれば、マウスMSCは、CD29、CD44、および幹細胞抗原1(Sca-1)の陽性、造血細胞マーカーCD45および内皮細胞マーカーCD31の陰性によって特徴付けられます。さらに、BMSCは多能性である必要があり、骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞への三系統分化を示しています。この実験では、抽出したBMSCで骨形成を誘導し、7日目にALP染色を行い、21日目にアリザリンレッドSアッセイを行い、分化を評価しました。単離および精製されたBMSCの脂肪形成分化も誘導され、脂肪形成を評価するために21日目にオイルレッドO染色が行われました。

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プロトコル

動物の取り扱いは、上海中医薬大学の実験動物倫理ガイドライン(倫理承認番号:PZSHUTCM2211070009)に則って承認されました。この研究では、8週齢の雌BALB/cマウス(SPFグレード、体重20匹±体重1g)を使用しました。このプロトコルでは、マウス由来BMSCの精製、継代、フローサイトメトリーベースの表現型、および骨形成および脂肪形成の分化について概説しています。使用した試薬や機器は 、材料表に記載されています。

1. 動物の取り扱い

  1. 個別換気ケージ内の特定の病原体フリー(SPF)条件下でのイエネズミ、ケージあたり5匹のマウス。SPFグレードの飼料と滅菌水を提供します。12時間の明暗サイクルを維持します。
    注:この方法はテスト済みであり、BALB/cマウス系統とC57BL/6マウス系統の両方で実行可能であることがわかっています。この論文では、主にBALB/cを例に挙げます。

2. マウスの後肢から大腿骨と脛骨を採取

  1. 倫理ガイドラインに従って、CO2窒息とそれに続く子宮頸部脱臼7によって動物を安楽死させます。
  2. マウスを75%エタノールに5分間浸します(図1A)。
    注:幹細胞は安楽死後30分2 以内に採取され、骨髄のフラッシング、ろ過、培養プレートへの播種を含む全プロセスは、最適な細胞生存率を確保するために2時間以内に完了しました。
    注:最適なBMSC収量を得るには、成体マウス(≥8週齢)を使用してください。8〜12週齢のマウスが理想的です8.
  3. アキレス腱の後肢を滅菌解剖ハサミで約1cm切開します(図1B)。
  4. アキレス腱の後肢の周りを滅菌ハサミで円形に切開し、遠位脛骨を露出させます(図1C)。
  5. 切開部から股関節に向かって皮膚をはがし、両後肢から皮膚を取り除きます(図1D)。
  6. 腸骨に沿って切断し、大腿骨頭を腰骨から分離します(図2A)。
    注:骨髄の損失を防ぐために、解剖中に大腿骨の両側関節を損傷しないようにしてください。
  7. 収集した大腿骨と脛骨を、2%ペニシリン/ストレプトマイシンを含む滅菌済みの低温PBSを含む60mmの皿に入れます(図2B)。
  8. 滅菌メスを使用して、脛骨と腓骨からできるだけ多くの腱と筋肉を切り取り、後で洗い流すのを容易にします(図2C)。
  9. 処理した骨を2%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むPBSに戻し、その後の分離ステップのために滅菌フードに移します。.

3. マウスBMSCの精製と培養

  1. αMEMに10%ウシ胎児血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加することにより、BMSC培養用の完全なMEM Α修飾(αMEM)培地を調製します。
    注:αMEM培地には、比較的低濃度の1000 mg/Lのグルコースが含まれているため、αMEM培地をお選びください。これは、高グルコース環境で起こりうる細胞増殖の阻害を防ぐのに役立ちます9
  2. 50mLのシリンジを用意し、シリンジに付属の針を取り付けます。
  3. 20 mLのαMEM培地を50 mLシリンジに引き込み、針を1 mLシリンジに付属の針と交換します。
    注:骨のサイズに対応し、細胞の損傷を最小限に抑えるために、1mLのシリンジ針を使用してください。50 mLシリンジを使用すると、骨髄を効率的にフラッシングでき、繰り返しの挿入による細胞汚染のリスクが軽減されます。
  4. はさみを使用して、分離した大腿骨または脛骨の両端を滅菌フードで切断します。
  5. 針を切断端に沿って骨に挿入し、骨髄を完全なαMEM培地を含む100 mm培養皿に洗い流します(図2D)。
  6. 骨片が青白く見えるまで骨腔を繰り返し洗い流し、ほとんどの骨髄が抽出されたことを確認します(図2E)。
  7. ピペットチップで40回優しくピペットを上下させ、凝集した細胞をできるだけ分散させます。
  8. 細胞懸濁液を40 μmの細胞ストレーナーでろ過し、50 mLの遠心チューブに入れて、破片、組織片、および未分散の凝集塊を除去します。
  9. ろ過した細胞懸濁液を100 mmの細胞培養ディッシュに移し、ディッシュあたり最終容量15 mLまで完全なαMEM培地を加えます。
    注:各マウスの大腿骨と脛骨から採取したすべての骨髄細胞を1つの100 mm培養皿で培養し、細胞増殖を促進します。以前の実験に基づいて、約1×107BMCを8週齢のマウス(2つの大腿骨と2つの脛骨)から単離できます。これらの細胞を100mmの培養皿に1.8×105細胞/cm2の密度で播種し、一次培養を行います。
  10. 皿を両手で持ち、8の字に15回ゆっくりと回転させて、皿全体に細胞が均一に分布するようにします。
  11. 培養皿を37°Cの5%CO2 インキュベーターに置き、5日間培養します(図3A)。
    注:この期間中は、細胞の増殖を均一にするために、培養皿を動かさないでください。

4. BMSC培養用αMEM培地の代替

  1. 顕微鏡で細胞を観察し、細胞が80%のコンフルエントに達しているかどうかを判断します。そうでない場合は、5日目 にミディアム交換に進みます。
  2. 滅菌パスツールピペットでPBSを3 mL引き出し、培養皿から1 cmの高さからさまざまな位置で分注します。
    注意: 皿の片側に液体を分配すると、過度の衝撃力により付着した細胞が除去され、不要な細胞が効果的に除去できなくなる可能性があるため、避けてください。
  3. PBSを3mL加えた後、培養皿を軽く振って細胞をよく洗い流し、ピペットでPBSを皿から取り除きます。細胞が完全に洗浄されていることを確認するために、洗浄プロセスをもう一度繰り返します。
  4. 滅菌パスツールピペットで15 mLの完全αMEM培地を引き出し、培養皿の1 cm上からさまざまな位置で分注します。
  5. 培養皿をインキュベーターに戻し、細胞が80%のコンフルエントに達するまでモニターしてから、継代培養します(図3B)。

5. BMSCの通過

  1. コンフルエント細胞の80%をPBSで2回洗浄します(図3C)。
    注:消化前にPBSで細胞を洗浄すると、残留培地と細胞分泌物を除去し、培養皿へのMSCの接着を減らすのに役立ちます。
  2. 1 mLの0.25%トリプシン-EDTAで細胞を消化し、5%CO2 インキュベーターで37°Cで2〜3分間インキュベートします。
  3. 細胞懸濁液に4 mLの完全αMEM培地を添加して、トリプシンを中和します。
  4. 1 mLのピペットチップを使用して培養皿から細胞懸濁液を吸引し、皿の底を静かに洗い流して、すべての接着細胞を剥離します。
  5. 細胞懸濁液を15 mLの遠心チューブに移し、室温で300 × g で5分間遠心分離します。
  6. ピペットを使用して上清を捨て、細胞ペレットを2 mLの完全αMEM培地に再懸濁します。
    注:継代培養については、約4×104細胞/cm2の播種密度が、継続的な増殖および増殖に最適であることがわかった。
  7. 細胞を1:1〜1:2の比率で新しい100 mm細胞培養皿に分割します(これが第1の継 代であるP1を構成します)(図3D)。
  8. 細胞が80%のコンフルエントに達したときに、約3日ごとに1:1.5の比率で細胞を分割し、BMSCの2番目の継代(P2)(図3E)と3番目の継代(P3)(図3F)を生成します。

6. 表現型同定と骨形成分化のためのP3 BMSCの調製

  1. 細胞培養培地は廃棄します。
  2. P3 BMSCを3 mLのPBSで2回洗浄します。
  3. P3 BMSCが80%のコンフルエントに達したら、5%CO2 インキュベーターで37°Cで2〜3分間インキュベートすることにより、1mLの0.25%トリプシン-EDTAでP3 BMSCを消化します。
  4. 細胞懸濁液に4 mLの完全αMEM培地を添加して、トリプシンを中和します。
  5. 細胞懸濁液を15mLの遠心チューブに移し、室温で300 × g で5分間遠心分離し、上清を捨てます。
    注:ここで調製したP3 BMSCペレットは、フローサイトメトリー による 表現型の同定、および骨形成または脂肪形成の分化の評価に使用されます。

7. フローサイトメーターによるBMSCの表現型同定

  1. P3 BMSCの細胞ペレットを2% FBSを含むPBS溶液1.5 mLで再懸濁し、濃度を5 × 106 細胞/mLに調整します。
  2. 100 μLの細胞懸濁液を11本のチューブのそれぞれに分注して、チューブあたり5個×10個の5 個の細胞を達成します。次のグループを準備します:ラベルブランク、CD29アイソタイプコントロール、CD29、CD44アイソタイプコントロール、CD44、Sca-1アイソタイプコントロール、Sca-1、CD31アイソタイプコントロール、CD31、CD45アイソタイプコントロール、およびCD45。
    注:現在の研究では、次の蛍光色素が使用されました:CD29-FITC、CD29アイソタイプ - FITC、CD44 - APC、CD44アイソタイプ - APC、Sca-1 - PECy7、Sca-1アイソタイプ - PECy7、CD45 - PerCPcy5.5、CD45 アイソタイプ - PerCPcy5.5、CD31 - PE、およびCD31アイソタイプ - PE(材料の表に示されているように)。これらの蛍光色素は、さまざまなフローサイトメーターの構成に基づいて変更することができます。
  3. 各グループについて、以下の試薬を添加します:2 μL の PBS をラベルブランク群に、2 μL の CD29 アイソタイプを CD29 アイソタイプコントロール群に (1:50 希釈)、2 μL の CD29 アイソタイプを CD29 グループに (1:50 希釈)、0.5 μL の CD44 アイソタイプを CD44 アイソタイプコントロール群に (1:200 希釈)、0.5 μL の CD44 を CD44 グループに (1:200 希釈)、 0.5 μL の Sca-1 アイソタイプを Sca-1 アイソタイプ対照群に (1:200 希釈)、0.5 μL の Sca-1 を Sca-1 グループに (1:200 希釈)、2 μL の CD31 アイソタイプを CD31 アイソタイプコントロールグループに (1:50 希釈)、2 μL の CD31 アイソタイプを CD31 グループに (1:50 希釈)、2 μL の CD45 アイソタイプを CD45 アイソタイプコントロールグループに (1:50 希釈)、 CD45基に2μLのCD45を投与します(1:50希釈)。
    注:抗体は、フローサイトメトリーに関するメーカーの最適化された推奨事項に従って使用しました。予備実験により、標的細胞に対する最適な染色と特異性が確認されました。メーカーの投与量ガイドラインを参照し、必要に応じて力価の事前テストを実施してください。
  4. 穏やかに混合し、パーム遠心分離機を使用して遠心分離し、暗所で4°Cで30分間インキュベートします。
  5. 各チューブに900 μLのPBSを加え、反転させて混合し、300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を捨てて余分な抗体を取り除きます。
  6. 各チューブ内の細胞ペレットを300 μLのPBSで再懸濁し、フローサイトメーターを使用して分析します。
    注:フローサイトメーターアッセイが1〜2時間以内に完了できる場合、細胞を2.5%中性ホルムアルデヒドで固定する必要はありません。1〜2時間以内に分析が行えない場合は、2.5%中性緩衝ホルマリン(10%中性緩衝ホルマリンとPBSを1:3の比率で混合して調製)で細胞を固定し、4°Cで暗所で一晩保存して、後のフローサイトメーターアッセイに備えます。
  7. ラベルブランクグループを使用してフローサイトメーターの電圧を調整し、細胞の自家蛍光が座標軸の約1/4〜1/3以内にあることを確認します。CD29アイソタイプ、CD29、CD44アイソタイプ、CD44、Sca-1アイソタイプ、Sca-1アイソタイプ、Sca-1、CD31アイソタイプ、CD31、CD45アイソタイプ、およびCD45グループから細胞を順次ロードします。P1ゲート(FSC/SSCプロットで定義)を、中速で10,000個のセルを捕捉するように設定します。
    注:フローサイトメーターに、実験で一般的に使用されるような適切なチャンネル(FITC、PE、PerCp-Cy5.5、PE-Cy7、APC)、または抗体共役フルオレセインに対応するその他のチャンネルが装備されていることを確認してください。

8. BMSCの骨形成分化

  1. P3 BMSCペレットを完全なαMEM培地に再懸濁し、濃度を1 × 105 細胞/mLに調整します。
  2. 1 × 105 細胞を含む1 mLの完全αMEM培地を各ウェルに添加して、P3 BMSCを24ウェル細胞培養プレートに播種します。
  3. P3 BMSCを5% CO2 インキュベーターで37°Cで3〜5日間培養し、90%以上のコンフルエント度に達するまで培養します。完全なαMEM培地を2日ごとに新しい培地と交換してください。
  4. 異なるウェルを2つのグループに均等に分けます:ネガティブコントロールグループ(骨形成分化誘導なし)と骨形成分化グループ。
  5. 完全なαMEM培地に10 mmol/L β-グリセロリン酸、50 mg/L L-アスコルビン酸、および10-8 mol/Lデキサメタゾンを添加することにより、骨形成分化誘導培地を調製します。
  6. 細胞培養培地を廃棄し、P3 BMSCを1 mLのPBSで洗浄します。
  7. 骨分化誘導のために、骨分化誘導培地を骨分化グループのウェルに添加します(1 mL /ウェル)。
  8. 完全なαMEM培地をコントロール群のウェル(1 mL/ウェル)に加えます。
  9. P3 BMSCを5%CO2 インキュベーターで37°Cで7日間または21日間培養し、骨形成分化誘導培地または完全なαMEM培地を3日ごとに同じ新鮮な培地に交換します。
    注:7日間の誘導を行った細胞は、アルカリホスファターゼ(ALP)染色に使用されます。21日間の誘導を行った細胞は、アリザリンレッドSアッセイに使用されます。

9. ALP染色による分化した骨形成細胞の同定

  1. 24ウェルプレートの各ウェルの細胞を1mLのPBSで1回洗浄します。
  2. 10%緩衝ホルマリン溶液0.5 mLを加え、20分間インキュベートして細胞を固定します。
  3. 各ウェルの細胞を1mLのPBSで再度洗浄します。
  4. 各ウェルに0.5 mLのアルカリホスファターゼ染色試薬1-Step NBT/BCIPを加え、アルミホイルで包んで37°Cで30分間インキュベートして光から保護します。
  5. 溶液を捨て、各ウェルの細胞を1 mLの蒸留水で1回洗浄し、プレートを乾燥させます。
  6. カメラを使用して染色されたコロニーの画像を観察し、取得し、黒紫色の沈殿物を持つALP陽性細胞を同定します。
    注:アルカリホスファターゼ(ALP)染色試薬1-Step NBT/BCIPは、ALPと反応すると、強力で不溶性の黒紫色の沈殿物を生成し、簡単に視覚化できます。

10. alizarin red Sアッセイによる分化した骨形成細胞の同定

  1. 24ウェルプレートの各ウェルの細胞を1mLのPBSで1回洗浄します。
  2. 10%緩衝ホルマリン溶液0.5 mLを加え、20分間インキュベートして細胞を固定します。
  3. 24ウェルプレートの各ウェルの細胞を1mLのPBSで1回洗浄します。
  4. 0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.3)中の0.1 mLの0.1 mLを各ウェルに加え、37°Cで30〜60分間インキュベートします。
  5. 溶液を捨て、各ウェルの細胞を1 mLの蒸留水で1回洗浄し、プレートを乾燥させます。
  6. カメラを使用して染色されたコロニーの画像を観察し、取得し、アリザリン赤色S陽性細胞を同定します。
    注:成熟した石灰化骨細胞へのMSC分化のためのアリザリンレッドSアッセイは、視覚的に観察できる真っ赤な染色を生成するアリザリンレッドS-カルシウム複合体の形成をもたらします。

11. BMSCs用脂肪生成誘導分化培地Aの作製

注:BMSCの脂肪細胞分化には、ガイドラインに従ってマウス骨髄間葉系幹細胞脂肪分化キット( 材料表を参照)がよく使用されます。

  1. ウシ胎児血清(キットの成分で、血清と呼ばれる)を4°Cの冷蔵庫に少なくとも6時間置いてから、完全に解凍します。
  2. サプリメントA-I(キットの成分)を調製の少なくとも30分前に4°C冷蔵庫に入れます。サプリメントA-II(キットのコンポーネント)を完全に解凍するまで室温に置きます。
  3. 試薬チューブを反転させるか、軽くたたいて内容物を混合します。
  4. Supplement A-II試薬チューブを室温で300 × g で30秒間遠心分離し、試薬が底部に溜まるようにして取り出しやすくします。
  5. すべてのコンポーネントの外装を75%の医療用アルコールで完全に洗浄し、バイオセーフティキャビネットで開封します。
  6. 培地に美容液、サプリメントA-I、サプリメントA-IIを加えます。
    注:適切に溶解するために、基礎培地(キットの成分)を37°Cに予熱すると、サプリメントA-IIが寒さにさらされて沈殿する可能性があります。
  7. 少量の基礎培地を使用して各ボトルとチューブをすすぎ、すべての成分を基礎培地に移すようにします。
  8. Basal Mediumボトルのキャップを固定し、軽く振って十分に混ぜます。
  9. ボトルをパラフィンフィルムで密封し、アルミホイルで包み、名前、準備日、その他の詳細をラベル付けします。

12. BMSC用脂肪生成誘導分化培地Bの調製

  1. ウシ胎児血清を4°C冷蔵庫に少なくとも6時間置いてから、完全に解凍します。
  2. サプリメントB(キットの構成要素)を4°Cの冷蔵庫に置き、完全に解凍するまで少なくとも30分間待ってから調製します。
  3. 試薬チューブを反転させるか、軽くたたいて内容物を混合します。
  4. サプリメントBチューブを遠心分離して、下部の試薬を濃縮し、収集を容易にします。
  5. すべてのコンポーネントの外装を75%の医療用アルコールで完全に洗浄し、バイオセーフティキャビネットで開封します。
  6. 血清とサプリメントBを基礎培地に加えます。.
  7. 基礎培地のごく一部を使用して各ボトルとチューブを洗浄し、すべての成分が培地に完全に移るようにします。
  8. Basal Mediumボトルのキャップを固定し、軽く振って十分に混ぜます。
  9. ボトルをパラフィルムで密封し、アルミホイルで包み、名前、準備日、その他の詳細をラベル付けします。

13. BMSCの脂肪細胞分化

  1. 0.1%ゼラチン1 mLを6ウェルプレートに加え、振とうして各ウェルの底を均一にコーティングします。
  2. 0.1%ゼラチンでコーティングした6ウェルプレートを滅菌フードまたはCO2 インキュベーターに少なくとも30分間置きます。
  3. ゼラチンを吸引すると、プレートは細胞播種の準備が整います。または、ウェルが乾くのを待ってから30分後に播種します。
  4. 6ウェルプレートの各ウェルに4×104細胞/cm2の密度でP3 BMSCを播種し、各ウェルに2 mLの完全培地を添加します。
  5. 細胞を37°Cで、5%CO2および飽和湿度のCO2インキュベーターでインキュベートします。
  6. 培地を慎重に吸引し、細胞が100%のコンフルエントに達したら、2 mLの脂肪形成分化誘導培地Aを各ウェルに加えます。
  7. 導入から3日後にウェルから培地Aを吸引し、2 mLの脂肪分化培地Bを添加します。
  8. 1日後に培地Bを吸引し、さらに誘導するために培地Aに戻します。
  9. 培地Aと培地Bを交互に行い、毎日細胞を観察します。培地Aによる導入中に細胞の収縮または死が生じた場合は、速やかに培地Bに切り替えてください。
  10. 適切なサイズの脂肪滴が十分に現れるまで誘導と維持のプロセスを繰り返し、その後、染色の準備をします。

14. オイルレッドO(ORO)染色

注意: 脂質液滴の剥離を避けるために、すべての手順をできるだけ穏やかに実行してください。

  1. 脂肪誘導分化が完了した後、6ウェルプレートから脂肪生成誘導分化培地を吸引し、1×PBSで2〜3回穏やかに洗浄します。
  2. ウェルあたり2 mLの10%中性緩衝ホルマリンを加え、室温で20分間固定します。
  3. Oil Red Oストックと蒸留水と3:2の比率で混合することにより、Oil Red Oワーキングソリューションを調製します。混合後、250 × g で4分間遠心分離し、上清を使用します。
  4. 固定液を吸引し、PBSで2〜3回優しく洗浄し、固定液を完全に除去します。
  5. 各ウェルに0.8 mLの赤色O染色液を加え、室温で30分間放置します。
  6. 染色液を吸引し、1 mLの75%エタノールで2回洗浄します。
  7. 1 mLのヘマトキシリン対比染色を各ウェルに2分間加え、吸引します。
  8. 各ウェルに2 mLのPBSを添加し、脂肪形成染色結果を顕微鏡で観察します。
  9. 染色した6ウェルプレートをパラフィルムで密封し、4°Cで保存します。
    注意: 1週間以上保管しないでください。脂肪滴が融合し、染色状態が失われることがあります。

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結果

マウス由来のBMSCを単離し、約2週間培養して、第3継代(P3)BMSCを作製しました(図3)。図3Aに示すように、骨髄から抽出されたばかりの細胞は単核のままで、脂肪滴が目に見えました。紡錘形の細胞が培養皿に現れ、5日目の培養日に60%〜80%のコンフルエントに達しました(図3B、C)。P1-P3(図3D-F)から、BMSCは長い紡錘体または紡錘形の形状を示し、単層として成長し、細胞コロニーのネットワークを形成しました。細胞は通常、適切な間隔を維持し、細胞質が明確で、アポトーシスの顕著な兆候はなく、核には異常な断片は示されませんでした。

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ディスカッション

幹細胞治療は、再生医療に革命を起こす可能性を秘めていることから、大きな関心を集めています。前臨床試験では、幹細胞、特にBMSCの臨床応用を支持する実質的な証拠が提供されている13。しかし、細胞収量の低さ、コンタミネーション、増殖の遅さなどの課題が臨床応用を妨げてきました。そのため、BMSCの調製プロセスの標準化に着目した研究が急務となっており、細胞の収量と機能性を高め、それによってBMSCの臨床利用を広げることが求められています2。

この方法は、BMSCの単離と培養においていくつかの重要な利点をもたらします。まず、新たに単離された骨髄細胞の乱れは、操作なしで5日間連続培養を維持することにより最小限に抑えられ、造血細胞がBMSCの栄養と維持をサポートすることができました。また、BMSCの精製には培地交換や連続継代などの技術が実施され、低比率(1:1-1:2)の低速継代法が採用され、BMSCの増殖と精製が促進されました。第二...

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開示事項

著者らは、この研究に関連して利益相反を宣言しない。

謝辞

この研究は、National Key R&D Program of China(2020YFE0201600)およびNational Natural Science Foundation of China(82174408および82374477)からの助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1mLシリンジ(22Gシリンジニードル)親切なグループ(KDL)60017031
1ステップNBT / BCIP ピアース・バイオテクノロジー株式会社34042アルカリホスファターゼ染色
10%中性緩衝ホルマリンウェクシス5200250細胞固定
6ウェルプレートラボセレクト11110細胞培養
24ウェルプレートラボセレクト11310細胞培養
40 & ミュー;m セルストレーナーコーニグ352340凝集物を除去するためのろ過
50mLシリンジ親切なグループ(KDL)60017040
75%エタノール 上海 NianYue Biotechnology Co., Ltd31009001マウスの皮膚を消毒する
アリザリン レッド Sシグマ・アルドリッチ A5533カルシウム沈着物と石灰化結節の検出
APC CD44モノクローナル抗体(クローン:IM7)eバイオサイエンス17-0441-82フローサイトメトリー 
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