磁気ビーズを用いたゼブラフィッシュの心臓部における機械的な力の操作

Summary

このプロトコールは、顕微手術を通じて発生中のゼブラフィッシュの心臓に磁気ビーズを移植する方法を概説し、 生体内で の機械的な力の操作を可能にし、心内膜細胞への機械的刺激依存的なカルシウム流入を誘発します。

Abstract

機械的な力は、心臓弁の形態形成プログラムにフィードバックを継続的に提供します。ゼブラフィッシュでは、心臓弁の発達は、心臓の収縮と心臓の鼓動によって生成される物理的刺激に依存しています。血流によって駆動される心臓内血行動態は、胚の心臓の発達を形作る基本的な情報として浮かび上がってきます。ここでは、直径30μmから60μmの磁気ビーズを心内腔にグラフトすることにより、 生体内で 機械的な力を操作する効果的な方法について述べます。ビーズの挿入は、心臓の機能を乱すことなく麻酔をかけた幼虫のマイクロサージェリーによって行われ、境界条件の人為的な変更を可能にし、それによってシステム内の流れの力を変更します。その結果、ビーズの存在は心内膜細胞が経験する機械的な力を増幅し、機械的刺激依存性のカルシウム流入を直接引き起こす可能性があります。このアプローチは、心臓の発達を支配する機械伝達経路の調査を容易にし、心臓弁の形態形成における機械的な力の役割についての洞察を提供することができます。

Introduction

1970^年代後半に導入されて以来、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、心臓の発達と先天性心疾患の複雑さを研究するための強力なモデルシステムとして浮上してきました。マウスやニワトリの胚を含むほとんどの脊椎動物は、機能的な心血管系に依存しており、初期の心臓の欠陥を乗り越えることができませんが、ゼブラフィッシュは、重度の心臓表現型の調査を可能にするという独自の利点を提供します。これは、そのサイズが小さいため、受動的な拡散によって十分な酸素供給が促進され、心臓の収縮や活発な血液循環がなくても生存できるためです^2,3,4。さらに、ゼブラフィッシュの多くの重要な特徴の中には、その胚の光学的透明性があり、これにより発達中の心臓5,6,7,8の非侵襲的なモニタリングが可能になります。

機械的な力は、心臓弁の形態形....

Protocol

この議定書に記載されているゼブラフィッシュの胚の取り扱い手順は、欧州指令2010/63/EUおよびプロジェクトライセンスPP6020928に基づく内務省のガイドラインに準拠しています。

1. ビーズグラフトのためのゼブラフィッシュ胚の入手

1. 関連するゼブラフィッシュの系統を渡り、28.5°CのDanieau培地で胚を成長させます。 ゼブラフィッシュのラインを渡る方法の詳細については、JoVE Science Education Database²⁷を参照してください。
2. 受精後24時間(hpf)から1-フェニル-2-チオ尿素(PTU)で胚を処理し、ダニオー培地で0.003%PTUの濃度を使用して色素形成を阻害します。
3. 蛍光標識ラインを使用する場合は、ビーズグラフトを開始する前に蛍光ステレオスコープで胚を検査し、明るい蛍光を示す10〜20個の健康な胚を選択します。鉗子を使用して実体顕微鏡下で事前に選択した胚を穏やかにデコレーションし、胚が損傷しないようにします。

2. ゼブラフィッシュ胚のマウント

1. 0.02%トリカインを含むダニオー培地20mLを調製します....

Results

成功したビーズグラフト作成の例を 、図3、 ビデオ3、 およびビデオ4に示します。磁気ビーズはゼブラフィッシュの心臓の心房内に正しく配置されていたため、血流が妨げられず、出血も観察されませんでした。さらに、心臓壁は崩壊することなく構造的完全性を維持しました(図3 および ビデオ3)。24時間後、胚は心膜浮腫の兆候を示さず、移植手術の成功をさらに確認しました(ビデオ4)。

これらの指標は、ビーズ移植の成功を評価し、関連する研究に含めるためのサンプルの適合性を判断するために不可欠です。これらの基準を満たさない魚は、研究結果の正確性と信頼性を確保するために除外する必要があります。

Discussion

プロトコルとトラブルシューティングの重要なステップ

ゼブラフィッシュ胚のマウント

胚をマウントするために使用されるアガロースの量は重要です。形成されるドームは、表面から胚へのビーズの操作を妨げる可能性があるため、過度に大きくしてはいけません。逆に、小さすぎてはいけません。アガロースの上に複数のビーズがあり、胚とその卵黄の近くに配置されていると、混乱を引き起こす可能性があります。胚を十分に覆い、その上に数ミリメートルのスペースを残すために、約350μLの容量が推奨されます。アガロースがガラスからあふれている場合は、添加量が多すぎることを示しています。

胚はガラスの上に直接置くべきです。胚の一部が浮いているなど、胚がアガロースに完全には沈まっていない場合は、約200μLのLMPアガロースを吸い上げます。胚を穏やかに吸引してか.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
素材
ゼブラフィッシュの飼育・繁殖・胚採取
ガラス底皿(35mm×15 mm)	VWR International	734-2905
ヒートブロック	エッペンドルフ	EP5382000031	エッペンドルフ サーモミキサー C
ジュエラーズ鉗子	シグマ・アルドリッチ	F6521-1EA	デュモン No. 5, L 4 1/4 インチ, イノックス合金
マイクロ遠心チューブ 2 mL	エッペンドルフ	30120094
パスツールピペット
ペトリ皿
実体顕微鏡
試薬
4 mg/mL トリカイン原液
ダニオー培地 (60x 原液)
PureCube Glutathione MagBeads	Cube Biotech	32201
PTU (1-phenyl-2-thiourea)	Sigma-Aldrich	P7629
UltraPure 低融点アガロース	Invitrogen	16520-050
Danieau 培地 (60x ストック溶液)
34.8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
1.6 g KCl	Sigma-Aldrich	P9541
5.8 g CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
9.78 g MgCl2·6H2O	Sigma-Aldrich	442611-M
成分をH2Oに最終容量2 Lまで溶解し、NaOHを使用してpHを7.2に調整し、次にオートクレーブで洗浄します。
4 mg/mL トリカイン原液
400 mg のトリカイン粉末 (エチル 3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩)	Sigma-Aldrich	A5040
97.9 mL 二重蒸留 H2O
2.1 mL 1 M トリス (pH 9)
pH を 7 に調整し、分注して -20°C で保存します。