方法論記事

緑 膿菌 および 黄色ブドウ球 菌の不均一な表現型のタイムラプス落射蛍光顕微鏡イメージング

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DOI：

10.3791/67617

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2025年2月14日

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1Department of Molecular Biology & Biophysics, UConn Health, 2School of Dental Medicine, UConn Health, 3Richard D. Berlin Center for Cell Analysis and Modeling, UConn Health

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この原稿では、 緑膿菌 と 黄色ブドウ球菌の抗生物質の生存を評価するための包括的なプロトコルを提供し、プラスミドを 緑膿菌 と 黄色ブドウ球菌 に変換してレポーター株を作成し、タイムラプス落射蛍光顕微鏡法によって持続性などの表現型変異を視覚化します。

要約

抗生物質の持続性とは、遺伝的に感受性の高い集団の少数の細菌細胞が、他の遺伝的に同一の細胞を殺す抗生物質治療を生き残る現象です。細菌持続性物質は、抗生物質治療が終了すると複製を再開することができ、一般的に臨床治療の失敗の根底にあると考えられています。最近の研究では、細菌を蛍光転写レポーター、トランスレーショナルレポーター、および/または色素でさまざまな細胞の特徴に標識するタイムラプス蛍光顕微鏡の力を利用して、集団レベルの抗生物質生存アッセイから学べるものを超えて、 大腸菌 の持続性についての理解が進んでいます。このようなシングルセルアプローチは、バルクポピュレーションアッセイではなく、持続性形成、損傷応答、および生存のメカニズムを明らかにするために不可欠です。しかし、この詳細レベルで他の重要な病原性種の残留性物質を研究する方法は依然として限られています。

この研究は、抗生物質の治療と回復中に 緑膿菌 (グラム陰性桿菌) と 黄色ブドウ球 菌 (グラム陽性球菌) のタイムラプス イメージングに適応可能なアプローチを提供します。これらの細菌に蛍光レポーターを導入するための分子遺伝学的アプローチについて議論します。これらのレポーターと色素を使用して、抗生物質治療に応答した個々の細胞の表現型の変化、形態学的特徴、および運命を追跡できます。さらに、治療後に蘇生する個々の持続性の表現型を観察することができます。全体として、この研究は、臨床的に重要な病原体における個々の抗生物質処理細胞(治療中および治療後の両方での持続性を含む)の生存と遺伝子発現の追跡に関心のある人々にとってのリソースとして機能します。

概要

細菌性病原体は、遺伝的変化を伴う抗生物質耐性と、非遺伝的変化を伴う表現型耐性という2つの主要なメカニズムを通じて、抗生物質の影響を回避することができます。抗生物質耐性は、特定の細菌細胞が生存するだけでなく、抗生物質の存在下でも複製する能力を付与する遺伝的にコード化された現象です1。表現型耐性は、抗生物質耐性菌または抗生物質持続性細菌を包含し、細胞が抗菌剤治療に耐え、抗生物質の阻害濃度の存在下で複製能力を獲得せずに起こる1,2。耐性と持続性の違いは、耐性とは全集団が治療を生き延びる能力を指すのに対し、持続性は、抗生物質治療を生き残る同質遺伝子であるが表現型的に不均一な集団のサブセットを指すことです。クローン培養物を殺菌性抗生物質で処理し、培養物に残っている生存者を対数線形スケールで時間に対してプロットすると、通常、残留性物質が存在する場合に二相性曲線が検出されます。これらの曲線では、最初のフェーズは人口の大部分が比較的早く殺されることを示し、2番目のフェーズは、抗生物質の持続性画分がより遅い速度で殺されるか、まったく殺されないことを示しています1,2。

抗生物質の持続性は、世界の医療システムに大きな負担をかけています。例えば、本稿で取り上げる黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)と緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)は、嚢胞性線維症や慢性創傷感染症の患者における再発性気道感染症など、抗生物質抵抗性感染症を引き起こすと考えられています3,4。したがって、持続性細胞生物学と表現型プログラムのさらなる解明が重要です。持続性がどのように形成され、蘇生するかの理解は進んでいますが、残留性の根底にある個々の細胞における代謝再プログラミングと分子イベントの調整に関連する重要な知識のギャップは依然として残っています5,6,7,8。

永続性を効果的に研究することは、技術的な課題であることが証明されています。持続性は細菌集団のごく一部でしか観察できないため、大量の細菌集団をサンプリングする手法では、関連する生物学的情報を捕捉できないことがよくあります1,2,8,9,10。さらに、持続性の根底にある表現型の変化は一過性であり、遺伝性ではないため、持続性細胞の運命の追跡は複雑になる可能性があります1,8,9,10,11。細菌の残留性物質が成長を再開すると、それらは分裂して残留性物質と非持続性物質の両方を生じさせる可能性があり、純粋な残留性個体群を培養して濃縮することは不可能になります。これらの課題は、1)生きた単一細胞の生物学的情報を捕捉する能力、2)蛍光色素、プローブ、センサー、レポーターと組み合わせて使用し、不均一な集団の個々の細胞の表現型を経時的に調査できる能力を満たすことができる技術の必要性を浮き彫りにしています。

近年のシングルセル技術の進歩は、細菌の不均一性を効果的に調査し、持続性を研究する際のこれらのハードルを克服する手段を提供してきた12,13。これらの技術には、蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー/蛍光活性化セルソーティング、マイクロ流体工学、およびシングルセルRNAシーケンシングが含まれます12,13。ここでは、転写またはトランスレーショナルレポーター株の落射蛍光タイムラプス顕微鏡を使用して、シングルセルパーシスター生理学を解明するためのプロトコルについて説明します。蛍光顕微鏡法は、持続性表現型を研究するための基準、すなわち、抗生物質の除去後に大規模な集団のどの個々の細胞が増殖するかを特定する能力を満たす強力な技術であり、したがって持続性として定義することができます。自動カメラ技術とインキュベートチャンバーの導入により、微生物学の分野全体で生きた細菌細胞のキャプチャが広く利用できるようになりました。重要なことに、タイムラプス顕微鏡は、数時間から数日にわたって単一細胞をリアルタイムで視覚化する能力を提供し、これにより、抗生物質治療前、治療中、および治療後の細菌を追跡することが可能になる14,15,16。タイムラプス顕微鏡を用いたこれらの研究から得られた知見は、パーシスターバイオロジーの複雑なメカニズムへの洞察を生み出す大きな可能性を秘めています。

プロトコル

1.形質転換と形質導入による黄色ブドウ球菌の蛍光レポーター株の作製  

注:レポーター株は、目的の遺伝子またはタンパク質の発現を示す蛍光タンパク質を保有しています。転写レポーターは、蛍光タンパク質の上流で目的の遺伝子のネイティブプロモーター配列の複製コピーを特徴としているため、目的の遺伝子の発現が増加すると蛍光が増加します。トランスレーショナルレポーターは、蛍光タンパク質と目的タンパク質のオープンリーディングフレームを柔軟なペプチドコネクターでリンクします。レポーター株を生細胞顕微鏡で可視化することで、目的の遺伝子/タンパク質が特定の細胞形態や細胞運命と関連しているかどうかを明らかにすることができます(図1、補足ビデオ1、および補足ビデオ2)。黄色ブドウ球菌にコドンが最適化された蛍光タンパク質を選択してください。この研究では、Alexander Horswill博士から寄贈されたpCM29のsGFPを使用していますが、Nebraska Transposon Mutant Library Genetic Toolkitには、コドン最適化sGFP、eYFP、eCFP、DsRed.T3、およびeqFP65017,18を持つプラスミドが含まれています。

  1. レポータープラスミドを 黄色ブドウ球菌 RN4220に変換します。
    注:次のプロトコルセクションは、ネブラスカ大学医療センター19,20のブドウ球菌遺伝学および代謝ワークショップのエッセンシャルから適応されました。
    1. まず、エレクトロコンピテント黄色ブドウ球菌RN4220を調製します。2gのカサミノ酸、5gの酵母抽出物、2mLの10%K2HPO4、pH7.5、2mLの50%グルコース溶液、および5gのNaClを組み合わせて、200mLのB2ブロスを調製します。滅菌超純水で容量を100mLにします。37°Cで短時間混合して成分を溶解し、ボトルトップフィルター(0.22 μmの細孔サイズ)を使用して滅菌します。
    2. -80°Cで保存した凍結ストックから25%グリセロール中、250 mLのバッフルフラスコに30 mLのB2ブロスに黄色 ブドウ球菌 RN4220を接種し、125 rpmで振とうしながら30°Cで18時間インキュベートします。
    3. 250 mLのバッフルフラスコ2つを50 mLのB2ブロスとそれぞれ37°Cで一晩インキュベートし、翌日のために培地を予熱します。
    4. 翌日、オーバーナイトカルチャーのOD600 を測定します。50 mLのB2ブロスを含む各フラスコに十分な一晩培養物を加えて、最終OD600 を0.25にします。
    5. OD600 が0.35-0.4に達するまで、250rpmで振とうしながら37°Cでインキュベートします。
      注:継代培養の約30分後にOD600 をチェックして、培養物が0.35〜0.4を超えて成長しないことを確認します。OD600 が継代培養から1時間以内に0.35-0.4に達しない場合は、手順を放棄して翌日に再試行してください。バクテリアはおそらく一晩で大きくなりすぎて、固定相に深く入り込みすぎたのでしょう。
    6. 培養液が中間対数期に達したら、各フラスコから培養液を滅菌済みの50 mL円錐管に注ぎ、4,000 x g で10分間遠心分離して細胞をペレット化します。
    7. 上清をデカントし、ペレットを1 mLの滅菌室温(RT)水に再懸濁します。細胞を微量遠心チューブに移します。
    8. 細胞を再び21,000 x g で30秒間遠心分離し、上清を除去し、1 mLの滅菌RT水に再懸濁します。遠心分離、上清の除去、1 mLの水への再懸濁ステップをさらに2回繰り返し、合計3回の洗浄を行います。
    9. 細胞を遠心分離し、水を除去してから、細胞を滅菌RT 10%グリセロール(水中、滅菌ろ過済み)1 mLに再懸濁し、室温で15分間放置します。
    10. 21,000 x g で30秒間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を除去し、さらに1 mLの滅菌RT 10%グリセロールに細胞を再懸濁します。これらの細胞は今や電気能力を持っています。
    11. 70 μLのエレクトロコンピテントセルをスナップキャップマイクロ遠心チューブに分注し、将来の使用のために-80°Cで保存します。
    12. 電気コンピテント黄色 ブドウ球菌 RN4220を形質転換するには、氷上で細胞のアリコートを解凍します。プラスミドDNA1 μgを細胞に加え、サンプルをフリックして混合し、氷上で5分間インキュベートします。次に、細胞をエレクトロポレーションし、390 μLのB2培地で37°Cで1〜2時間回復させ、225 rpmで振とうし、選択的トリプシン大豆寒天培地で形質転換体をプレート化します。
      注:この研究で使用されたシャトルベクターのほとんどは、 大腸菌 (100 μg/mL)で選択するためのアンピシリン耐性カセットと、 黄色ブドウ球菌 で選択するためのクロラムフェニコール-(10 μg/mL)またはエリスロマイシン-(Erm、10 μg/mL)耐性カセットを備えています。研究室で日常的に使用されている 多くの黄色ブドウ球菌 株は、Erm耐性があります。特定のシャトルベクターを使用する前に、目的の菌株が選択的抗生物質と適合していることを確認してください。エレクトロポレーション中にサンプルが導電性が高すぎる場合に発生するアーク放電を防ぐために、細胞に添加されるDNAの量を最小限に抑える(つまり、<5μL)ことが重要です。 大腸菌 由来のプラスミドDNAを高濃度(≥300 ng/μL)で精製すると、容量を低く抑えることができます。
  2. 形質転換されたバクテリオファージを増殖させます S. aureus RN4220です。
    注:次のプロトコルセクションは、KrauszとBoseの方法から適応されました21とオルソン22.最も一般的に使用されるバクテリオファージの2つ S. aureus 形質転換は φ11と80α。これらを収穫する手順は同じですが、φ11を S. aureus RN451と80αから S. aureus RN10359。φ11は、一般的な株JE2およびHG003などで成功裏に使用されており、このプロトコルで使用されています23,24.しかし、これらのファージは、さまざまなファージ耐性を持つ臨床分離株を効率的に形質導入できない場合があります。Krausz と Bose の出版物を参照してください。21 とオルソン22 φ11の調製方法とファージ力価の決定方法として。
    1. レポータープラスミドを形質導入するには、5 mM CaCl2 と適切な濃度の選択的抗生物質を含む 6 枚のトリプシン性大豆寒天(TSA)プレートを調製します。Streak S. aureus RN4220 をレポータープラスミドとともに、選択的抗生物質と CaCl2 を含まない TSA プレートに形質転換し、一晩インキュベートします。
    2. 翌日、インキュベーターまたはウォーターバスを56°Cにオンにします。 6本の5 mLスナップキャップチューブ1 x 104 から1 x 109を標識し、500 mM CaCl2 を40 μLを各スナップキャップチューブに分注します。
    3. 柔らかいTSA(0.5%寒天)をキャップを緩めた状態で電子レンジで溶かし、無菌性を維持しながら圧力の上昇を防ぎます。次に、各スナップキャップチューブに4mLを分注します。チューブを反転させて混合し、56°Cのインキュベーターに入れて、柔らかい寒天が固まらないようにします。
    4. ファージストックをトリプシン大豆ブロス(TSB)+ 5 mM CaCl2中で1 x 1010 PFU/mLに希釈します。900 μL の TSB + 5 mM CaCl2 を含む微量遠心チューブに 100 μL の 1 x10 10 PFU/mL ファージを添加し、最終濃度を 1 x109 PFU/mL にします。次に、900 μL の TSB + 5 mM CaCl2 を含む追加の微量遠心チューブに、濃度が 1 x 104 PFU/mL になるまで段階希釈します。6 枚の TSA + 5 mM CaCl2 + 選択的抗生物質寒天プレートのそれぞれを、1 x104 から 1 x 109 PFU/mL までの段階希釈液で標識します。
    5. プラスミドを含む 黄色ブドウ球菌 RN4220をTSB + 5 mM CaCl2 1 mLに再懸濁します。インキュベーターから 109 スナップキャップチューブを取り出し、プラスミドを含む再懸濁 RN4220 10 μL と 10 x10 9 PFU/mL ファージ希釈液 100 μL を迅速に追加し、反転させて混合し、内容物を対応する TSA + 5 mM CaCl2 + 選択的抗生物質寒天プレートに注ぎます。
    6. この手順は、残りのファージ希釈液とそれぞれのプレートに対して行います。柔らかい寒天をプレート上で固めるのを待ってから、柔らかい寒天を上に向けて37°Cで一晩インキュベートします。
    7. 翌日、プラーク(細菌の芝生のクリアランス領域)がプレートに見えることを確認します(図2A)。プラークは、ファージがRN4220にうまく感染した溶解領域を表しており、一部のファージは目的のプラスミドを取り込んでいます。希釈量が最も少ないファージストックで、ほぼコンフルエントな溶解を持つプレート(例:1 x 109 PFU/mL ファージ)と、これより下の 2 つの希釈を受けたプレート(この場合、1 x 108 PFU/mL と 1 x 107 PFU/mL、どちらもコンフルエントに近い溶解を持つ)を選択します。
    8. 3 mLのTSB + 5 mM CaCl2 を、これらのプレートの最も希釈度の低いプレート(この例では1 x 109 PFU/mL)まで加えます。滅菌L字型セルスプレッダーを使用して、通常の寒天から柔らかい寒天の層を穏やかにこすり落とします(図2B)。セルスプレッダーを使用して寒天をできるだけ乱らし、軟寒天からのファージの放出を促進します。
    9. 最初のプレートの軟質寒天が完全に破壊されたら、軟質寒天とブロススラリーを次のプレート(この場合は 1 x 108 PFU/mL)に静かに注ぎます。このプレート上の柔らかい寒天をこすり落として乱し、得られたスラリーを最終プレートに注ぎ、繰り返します。
    10. 3つのプレートすべてから柔らかい寒天スラリーを調製した後、スラリーを50mLの円錐形チューブに静かに注ぎます。柔らかくピペットで柔らかくなり、さらに混乱させますが、気泡の形成は避けてください。ボルテックスはファージを損傷し、力価を低下させる可能性があるため、ボルテックスしないでください。
    11. 軟質寒天スラリーを4,000 x g でRTで10分間遠心分離し、0.45 μmフィルターに接続されたシリンジに上清を静かに注ぎます。
      注意: 穏やかに注ぎ、寒天の破片がフィルターに入らないようにすることが不可欠です。これらの破片はフィルターを詰まらせ、残りの上清のろ過を防ぎ、力価を低下させます。
    12. 得られたファージライセートの力価を野生型RN4220を用いて決定する21.
  3. レポータープラスミドを黄色 ブドウ球菌 株に形質導入により導入します。
    1. 500 μg/mL のクエン酸ナトリウムと適切な濃度の選択的抗生物質を含む 8 枚の TSA プレートを調製します。目的のレシピエントである 黄色ブドウ球菌 株をプレーンなTSAに密に線引きし、37°Cで一晩インキュベートします。
    2. 翌日、プレートを綿棒で拭き取り、レシピエント株を1 mLのTSB + 5 mM CaCl2に再懸濁します。
    3. 目的のレポータープラスミドを運ぶファージストックを1 x1010 PFU /mLに希釈します。
    4. 1.5 mLのTSB + 5 mM CaCl2、0.5 mLの再懸濁レシピエント株、および0.5 mLの希釈ファージストックを50 mLのコニカルチューブで混合します。37°Cでインキュベートし、225rpmで振とうしながら20分間。
      注:インキュベーション時間を長くすると、ファージがレシピエント細胞を溶解し始めるときに形質導入効率が低下する可能性があるため、推奨されません。
    5. 直後に、滅菌ろ過した氷冷0.02 Mクエン酸ナトリウム(水溶液)1 mLをコニカルチューブに加え、4,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 次に、ペレットを氷冷した0.02 Mクエン酸ナトリウム1 mLに再懸濁します。
    6. 500 μg/mLのクエン酸ナトリウムと適切な濃度の選択的抗生物質を含む6枚のTSAプレートのそれぞれに100 μLのアリコートを広げます。37°Cで一晩インキュベートします。
    7. 翌日、形質導入プレートから、500 μg/mL クエン酸ナトリウムと適切な濃度の選択的抗生物質を含む残りの 2 つの TSA プレートに、個々のコロニーをストリークします。37°Cで一晩インキュベートします。
      注:追加のクエン酸ナトリウムプレートでのこの継代ステップは、形質導入細胞の周囲のファージの力価を低下させるのに役立ち、溶解を防ぎます22。
    8. ストリークプレートから個々のコロニーを採取し、選択的抗生物質を含むTSBで細胞を指数関数的に増殖させ、将来の使用のために-80°Cで25%グリセロールで保存します。

2.  緑膿菌の標識による蛍光レポーター株の生成

注:レポータープラスミドを大腸菌クローニング株から緑膿菌に移動させることは、三重交配25によって行うことができる。目的のプラスミドを運ぶ大腸菌のドナー株(夫婦の移行のためのoriTを含む必要があります)、大腸菌HB101 + pRK2013 - 結合を容易にするヘルパー株(pRK2013プラスミドの維持に50μg/mLカナマイシンを使用)、およびプラスミドを受け取る緑膿菌レシピエント株が必要です。この例では、目的のプラスミドにはテトラサイクリン(Tet)耐性マーカーがあるため、プラスミドを含む大腸菌培養物には10 μg/mL Tetが必要であり、プラスミドを含む緑膿菌は選択26に75 μg/mL Tetが必要です。

  1. -80°Cで25%グリセロール中に保存した凍結ストックから、適切な抗生物質を含むリソジェニーブロス(LB)に細菌を接種し、一晩で増殖させ、37°Cで225rpmで振とうします。
  2. 翌日、各液体200 μLを一晩培養し、適切な選択的抗生物質を含むLB寒天プレートに広げます。形質転換交配の数に応じて、ヘルパー株とドナー株のためにより多くのプレートを広げます。変身ごとにヘルパー/ドナーのプレートが1つ推奨されます。プレートを37°Cで一晩インキュベートして、各系統の密集した芝生を得ます。
  3. 翌日、滅菌綿棒で各プレート表面を綿棒で拭き、微量遠心チューブの内側に沿って拭いて、成長の芝生を収集します。各チューブを短時間遠心分離(5秒間パルス)して、細胞をチューブの底に集めます。各細胞ペレットを200 μLのLBに再懸濁します。
    注:再懸濁液は非常に厚く、不透明で、塊がないように見える必要があります。
  4. 交配ごとに新しい微量遠心チューブに、レシピエントの 緑膿菌 株5 μL、目的のプラスミドを持つドナー 大腸菌 株160 μL、ヘルパー 大腸菌 HB101 + pRK2013の160 μLを組み合わせます。ピペッティングで上下に動かしながら穏やかに混合し、乾燥済みのLB寒天プレートに50 μLの混合物をスポットします。また、コントロール用のLB寒天培地に各個々の菌株のスポット20μL。スポットをプレート内で完全に乾かし、37°Cで3〜6時間インキュベートします。
    注:LB寒天培地を事前に乾燥させると、50μLのスポットが表面全体に広がるのを防ぎ、細胞がより小さな領域内で相互作用するように強制されます。
  5. インキュベーション後、ピペットの先端を交配スポット全体にそっとスワイプして、一部の細胞を新しい微量遠心チューブに移します。チューブの底に細胞を収集するために、短時間遠心分離します。200 μL の LB に再懸濁し、再懸濁全体を LB + Irgasan (Igr; 25 μg/mL) + Tet (75 μg/mL) 寒天プレートにプレート化します。
    注: 緑膿菌は イグラサンに対して本質的に耐性があり、目的のプラスミドにはテト耐性マーカーが含まれているため、うまく形質転換された 緑膿菌 のみがLB + Irgasan + Tetプレート上で増殖できるはずです。形質転換効率によっては、嵌合スポット全体を再懸濁してめっきすると、翌日には形質転換剤の芝生ができる場合があります。個々のコロニーを達成するには、(i)嵌合スポット全体をより大きなLBに再懸濁し、その後、その200μLをプレート化するか、または(ii)嵌合スポットのごく一部を微量遠心チューブに移し、次に200μLに再懸濁してプレート化します。
  6. 個々の株のコントロールスポットを使用して、高密度細胞スポットの一部をピペットチップに静かにスワイプし、新しい微量遠心チューブに移し、200 μLのLBに再懸濁し、次に50 μLをLB + Irgasan + Tet寒天プレートにスポットします(複数のコントロールスポットを同じ寒天プレートに配置できます)。スポットが完全に乾くのを待ちます。すべてのプレートを37°Cで一晩16〜20時間インキュベートします。
    注:コントロールスポットの場合、目標は、抗生物質プレートが 緑膿菌 形質転換体に対して選択的であることを確認することです。LB + Irgasan + Tet寒天プレートにスポットしたときにコントロールスポットが集中しすぎている場合、成長と間違えられる可能性のある死んだ細胞のハローが存在するため、選択が翌日に機能したかどうかを判断するのが難しくなります。
  7. 翌日、LB + Irgasan + Tetプレートの抗生物質選択性を、個々の株制御スポットの細胞増殖の欠如に注目して確認します。
    注:トリペアレンタル交配LB + Igrasan + Tetプレートに現れるコロニーは、目的のプラスミドを運ぶ 緑膿菌の 形質転換体です。
  8. LB + Irgasan + Tet寒天にコロニーを選んでストリークし、一晩成長させて、交配混合物から余分な死んだ 大腸菌 を取り除くオプション。
  9. 個々のコロニーを選び、目に見えるほど濁るまで液体LB + Tet(75 μg/mL)で3〜6時間増殖させた後、凍結ストックを25%グリセロール(500 μL細胞培養+ 500 μL 50%グリセロール水溶液)に貯蔵します。クローンがコロニーPCRとそれに続くサンガーまたは全プラスミドシーケンシングによって正常に形質転換されることを確認します。

3. パーシスターアッセイのための抗生物質用量の決定

注:持続性実験のために細菌集団を治療するための特定の抗生物質の用量を選択するには、まず、目的の細菌株に対する抗生物質の最小阻害濃度(MIC)を測定します。これは、ブロス微量希釈法(Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)が推奨するアプローチ)または、さまざまな抗生物質用量の試験ストリップを使用して行われるEpsilometerテスト(E-test)のいずれかを使用して達成できます27。MICが決定されたら、細胞治療のためにMICの1倍から100倍の範囲の抗生物質の少なくとも5つの濃度を選択します。

  1. -80°Cで25%グリセロールで保存した凍結ストックから、2 mLの陽イオン調整MHB(CA-MHB)または他の栄養豊富な培地に細菌を接種します。250 rpmで振とうしながら37°Cで約4時間細胞を増殖させた後、125 μLの培養物を25 mLの新鮮な既知組成培地に移し、250 mLのバッフル付き三角フラスコに入れます。250rpmで振とうしながら、37°Cで16時間(固定相まで)細菌を増殖させます。
    注:コハク酸を唯一の炭素源とする基礎塩培地(BSM)は、通常、緑膿菌の実験に使用され、濃厚な化学的に定義された培地は、通常、黄色ブドウ球菌の実験に使用されます28,29,30,31。
  2. 翌朝、100x抗生物質ストック(それぞれの溶媒中)を調製し、目的の範囲のsupra-MIC濃度にします。各希釈液を10 μLずつ個々の試験管に加えます。
  3. 一晩培養のOD600 を測定して、固定相の濁度を確認します。10 μLの培養物を段階希釈し、希釈液をLB寒天培地、CA-MHB寒天培地、TSAなどの栄養寒天プレートにプレート化して、抗生物質処理前にコロニー形成単位(CFU)を決定します。
  4. 抗生物質治療のために、培養物の1mLアリコートを10 μLの100倍抗生物質濃度を含む試験管に分注します。サンプルを37°Cでインキュベートし、250rpmで振とうしながら、集団内の非残留性細胞を死滅させるのに十分な時間、残留性細胞を唯一のコロニー形成細胞として残します。
    注:治療期間は、実験と試験する細菌株によって異なります。通常、 黄色ブドウ球菌 は5時間または7時間、 緑膿菌は 7時間または24時間治療されます。一般に、時間依存性生存アッセイの第2フェーズの任意の時点を使用することができます。なぜなら、第2フェーズに残っている細胞は持続性であると予想されるからです。
  5. 抗生物質処理後、試験管から100 μLの細胞を、900 μLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む微量遠心チューブに移します。室温(21,000 x g )で3分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。900 μLの上清を取り除き、ペレットを900 μLの滅菌PBSに再懸濁します。洗浄手順を少なくとも1回繰り返して、残留抗生物質をサブMICレベルに減らします。
  6. 培養物を10倍(6倍)に連続希釈し、各希釈液の10μLを栄養寒天プレートにプレートします。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
    注:連続希釈には未処理の丸底96ウェルプレートを使用し、マルチチャンネルピペットを使用して正方形の寒天プレートにセルをプレートします。
  7. 翌日、各抗生物質濃度のコロニーを数えます。生存率 (処理終了時の CFU/処理前の CFU) を濃度に対して対数線形スケールでプロットします。将来の持続性アッセイのための薬物濃度を選択するには、二相性曲線の第2フェーズの濃度を選択します(図3)。

4. 抗生物質治療または回復中の細胞のイメージング

  1. タイムラプスイメージング用のアガロースパッドと細胞サンプルを調製します
    注:以下のサンプル調製プロトコルは、従来のアガロース「サンドイッチ」法に代わる、ユーザーフレンドリーで費用対効果の高い方法として開発されました14,16.交換可能なカバースリップディッシュを使用すると、サンプルを密封するための乱雑なグリースやマニキュアが不要になり、サンプルの通気がさらに制限される可能性があります。アガロースは、カバースリップがすでに所定の位置に装着された状態で交換可能なカバースリップディッシュにセットされるため、フリーハンドのアガロースパッド調製物と比較して、確実に平面的なアガロース表面が作成されます。全体として、この方法により、視野全体にわたって焦点が合ったサンプルのイメージングが可能になり、安定した加湿により長時間のイメージングが可能になりました。ここで説明する方法は、抗生物質治療中の細菌を視覚化するために使用されます(図 4, 補足ビデオ3そして 補足ビデオ4).抗生物質治療後に蘇生および再覚醒する持続性を視覚化すること(図 5, 補足ビデオ5そして 補足ビデオ6)、使用済み培地の代わりに新鮮な培地でアガロースパッドを調製し、パッドに抗生物質を添加しないでください(プラスミド維持/抗生物質選択のために添加したものを除く)。
    1. 滅菌済みの30 mmカバースリップ(#1.5厚さ)を、交換可能なカバースリップディッシュ(「チャンバー」)のステンレス鋼ベースの底に置きます。ポリカーボネートインサートをベースにそっとねじ込み、30mmのカバースリップがチャンバーのベースを形成するようにし、付属のシリコンOリングを圧縮して所定の位置に密封します。この手順を繰り返して、複製チャンバーを準備します。
      注:チャンバーの1つの調製が最適でない場合に備えて、各実験で重複を調製することをお勧めします。30mmのカバーガラスにカスタム3Dプリントの仕切りを配置して、 緑膿菌 のような運動性細胞が交差汚染するのを防ぎ、サンプル位置の目印を提供します。3Dプリント用のSTLファイルは、 補足ファイル1で入手できます。
    2. 選択した培地を使用して、50 mLのコニカルチューブに1.5%アガロースを調製します。やさしく渦を巻いて混ぜます。
      注:処理中の固定期細胞のイメージングには、固定期一晩培養した無細胞使用培地をベース培地として使用します。通常、アガロース培地は、2 つのチャンバーを調製するために 7 mL の培地に 0.105 g のアガロースとして調製されます。各チャンバーには2 mLのアガロース培地が必要であり、余剰分はピペッティング時の気泡を防ぐのに役立ちます。
    3. 50 mLの円錐形をガラスビーカーまたは電子レンジ対応ホルダーに入れます(キャップが緩んでいることを確認してください)。電子レンジを強にして、3〜4秒ごとに停止して渦巻き巻き、混合します。アガロースの混合物が泡立つのを防ぐために、頻繁に一時停止して混ぜます。
      1. 合計加熱時間が~1分後、混合物に溶けていない目に見えるアガロースが残っているかどうかを確認します。混合物が均一に透明な場合は、アガロース培地を~60°Cまで短時間冷却してから、追加の薬物や染料を添加します。穏やかに渦を巻いて混ぜ合わせ、気泡の形成を防ぎます。
        注:ヨウ化プロピジウム( 緑膿菌 の場合は16 μM、黄色 ブドウ球菌の場合は1.6 μM)を添加して、細胞の生存能力が失われたときを視覚化できます。
    4. アガロース培地が固まるのを防ぐために素早く移動し、30 mmのカバースリップで2 mLのアガロース培地をチャンバーにピペットで入れます。滅菌済みの25 mmカバースリップ(#1.5厚さ)を上部チャンバー開口部のアガロース培地にそっと置きます。これにより、アガロースパッドの脱水を防ぎ、アガロースの平坦な上面を確保して最適な位相コントラストイメージングを実現します。パッドが1〜2時間固まるのを待ちます。
    5. パッドが固まったら、PBSで適切な密度に希釈してイメージングする細胞を準備し、単一細胞を視覚化します。ここで、細胞をOD600 0.01〜0.05に希釈します。
    6. 25 mmのカバースリップに、細い油性マーカーを使用して、パッドに播種された各サンプルの位置/識別をマークします。ステンレス製のベースリングが上を向くようにチャンバーを反転させ、ポリカーボネート製インサートを下に保持しながらベースを緩めます。ステンレス製のベースを横に置きます。30mmのカバースリップをパッドから慎重にスライドさせて外し、廃棄します。
      注意: 30 mmのカバースリップを水平にスライドさせて取り外し、アガロース表面がへこまないように注意してください。また、露出したアガロース表面での作業は避けてください:ほこりが付着すると、画質に影響を与え、パッドを汚染する可能性があります。
    7. 25 mmカバースリップのマークを目安に、希釈した細胞の5 μLをアガロースパッド上のそれぞれの位置にスポットします。5 μL スポットを 3 つ追加します (必要に応じて、4 x 4 μL スポットなど、これを調整します)。スポットが完全に乾いたら、新しい滅菌済みの30mmカバースリップをパッドの中央に軽く置きます。
    8. 片手でポリカーボネートインサートを持ち、もう片方の手で、新しいカバースリップの上にステンレス鋼のベースをゆっくりとねじ込み直します。指で締めるまでねじ込むだけで、シリコンOリングを圧縮し、チャンバーを密閉するのに十分です。
      注:締めすぎないように注意してください - サンプル表面に対する30 mmのカバースリップがステンレス鋼のベースによって圧縮され、繰り返しねじられると、セルが放射状に広がり、サンプルの相互汚染を引き起こす可能性があります。
    9. チャンバーが密閉されたら、アガロースが30mmのカバースリップの表面に接触しているかどうかを確認します。この時点では、通常、完全ではありませんが、一部の表面接触があります。ピンセットまたは同様の器具の鈍い端を使用して、アガロースが表面全体で30mmのカバーガラスに均等に触れるまで、25mmのカバーガラスをそっと押します。
      注意: この手順により、過度の力がかかると、25mmのカバースリップが破損する可能性があります。
    10. アガロースが30 mmのカバースリップにしっかりと押し付けられ、大きな気泡が残らないようにすると、パッドをイメージングする準備が整います。
  2. 顕微鏡と画像を設定します。
    1. 顕微鏡とイメージングチャンバーの環境制御を準備します。ステージトップインキュベーターと大型チャンバーインキュベーターの温度を37°Cに設定し、チャンバー加湿器をオンにします。アガロースパッド調製物の1つをステージトップインキュベーターに入れ、インキュベーションチャンバーを閉じてサンプルを平衡化させます。ステージトップインキュベーターの加湿蓋は、チャンバーの25mmカバーガラスに結露しないように、この時点で開いたままにします。
      注意: 温度変化によるパッドの収縮/膨張は、オートフォーカスアルゴリズムのスキャン範囲を超える時間点間のドリフトを引き起こす可能性があります。イメージングの前に、アガロースパッドを安定した温度に平衡化することが重要であり、通常、少なくとも15分かかります。また、十分な温かさにより、加湿蓋を装着した際に上部のカバーガラスに結露が生じるのを防ぎます。イメージングシステムのハードウェアコンポーネントは、(資料表):生細胞インキュベーションチャンバー、Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil Ph3 M27対物レンズを備えた倒立顕微鏡、Spectra 7 LEDライトエンジン、およびsCMOSカメラ(6.5 μmピクセルサイズ)でした。顕微鏡の電動コンポーネントの制御と画像取得は、顕微鏡分析ソフトウェアアプリケーションを使用して行われます。
    2. 画像取得用のソフトウェアを準備します。MetaMorph(顕微鏡分析ソフトウェア)の組み込みオートフォーカスアルゴリズムを、多次元取得時に位相チャネルを使用するように設定します。
      1. Stageタブでは、各サンプルに複数のステージ位置を設定し、セル密度が均一に分布する視野を目指します。[タイムラプス]タブで、撮影する画像の希望の期間と頻度(時間間隔)を設定します。[Wavelengths]タブで、取得するチャンネルを設定し、サンプルの信号強度の露光時間を調整します。
        注:各位置の画像は、最大24時間、10分ごとに撮影されます。この記事で言及した色素/蛍光色素の蛍光イメージングには、ヨウ化プロピジウム(Cy3;555/15 nm)およびGFP(GFP/FITC;470/24 nm)の光エンジン励起設定を使用しました。使用される一般的な蛍光励起露光時間は100msです。ヨウ化プロピジウム用フィルターセット15(ビームスプリッターFT580、エミッションLP590)、GFP用フィルターセット44(ビームスプリッターFT500、エミッションBP530/50)を使用します。
    3. アガロースパッドがチャンバー内で温まったら、加湿蓋をステージトップインキュベーターに追加します。これにより、イメージング中にパッドが脱水したりずれたりするのを防ぐことができます。
    4. 加湿蓋を装着した状態で、位相干渉コントラスト(DIC)から微分干渉コントラスト(DIC)に変更し、顕微鏡のコンデンサーと絞りダイアフラムを調整して、ケーラーの照明を適切に設定します。
    5. 調整後、位相に戻します。各ステージ位置に移動し、フォーカスを調整して、ステージ位置を新しい焦点面にリセットします。これで、イメージングを開始するための設定が完了しました。
      注意: 各sを再確認することが重要ですtage取得を開始する前に、パッドがずれていないことを確認します。特定のステージ位置で再表示したときにセルにフォーカスが合っていない場合は、セルに再度フォーカスを合わせ、前のステージ位置をオーバーライドします。オートフォーカスアルゴリズムの設定では、最後の時点から3μm±焦点z位置をサーチ範囲として使用するため、パッドが3μm以上離れると、アルゴリズムは適切にピントを合わせることができません。
    6. [ 集録 ] ボタンをクリックして、多次元集録を開始します。
    7. 実験が完了したら、各チャンネルの個々の画像をスタックにコンパイルして、ビデオとして表示したり、他の分析に役立てたりします。これを行うには、MetaMorph または ImageJ を使用します。
      1. MetaMorph で画像をコンパイルするには (推奨)、 Review Multi Dimensional Data アプリで、目的のチャネル/波長を選択し、特定のステージ位置のすべての時点を選択します。 [画像の読み込み] をクリックします。ウィンドウは、チャネル/波長ごとに表示されます。各コンパイルをそれぞれのチャネル名で .tiff ファイルとして保存します。
      2. ImageJ でコンパイルするには、1 つのステージ位置と 1 つのチャネルのすべての時点のファイルを開きます。 Images to Stackを使用してコンパイルします。

5. Fiji/ImageJを使用したタイムラプス動画の作成

注:フィジー(フィジーはImageJ)は、画像処理と分析のための無料で利用できるソフトウェアで、ここからダウンロードできます:「https://imagej.net/software/fiji/downloads32」32。Fiji/ImageJ2 1.54fは、以下に説明する画像処理方法に使用しました。

  1. BaSiC33を使用して位相チャネル画像スタックをシェード補正します。フィジーで目的のフェーズイメージスタックを開き、[プラグイン]タブから[BaSiC]を選択します。シェード補正されたスタックは、[Corrected:ImageName] というタイトルの別のウィンドウに表示されます。
    注:BaSiC.jarはここからダウンロードできます:「https://github.com/marrlab/BaSiC33」33。開発者の指示に従って、BaSiCをフィジーに正しくインストールします。
  2. シェード補正された位相チャンネルスタックを他のチャンネル/波長とマージするには 、Image > Color > Merge Channelsを使用します。Image >で背景と信号の強度を調整します 各チャンネルの 明るさ/コントラスト>調整 します。マージされたファイルを.tiffとして保存します。
  3. 次に、 3Dドリフト補正を使用して画像を安定させます。シェード補正されたスタックを選択した状態で、[ Plugins] > [Registrations] > [Correct 3D Drift] に移動します。開いたダイアログウィンドウで、登録するチャンネルをフェーズスタックに対応するチャンネル番号に設定します。修正後のスタックには、 登録されたタイムポイントというタイトルが付けられます。目的の視野に切り抜き、修正したファイルを.tiffとして保存します。
    注:MetaMorphを使用してコンパイルされたイメージスタックを作成した場合は、追加の処理手順があります:イメージ>のプロパティに移動し、スライス(z)フィールドとフレーム(t)フィールドの番号を入れ替えます。ドリフト補正では、各フレームを Z スタックのスライスではなく、タイムポイントとして適切に解釈できるようになりました。シェード補正およびドリフト補正された.tiffファイルは、その後の画像解析で使用できます。蛍光シグナル強度の測定、形態学的特性の定量化、個々の細胞の運命の追跡など、多くのソフトウェアパッケージが利用可能です。一般的に使用される 2 つのプログラムは、Fiji 用の MicrobeJ プラグインと Oufti34,35 です。
  4. タイム スタンプとテキスト ラベルをスタックに追加するには 、Image > Stacks > Label を使用します。
  5. スケールバーを追加するには、まず、カメラのピクセルサイズと顕微鏡の対物レンズ倍率を把握します。ピクセル:ミクロンの比率を、ピクセルサイズを倍率で割った値として計算します。 [解析] > [スケールの設定 ] ダイアログ ボックスで、 既知の距離 フィールドにピクセルとミクロンの比率を入力します。次に、[ > ツールの分析] > [スケール バー] を使用して、スケール バーをスタックに追加します。
    注:顕微鏡の正確なスケールは、ステージマイクロメーターを使用して校正する必要があります。ただし、使用する顕微鏡の対物レンズとカメラを使用すると、スケールの大まかな見積もりを提供できます。例えば、ここで使用しているPCO sCMOSカメラの画素サイズは6.5×6.5μm2で、撮像には63倍の対物レンズを使用したため、画素サイズを倍率で割ると1画素あたり6.5/63=0.1032μmとなります。[スケールの設定] ダイアログ ボックスの既知の距離フィールドに 0.1032 を入力します。
  6. 完成した画像スタックをQuickTime PlayerやMicrosoft PowerPointなどで再生できる動画として書き出すには、.aviファイルとして保存します。

結果

レポータープラスミドの 緑膿菌 および 黄色ブドウ球菌 への導入の成功は、正しい選択的抗生物質の増殖によって示され、コロニーPCRおよび/またはシーケンシングによって確認することができます。改変された株は、目的の遺伝子が誘導されることが知られている条件にそれらをさらすことにより、表現型レポーターとして検証する必要があり、結果として生じる蛍光は、フローサイトメトリー、分光光度法、または落射蛍光顕微鏡法で測定できます(図1)。

その後の実験に使用する抗生物質の用量の選択を容易にするために、目的の 緑膿菌 または 黄色ブドウ球菌 株の濃度依存性抗生物質持続性アッセイを実施します。濃度依存性アッセイでは、通常、抗生物質濃度が低いと初期傾斜が急になり、高濃度ではプラトーまたはそれほど急でない傾斜を持つ二相性曲線になります。ただし、一部の抗生物質と生物種のペアでは、明確な二相性曲線が生じない場合があります。例えば、 黄色ブドウ球菌(S. aureus delafloxacin)の曲線は明らかに二相性であるが(図3A)、 緑膿菌の レボフロキサシン曲線はそうではない(図3B)15。このシナリオでは、MICの少なくとも10倍の濃度を選択します(たとえば、5μg/mL、 これは緑膿菌のMICの約15倍です)15。ただし、15x レボフロキサシン MIC では 緑膿菌 の生存者は ~0.001% しか得られないため、抗生物質を含まないアガロース パッドで細胞が回復する細胞をイメージングする際に持続性を確認したい場合は、1 μg/mL のレボフロキサシン治療を使用します (補足ビデオ 6)。そうしないと、複数の永続性をイメージングするために必要な視野の数が非常に多くなります。

イメージングの開始時には、理想的なサンプルとアガロースパッドの調製は、視野全体にわたって平面的であり、大きな破片、しわ、気泡がなく、単一細胞が均一に分布している必要があります。十分に分布した単一細胞を得るには、サンプルの希釈または再懸濁の最適化が必要になる場合があります。黄色ブドウ球菌の場合、細胞は小さなクラスターを形成する傾向があり、アガロースパッドに播種する前に十分にボルテックスする必要があります(図4および図5)。緑膿菌の場合、細胞は懸濁液中の粘着性のある細胞外マトリックスに包まれた凝集体を形成することがあります。これらのサンプルを徹底的にピペットで動かし、単一細胞をイメージングするために凝集体を破壊する必要があります。

イメージング実験の終了後、画像のタイムラプスが成功裏に行われ、焦点が合って安定して照らされ、実験全体を通してx-y平面のドリフトが最小限に抑えられます。 補足ビデオ7 は、最適な画像取得を表します:tは、シェード補正またはドリフト補正前の 補足ビデオ4 の位相チャネルです。結露(過加湿またはサンプルの加温不足による)により、上部の25 mmカバーガラスに水滴が形成され、光が歪んで焦点面がオートフォーカスアルゴリズムの最大探索範囲外に押し出されると、焦点が合わなくなることがあります(補足ビデオ8)。照明のばらつきは、通常、イメージング時の浸漬油が不十分であることを示しています。ステージの動きが速すぎると、対物レンズの油が後ろに引きずられ、画像が取得されたときにまだ追いついてしまう可能性があります。これは、アクイジションコントロールを調整して移動速度を遅くするか、次の位置への移動と画像取得の間に一時停止を追加することで軽減できます。主要なサンプルドリフトは、多くの細胞が視野を横切って縞模様になっているように見えますが、一部の細胞はその場に留まっています(補足ビデオ9)。これは通常、湿度制御が不十分なためにアガロースパッドが脱水したため、実験の後半で発生します。この論文で紹介したアガロースパッド調製は、サンプルの安定性を促進するように設計されていますが、最適な画像取得には、サンプルとその周辺環境を適切に温め/加湿する必要があります。

figure-results-1
図1: 目的の遺伝子の発現を照らす蛍光レポーター株。 (A) 黄色ブドウ球菌 は、プロトコル1に従って目的の遺伝子についてGFP転写レポーターで形質導入されました。レポーター株を抗生物質で24時間処理し、PBSで洗浄した後、CA-MHBとヨウ化プロピジウム(1.6 μM)およびクロラムフェニコール(レポータープラスミド維持用10 μg/mL)を添加したアガロースパッドに播種し、回収中のイメージングを行いました(補足ビデオ1)。(B) 緑膿菌 は、目的のタンパク質について、mScarlet結合トランスレーショナルレポーターを持つプラスミドで形質転換されました26。レポーター株を抗生物質で 5 時間処理し、PBS で洗浄した後、BSM と Tet を併用したアガロースパッド (75 μg/mL、レポータープラスミドの維持用) に播種し、回復中のイメージングを行いました (補足ビデオ 2)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:バクテリオファージの繁殖と収穫 (A)6枚のプレートは、 黄色ブドウ球菌 RN4220の芝生上の6つの異なる量の希釈ファージストックを示しています。赤色の枠線は、最も透明度の高いプレート(太字の赤色の枠線、1 x109 PFU/mL)から次の 2 つの希釈液(1 x108 および 1 x 107 PFU/mL)まで、回収される 3 枚のプレートを示しています。黒い矢印は個々のプラークを指しています。(B)プレートからファージを採取するには、軟質寒天層を掻き取り(左)、スラリーを次の希釈プレートに移し(中央)、3つのプレートすべてから軟質寒天を一緒にプールした後、遠心分離用の円錐形のチューブに結合します(右)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:代表的な濃度依存性持続性アッセイ。濃度依存性フルオロキノロンの持続性は、固定相(A)黄色ブドウ球菌(デラフロキサシンに対して)および(B)緑膿菌(レボフロキサシンに対して)で評価されました。.その後の実験では、黄色ブドウ球菌の死滅がこの濃度で頭打ちになったため、5 μg/mL のデラフロキサシン (赤丸) を使用します。少なくとも1μg / mLのレボフロキサシン(赤い丸)の投与量は、その後の緑膿菌の実験に使用されます。.細菌の死滅は緑膿菌にとって横ばいではないことに注意してくださいが、持続的な亜集団を示す二相性曲線のそれほど急な「第2段階」はありません。パネル3Bは、Hareら15の許可を得て改作されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:抗生物質治療中の細菌表現型のイメージング。 固定期(A)黄色ブドウ球菌 および(B)緑膿菌 細胞をフルオロキノロン系抗生物質を含むアガロースパッドに播種し、治療中にモニタリングした: 黄色ブドウ球菌 には5μg/mLのデラフロキサシン(補足ビデオ3)、 緑膿菌 には5μg/mLのレボフロキサシン(補足ビデオ4)15。ヨウ化プロピジウム(PI; 緑膿菌は16 μM、 黄色ブドウ球菌は1.6 μM)をパッドに添加して、死細胞または死にかけている細胞をマークしました。 黄色ブドウ球菌 細胞は、FQの存在下で大部分が無傷で生存しているのに対し、ほとんどの 緑膿菌 細胞は、溶解して死ぬ前に、丸い球状形成体の形成を含む劇的な形態学的変化を経ます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:回復中の持続性の追跡 (A)黄色ブドウ球菌 および(B)緑膿菌 の集団を、フルオロキノロン( 黄色ブドウ球菌 には5 μg/mLのデラフロキサシン、 緑酸菌には1 μg/mLのレボフロキサシン)で処理した後、新鮮な培地を含むアガロースパッドに播種し、治療後の回復中にモニタリングしました(補足ビデオ5 および 補足ビデオ6).観察されたペリシスターは、各パネルの最初の2つのフレームに緑色の矢印で示されており、抗生物質治療中も無傷で生存可能なままでした。最初の遅延期間の後、永続性は分裂し始め、新しい子孫(緑の円で示されています)を生み出しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-6
図6:顕微鏡サンプル調製。 (A)交換可能なカバースリップディッシュ(「チャンバー」)を使用したサンプル調製ワークフローの概略図。 (B)分解されたチャンバーとその個々のコンポーネントの写真。(C)完全に組み立てられたチャンバーの写真。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ビデオ1:黄色ブドウ球菌。図 1A の画像を含むビデオ ファイル。簡単に言うと、目的の遺伝子のGFP転写レポーターを持つ黄色ブドウ球菌を抗生物質で24時間処理し、PBSで洗浄した後、CA-MHBとヨウ化プロピジウム(1.6μM)およびクロラムフェニコール(10μg/mL)を添加したアガロースパッドに播種して、回復中のイメージングを行いました。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ビデオ2:緑膿菌持続性。 図 1B の画像を含むビデオ ファイル。簡単に言うと、目的のタンパク質に対してmScarlet結合トランスレーショナルレポーターを持つ緑膿菌を抗生物質で5時間処理し、PBSで洗浄した後、BSMとTet(75μg/mL)を併用したアガロースパッドに播種し、リカバリー中にイメージングを行いました26。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ビデオ3:抗生物質治療中の黄色ブドウ球菌。化学的に既知な高濃度培地で増殖させた黄色ブドウ球菌の固定相培養液を、ヨウ化プロピジウム(1.6 μM)とデラフロキサシン(5 μg/mL)を含む無細胞馴染培地から作製したアガロースパッドに播種しました。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ビデオ4:抗生物質治療中の緑膿菌。BSMで増殖させた緑膿菌の固定期培養物を、BSMで増殖させた緑膿菌の培養物から無細胞馴化培地を作製したアガロースパッドに播種しました。アガロースパッドには、ヨウ化プロピジウム(16 μM)とレボフロキサシン(5 μg/mL)も含まれていました。このビデオは、Hare et al.15の許可を得て改作したものです。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ビデオ5:抗生物質後の回復中の黄色ブドウ球菌。 黄色ブドウ球菌は、化学的に既知な豊富な培地で固定相まで成長しました。固定相培養物を試験管内で5 μg/mLのデラフロキサシンで24時間処理し、PBSで洗浄した後、ヨウ化プロピジウム(1.6 μM)を含む抗生物質を含まないCA-MHBアガロースパッドに播種してイメージングしました。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ビデオ6:抗生物質の回復後の緑膿菌。BSMで増殖させた緑膿菌の固定期培養液を試験管内で1 μg/mLのレボフロキサシンで7時間処理し、PBSで洗浄した後、ヨウ化プロピジウム(16 μM)を含む抗生物質を含まないBSMアガロースパッドに播種してイメージングしました。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足動画7:最適な画像取得の例。 このビデオは、最適なタイムラプス取得の例として、画像処理前の 補足ビデオ4 の位相チャネルです。実験全体を通して、ドリフトが最小限に抑えられ、照明が安定し、焦点が維持されていることに注意してください。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足動画8:結露による画像取得が最適でない例。 このビデオは、サンプルの不適切な加熱やイメージング環境の過加湿によるチャンバーの結露などにより、画像取得がピント不良の影響を受けた場合の実験の一部を示しています。画像化されたサンプルは、BSMアガロースパッド上で抗生物質の回収後にレボフロキサシンで処理された 緑膿菌 でした。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足動画9:ドリフトによる画像取得が最適でない例。 このビデオは、脱水とカバーガラスからのアガロースパッドの収縮/浮き上がりなどにより、画像取得がサンプルドリフトの影響を受けた場合の実験の一部を示しています。画像化されたサンプルは、レボフロキサシンとヨウ化プロピジウムを含むアガロースパッド上の 緑膿菌 でした。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:25mm-3D-divider-for-35mmBioptechs.stl このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

タイムラプス顕微鏡実験の成功は、アガロースパッドの品質とイメージング過程全体にわたる安定性にかかっていることがわかりました。ステンレス製のチャンバー密閉型アガロースパッドは比較的調製が容易なため、一貫して平面状のサンプルが得られ、数十時間にわたって安定してイメージングできます。これにより、1回の実験で数万個の細胞をイメージングすることが可能になり、集団内の持続性細胞のようなまれな表現型変異体を検出する可能性が高まります。

このアガロースパッド調製法は、以前に発表された方法に代わる、簡単に実装できる方法を提供します。当社のプロトコルは、マイクロ流体デバイス製造の技術的精度やアガロースの「サンドイッチ」法の巧みな操作を必要としないため、14,16,36の実行ごとに一貫した準備を簡単に達成できます。さらに、このシステムは費用対効果に優れています。ステンレス製のチャンバーは滅菌可能で再利用可能で(使い捨てのプラスチックチャンバーとは異なり)、セットアップには特別な機器は必要ありません16,37。このチャンバーは、市販のステージインサートを使用して、さまざまな顕微鏡システムに容易に適合させることができます。さらに、細菌はアガロースとカバーガラスの界面に固定されているため、緑膿菌のような高運動性細菌を追跡しながら、形態学的変化を許容することに成功しています(図4、補足ビデオ4)。「マザーマシン」などの他のシングルセルイメージング技術は、フィラメント形成36以外の形態学的変化の観察を排除するチャネルに細胞を閉じ込める。

このプロトコルを成功させるためには、いくつかの重要な手順とパラメータに注意する必要があります。パッドの準備では、残っているアガロースの結晶が光の回折を引き起こし、画質に影響を与えるため、アガロースを完全に加熱して溶かすことが重要です。同様に、気泡を導入せずにアガロースをチャンバーにピペットで移すように注意する必要があります。アガロースパッドの厚さを一定に保ち、サンプルドリフトを制限するには、イメージングを開始する前に、加湿された温度制御されたエンクロージャ内でパッドを平衡化させることが重要です(通常は15分間)。低湿度はアガロースパッドの脱水と収縮を引き起こし、高湿度(またはチャンバー内の不適切なサンプル加温)は、暖かい空気がサンプル上に凝縮し、イメージングを歪める可能性があります。結露による最適でないタイムラプスイメージングの例は、補足ビデオ8にあります。

現在のセットアップの限界は、培地を交換できないため、抗生物質治療前、治療中、治療後の個々の細菌の継続的な追跡が妨げられることです。アガロースパッドをフローセルや培地交換を可能にするマイクロ流体デバイスと結合させることで、栄養状態や環境の変化時に集団を追跡できるようになると期待しています。現在の設計で改善できる別のパラメータは、サンプルの曝気です。交換可能なカバースリップ皿のOリングシール、ねじ上設計は、パッド16をシールするためにワックスまたはグリースベースのシーラントの使用を必要とするセットアップと比較して、より良いサンプル曝気を可能にします。ただし、密閉チャンバー内の曝気はまだ制限されている可能性があり、偏性好気性菌の成長をサポートしない可能性がありますが、これはまだテストされていません。

この記事で紹介するタイムラプスイメージングサンプル調製プロトコルを使用すると、抗生物質治療に反応する、または抗生物質治療から回復する何千もの細菌を追跡できます。また、この手法は高度に一般化可能であり、パーシスタンサーバイオロジー以外にもさまざまな応用が期待できます。例えば、アガロースパッドとディバイダーのセットアップにより、空間的に分離された細胞サンプルの播種が可能になり、アガロースパッドを介した拡散による細胞間コミュニケーションが可能になります。私たちは現在、分泌産物の交換が多種コミュニティの細胞増殖にどのように影響するかをテストするために、この設定の可能性を探っています。このプロトコルは、新しい研究者にとってタイムラプス顕微鏡への参入障壁を低くし、経験豊富な微生物学者が探求するための無限のバリエーションを提供すると期待しています。

開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

顕微鏡実験に協力してくださったUConn Health Center for Cell Analysis and Modeling Microscopy FacilityのSusan Staurovsky氏に感謝します。Mona Wu Orr博士とEssentials of Staphylococcal Genetics and Metabolism Workshopのプロトコールと、 緑膿菌 と 黄色ブドウ球菌のクローニングに関するアドバイスに感謝します。この研究は、国立衛生研究所(NIH;DP2GM146456-01および1R01AI167886-01A1はW.W.K.M.へ、1F30DE032598-01A1はP.J.H.へ、1F31DK136259-01A1はT.J.L.へ)。資金提供者は、私たちの実験の設計やこの原稿の準備には関与していませんでした。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
BaSiCGitHubhttps://github.com/marrlab/BaSiC
Certified Molecular Biology Agarose Biorad1613101
Fiji-ImageJNIHhttps://imagej.net/software/fiji/downloads
Interchangeable Coverglass DishBioptechs190310-3535 mm ICD for preparing agarose pads; comes with 30 mm (#1.5) coverslips
Lumencor Spectra 7 LEDライトエンジンLumencorhttps://lumencor.com/products/spectra-light-engineSpectra 7 LEDライトエンジン
MetaMorphMolecular DevicesPremier version 7.10.5
pco.edge 4.2 bi sCMOSカメラExcelitas https://www.excelitas.com/product/pcoedge-42-bi-usb-scmos-camerasCMOSカメラ
PeCon ライブセルインキュベーションチャンバーpeConhttps://www.pecon.biz/
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Zeiss Axiovert 200M 顕微鏡Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/widefield-microscopes/axiovert-for-materials.htmlPlan-Apochromat 63x/1.40 Oil Ph3 M27対物レンズ、Lumencor Spectra 7 LEDライトエンジン、pco.edge 4.2 bi sCMOSカメラ(6.5 mmピクセルサイズ)を搭載した倒立顕微鏡

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