方法論記事

ヒト腸内細菌叢における C-グリコシド代謝酵素の特性評価のための構造生物学および分析化学アプローチ

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DOI：

10.3791/67629

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2025年5月23日

 ,  ,  ,  , 
1The School of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

最近の研究では、 C-グリコシドの代謝におけるヒト腸内細菌叢酵素の役割が強調されています。ここでは、分析化学技術(LC-MS/MS および NMR)と構造生物学的アプローチを統合して、これらの C-グリコシド代謝酵素の構造および酵素反応鎖を系統的に特徴付けるための包括的な方法論を紹介します。

要約

腸内細菌叢は、特に食事性配糖体を代謝する能力があるため、宿主の健康の主要な調節因子として浮上しています。 C-グリコシドは 、O-グリコシドと比較して優れた化学的安定性と酵素的切断に対する耐性を示しますが、特殊な腸内細菌はそれらを選択的に代謝し、バイオアベイラビリティを向上させることができます。微生物の C-グリコシダーゼ酵素が同定されて以来、正確な反応メカニズムは未だに完全には理解されておらず、これらのプロセスを研究するための標準化された方法論はまだ十分に確立されていません。このギャップに対処するために、構造生物学、酵素学、および液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)や核磁気共鳴(NMR)などの分析技術を組み合わせた統合的な学際的アプローチを導入し、これらの酵素活性を体系的に特徴付けました。この包括的なアプローチにより、分子、酵素、代謝レベルでの C-グリコシド代謝の正確な特性評価が可能になります。

概要

最近、ヒトの腸内細菌叢は、宿主の健康をサポートする重要な役割で大きな注目を集めています1,2。これらの微生物群集は、宿主由来の化合物を代謝し、生物学的に活性な代謝物1,2,3を産生します。例えば、フラボノイドは、私たちの毎日の食事に最も多く含まれる天然化合物の中で、主にO-配糖体またはC-配糖体として存在し、それ自体は人間の腸内で吸収されにくい4。しかし、腸内細菌叢は、これらの配糖体を二次配糖体やアグリコンなどのより生理活性な誘導体に変換し、溶解度を低下させ、吸収を高めることで、天然の形態と比較して生物活性を向上させることができます5,6。

歴史的に、O-グリコシドの加水分解メカニズムは広く研究されてきました7,8。C-グリコシドは、C-Cグリコシド結合によって特徴付けられ、より大きな化学的安定性と切断に対する耐性を示します9,10。それにもかかわらず、特定の腸内細菌は、C-グリコシドを脱グリコシル化する能力を進化させました11,12。1988年、服部らは、一部の腸内細菌がC-グリコシドからグリコシル基を除去できることを初めて示した13。その後の研究により、この活性を持つ最初の細菌株が単離され、C-グリコシド切断メカニズムのさらなる探索が可能になりました14。しかし、今日まで、限られた数の腸内細菌株およびC-グリコシド代謝酵素のみが同定され、特徴付けられている14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26.最近の研究では、PUE株の脱グリコシル化プエラリン(ダイゼイン-8-C-グルコシド)酵素(DgpA/B/C)は、プエラリンをダイゼインとグルコースに切断することができることが示されています:DgpA、Gfo/Idh/MocAファミリー酸化還元酵素は、プエラリンを3''-オキソ-プエラリンに酸化し、その後、DgpB / C複合体によって媒介されるβ-排泄反応を受けてアグリコンとグルコース10を生成します。26.それにもかかわらず、C-グリコシド代謝酵素、特にDgpA/B/C系の構造的および機能的特性は未だに完全には理解されておらず、この分野の研究を進めるためには、より高度な方法論、特に生物学的および化学的戦略の統合が必要である24。

このギャップに対処するために、私たちは統合された学際的なアプローチを採用して、ヒト腸内細菌叢DgpA/B/C触媒C-グリコシド代謝反応を調査します。この反応では、DgpAはC-グリコシドのグリコシル酸化を触媒し、続いて、DgpBおよびDgpCは、酸化されたC-グリコシド産物10,26,27を特異的に切断するDgpB/C複合体を形成する。まず、DgpAとDgpB/Cの組換え発現と精製を別々に行いました。その後、精製したDgpAタンパク質とDgpB/Cタンパク質を結晶化し、X線結晶構造解析によりその立体構造を決定しました。最後に、完全なDgpA/B/C酵素系を用いてC-グリコシド切断機能を再構成し、LC-MS/MSとNMRの結合分光法27による包括的な代謝産物分析を行った。これらのアプローチに基づいて、DgpA/B/C酵素系によって触媒されるC-グリコシド代謝を研究してきました。

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プロトコル

1.タンパク質の生産と精製

  1. 表現ベクトルの構築
    注:この研究では、ヒト腸内細菌叢である PUE 株のDgpA、DgpB、およびDgpC遺伝子がモデルシステムとして機能します。最初のステップでは、発現プラスミドを使用して対応する組換えタンパク質を作製します。
    1. NCBIからDgpA/B/C遺伝子クラスター配列(GenBank:LC422372.1)を取得します。次いで、DgpA/B/C DNAを商業的に合成し、DgpA、DgpB、およびDgpC遺伝子を個別にクローニングして改変したpET-28aベクターを作成し、N末端SUMOと6×Hisタグ(His-SUMOタグ)28で標的タンパク質を作製する。
    2. DgpA、DgpB、またはDgpCプラスミドのそれぞれを 大腸菌 BL21(DE3)コンピテントセルに形質転換します。続いて、LB培地で50μg/mLのカナマイシンを含む37°Cで細菌を培養します。
    3. 細菌密度(OD600)が0.6に達したら、0.2 mM IPTGを培地に加えます。細菌を16°Cで16時間培養します。
    4. DgpA、DgpB、およびDgpCを発現する細菌培養物をそれぞれ4,000 x g で4°Cで20分間遠心分離します。 細胞ペレットを20 mLのバッファーA(表1)に再懸濁し、細菌培養物1 Lごとに調製します。
  2. タンパク質の精製
    注:高純度で十分な量の組換え酵素は、機能特性評価および構造生物学研究に不可欠です。DgpBおよびDgpCは、機能性10,26のための安定なタンパク質複合体を形成する(溶解手順中に自発的にDgpB / C複合体を形成する)。その後、DgpAタンパク質とDgpB/C複合体の精製を行います。
    1. 細菌の再懸濁液に1 mM PMSFを添加します。ステップ1.1.4からのDgpBおよびDgpC細菌懸濁液を一緒に混合し、次いでDgpA細菌懸濁液またはDgpBおよびDgpC混合物を(機能的なDgpB / C複合体を形成するために)超音波細胞撹乱器を用いて溶解する。
    2. 細菌溶解物を48,000 x g で40分間、4°Cで遠心分離します。 タンパク質を含む上清を保持し、細菌ペレットを廃棄します。
    3. ニッケルアフィニティークロマトグラフィー(Ni-NTA)カラムを使用して、上清からDgpAまたはDgpB / C複合体を精製します。ÄKTA精製器で0〜50%のイミダゾール濃度勾配をバッファーAおよびバッファーB(表1)に適用して、結合タンパク質を溶出します。
    4. 溶出したサンプル10 μLを採取し、2 μLの5 ×タンパク質色素と混合した後、垂直電気泳動システムを使用して220 Vで45分間SDS-PAGE電気泳動を行い、続いてCoomassie Blue染色してタンパク質バンドを視覚化します。SDS-PAGE解析に基づいてDgpAまたはDgpB / C複合体を含むフラクションを収集し、将来の使用に備えます。
      (注)His-SUMOタグ(17 kDa)バンドを持つDgpA(44 kDa)は、約61 kDa(図2D)で移動し、His-SUMOタグ(17 kDa)を持つDgpC(33 kDa)は約50 kDa、His-SUMOタグ(17 kDa)を持つDgpB(15 kDa)は約33 kDa(図2J)を移動します。
    5. ステップ 1.2.3 の DgpA または DgpB/C 複合体サンプルを、バッファー C に対する 10 kDa 分子量カットオフ透析メンブレンを使用してイミダゾールを除去し、ユビキチン様プロテアーゼ 1 (ULP1; 資料表)His-SUMOタグ29を除去する酵素。
    6. 透析したタンパク質サンプルをバッファーC(表1)にイオン交換クロマトグラフィーカラム(Qカラム)を通してロードします。次に、100 mMから600 mMの範囲の塩化ナトリウム濃度グラジエントを使用して、ÄKTA精製器でバッファーCおよびバッファーD(表1)を調製し、結合タンパク質をカラムから溶出します。
    7. ステップ1.2.3として、Qカラムから溶出したDgpAおよびDgpB/C複合体のSDS-PAGE分析を行い、分子量:His-SUMOタグ(17 kDa)、DgpA(44 kDa)、DgpAのオリゴマーバンド(95 kDa以上)(図2E)、DgpB(15 kDa)、DgpC(33 kDa)、DgpBおよびDgpCのオリゴマーバンド(53 kDa〜95 kDa)(図2K)に注意してください。
    8. サイズ排除カラム(SEC)とバッファーE(表1)を使用してタンパク質を精製します。溶出画分のタンパク質を用いてSDS-PAGE解析を行い、続いてCoomassie Blue染色を行い、タンパク質バンドを可視化します。SDS-PAGEによる解析後、標的タンパク質DgpAまたはDgpB/C複合体を含む画分を回収します。
      注:DgpAバンドは約44 kDaで、オリゴマー化されたDgpAバンドは95 kDaを超えています(図2F)、DgpCは約33 kDaで、DgpBは約15 kDaでオリゴマー化されたDgpBおよびDgpC(53 kDaから95 kDaの間)(図2L)。
    9. 280 nmのナノドロップを使用して、DgpAまたはDgpB / C複合体のタンパク質濃度を測定します。次に、DgpAまたはDgpB / C複合体を限外ろ過チューブで約20 mg / mLに濃縮し、分注し、液体窒素で急速凍結します。DgpAまたはDgpB / Cコンプレックスを-80°Cで保存してください。
  3. 円二色性(CD)スペクトルデータ収集
    注:DgpAによって触媒されるグリコシル酸化は代謝経路の重要な開始ステップとして機能するため、CD分光法は、DgpAの適切なフォールディング状態と二次構造的完全性の両方を検証するために特に採用されました。これらの構造パラメータは、酵素活性とタンパク質の結晶化の成功の両方にとって非常に重要です。
    1. DgpAタンパク質を1 x PBSバッファー(pH 7.4)で0.2 mg/mLに希釈します(表1)。
    2. 1x PBS緩衝液(pH 7.4)を石英キュベットにロードし、CD分光計を使用してベースラインCDスペクトルを200〜260 nmにわたって記録し、二次構造と折り畳み状態の違いを敏感に検出します27。
    3. バッファーキュベットを1.3.1のタンパク質サンプルと交換し、200〜260 nmでCDスペクトルを記録し、バッファーベースラインを差し引いてタンパク質サンプルのCDスペクトルを取得します。
    4. 精度のために3回のスキャンを収集し、二次構造の特徴とタンパク質のフォールディング状態についてデータを分析します(図3G、3H)。

2. タンパク質の結晶構造解析と構造決定

注:DgpAが適切な折り畳みと構造的完全性を維持していることを確認した後、構造生物学的アプローチを採用して、両方のDgpAの三次元構造を決定しました。DgpB/C複合体の触媒能力が以前の機能アッセイ10,26,27を通じて生化学的に確認されていたことを考えると、CDスペクトル検証ステップは省略された。

  1. タンパク質の結晶成長と最適化
    1. 0.5 μLの精製DgpA(20 mg/mL)またはDgpB/C錯体(20 mg/mL)を、結晶化キットからの等量(0.5 μL)のリザーバ溶液と48ウェル結晶プレート上にシッティングドロップ法で混合します30。結晶板を16°Cに移して結晶成長させます。
      注:これらの座っている滴を顕微鏡で観察して、DgpAまたはDgpB / C複雑な結晶成長の条件(タンパク質濃度とPEG 3350、ギ酸マグネシウムなどの沈殿物を含む)を特定します。
    2. 吊り下げ式蒸気拡散法30を用いて、DgpAおよびDgpB/C錯体の両方について結晶化最適化を行う。
    3. DgpAについては、ステップ2.1.1で特定した条件(20mMギ酸マグネシウム、20%PEG3350)から始めて、6つのPEG3350濃度勾配(17%、18%、19%、20%、21%、および22%)を4つのギ酸マグネシウム濃度勾配(16mM、18mM、20mM、および22mM)に対してテストすることにより、直交最適化アプローチを適用する。
    4. 0.8 μLのDgpAタンパク質溶液(10または20 mg/mL)と0.8 μLのリザーバー溶液をシラン化ガラスカバースリップ上に混合して、結晶化液を調製します。次に、カバーガラスを24ウェル結晶化プレートに反転させ、16°Cでインキュベートして結晶成長させます。
    5. DgpB/C 複合体の最適化では、同じアプローチに従います: 0.8 μL のタンパク質複合体 (10 または 20 mg/mL) と、酢酸マグネシウム (16、18、20、または 22 mM) および PEG 8000 (8%、9%、10%、11%、12%、または 13%) を含む 0.8 μL のリザーバー溶液を混合します。同様に、24ウェルプレート上のシラン化カバースリップに吊り下げ液滴をセットし、16°Cでインキュベートします。
    6. DgpAおよびDgpB / C複合体のタンパク質結晶を成長が止まるまでフルサイズに成長させ、次に結晶をリザーバーバッファーとDgpAおよびDgpB / C複合体の5 mMの基質化合物(グルコースおよびプエラリン)を含む浸漬溶液に16°Cで30分間移します。
    7. DgpA(グルコースまたは基質フリー)およびDgpB / C錯体(基質フリー)を含む結晶を、25%グリセロールを添加した浸漬緩衝条件を含む凍結保護溶液に移し、すぐに液体窒素で保存してデータ収集します。
      注:DgpAとDgpB / C錯体結晶の両方を基質(グルコースとプエラリン)に浸しましたが、グルコースのみがDgpAの触媒中心にうまく取り込まれました。その結果、構造解析のために3つの異なる結晶形態が得られました:グルコースを含むDgpA(図3E)。基板フリーDgpA(図3B-C);および基板フリーのDgpB / C複合体(図3D)。凍結保護液は、液体窒素中でのフラッシュ冷却中の氷形成を防ぐことでタンパク質結晶を保護し、それによって構造的完全性を維持し、放射線による損傷を最小限に抑えます。通常、母液をベースとして配合された溶液には、最適化された濃度の凍結保護剤(グリセロールやエチレングリコールなど)が添加されています。
  2. データ収集と構造決定
    1. 上海国立タンパク質科学施設(NFPS)の上海シンクロトロン放射線施設(SSRF)で、グルコースまたは基板フリー型のDgpA、および基板フリー型のDgpB / C複合体の結晶のX線回折データを入射波長0.978 Åで収集します。
    2. 結晶学データ処理ソフトウェア31を用いて、DgpAおよびDgpB/C複合体を含む3組のX線回折データを処理する。まず、生データをロードし、次にソフトウェアの対応するボタンをクリックして、インデックス、積分、およびスケール機能を順番に実行します。後続の構造決定に適した処理済み出力ファイル (output.sca) を生成します。
    3. グルコースまたは基質フリー型(図3B-C、3E)のDgpAの構造、および分子置換法(材料表)を使用して、基質フリーのDgpB / C複合体(図3D)の構造を決定します。次に、関連する配位子(グルコース、Mn2+、H2Oなど)を組み込んで、構造と電子マップを微細化します31.

3. 反応活性のモニタリングと速度論的パラメータの決定

注:DgpA / B / Cシステムは、定義された2段階のカスケードを通じてC-グリコシド変換を媒介します:DgpAは、糖部分を酸化することにより触媒作用を開始し、DgpB / C複合体がその後10,26,27を切断または異性化する中間体を生成します。この研究では、DgpA/B/Cはこの反応カスケードに関与する酵素を指しますが、DgpAとDgpB/C複合体との間には直接的な相互作用は起こらないことに留意すべきです。この結合活性は、HPLC製品分析、電子移動を監視するDCPIP結合分光光度アッセイ、または反応パラメータ27,32の詳細な速度論的特性評価という3つの補完的なアプローチを使用して厳密に定量化できます。具体的には、DgpA/B/C触媒により作製したC-グリコシド切断産物(ダイゼイン)をHPLC(265 nmでのUV検出)により解析した。製品形成は、標準検量線を用いて定量化し(標準曲線の確立方法は、ステップ3.3.2の注で詳細に説明されています)、速度論的パラメータは、非線形回帰分析27,32を通じてMichaelis-Mentenモデルに製品形成率を適合させることによって決定されました.プエラリンC-グリコシド結合切断に対するグルコースの影響を測定する阻害アッセイは、糖類がDgpAの基質として役立つという裏付けとなる証拠を提供しました。その後、DCPIPアッセイは、酸化糖33から電子を受け入れるときに青色の2,6-ジクロロフェノールインドフェノール(DCPIP)が無色のロイコDCPIPに還元されることを測定することにより、糖酸化反応を監視し、それによってDgpAの触媒活性を反映する。

  1. HPLCによるDgpA/B/C活性のモニタリング
    1. 20 μM の DgpA と DgpB/C の複合体 (ステップ 1.2.7 から) を含む 500 μL のバッファー F (表 1) と、切断反応にはプエラリンまたはゲニステイン-8-C-グルコシド、異性化反応にはダイジンまたはゲニスチンのいずれか 0.1 mM で、DgpA/B/C 触媒 C-グリコシドの切断または異性化反応を行います27。37°Cで8時間反応を行い、反応混合物に1.5mLのメタノールを加えて反応を終了します。
    2. 反応溶液を16,000 × g で15分間遠心分離し、メタノール誘導酵素変性により形成されたタンパク質沈殿物を除去します。0.22 μmのフィルターメンブレンを使用して上清をろ過します。
    3. 注入量 10 μL で検出波長 UV 265 nm の流速 1 mL/分で、グラジエント溶出による HPLC 分析を実施します。
      注:移動相はアセトニトリル(移動相 A)と 0.1% 酢酸水溶液(移動相 B)で、グラジエント溶出がありました。移動相溶出のグラジエントは、0-5分で5%-20%A、5-15分で20%-45%A、15-18分で45%-52%A、18-19分で52%-55%A、19-21分で55%-5%A、21-23分で5%Aです。DgpA/B/C酵素系は、ダイジンやゲニスチンなどの基質に対して著しく異なる触媒効率を示し、その結果、それぞれの生成物形成速度に大きなばらつきが生じます。基質変換速度と生成物蓄積ダイナミクスを定量的に評価するために、HPLCを使用して0、2、4、6、12、16、20、24、36、および48時間間隔で包括的な時間経過分析を行いました。
  2. 2,6-ジクロロフェノールインドフェノール(DCPIP)アッセイによるDgpA活性のモニタリング
    注:DCPIPアッセイは、酸化糖33から電子を受け入れるときに、青色DCPIPから無色のロイコDCPIPへの還元を測定することにより、糖の酸化を監視する。ここでは、DCIPIP レポーターアッセイを使用して、さまざまなグリコシル化化合物、単糖類、二糖類、または多糖類に対する DgpA 酸化活性を記録しました。野生型DgpAとその糖結合欠損変異体(D182A、Δ(308-316)、Δ(311-316)など)が使用された27。
    1. 0.8 mM DCPIP、50 μMタンパク質、野生型DgpAおよびその3つの糖結合欠損変異体(DgpA D182A、DgpAΔ(308-316)、またはDgpAΔ(311-316))を含むタンパク質を、プエラリン、ビテキシン、ゲニスチン、可溶性デンプン、マルトトリオース、ラクトース、スクロース、グルコース、またはマルトースを含む10 mM基質と、1x PBSバッファー(pH 7.4)でインキュベートします。
    2. 反応の20時間後、マイクロプレートリーダー33を用いて600nmでのDCPIPの吸光度変化を記録する。
  3. プエラリンの C- グリコシド結合切断反応におけるグルコースの阻害率の決定
    注:DgpAは、 C-グリコシドの糖部分を酸化することができる糖酸化還元酵素ファミリーに属します。 図3E は、グルコースがDgpA触媒中心に結合していることを示しており、DgpA構造を決定するためのプロトコルはステップ2.2.3で詳述されています。グルコースと C-グリコシドプエラリンとの間のDgpAの競合的結合を調べるために、以下の実験を行った。
    1. 1 × PBS緩衝液(pH 7.4)で反応を行います。ステップ 3.1 で説明したように、異なる濃度のグルコース(1 mM、5 mM、10 mM、20 mM、50 mM、80 mM、100 mM)を C-グリコシド(プエラリン)切断反応系に添加します。37°Cで12時間反応を行います。
    2. 参照化合物(標準ダイゼイン)のHPLC検量線を使用して、製品(ダイゼイン)の定量分析を行います。まず、グルコース濃度の異なる反応と非阻害 C-グリコシド切断反応(グルコースなし)との間の生成物収量の差を決定し、次にこの差を非阻害反応からの生成物収量で割ることにより、阻害率を計算します。
      注:定量HPLC分析用の検量線を生成するには、参照標準試料(プエラリンやダイゼインなど)を濃度範囲(0.1〜1 mM、0.1 mM刻み)で段階希釈します。HPLCで各濃度を分析し、ピーク面積を記録し、対応する標準濃度に対してプロットします。線形回帰分析(y = mx + b、y = ピーク面積、x = 濃度)を実行して、標準曲線を確立します。その後、回帰式を使用して、測定されたピーク領域から未知のサンプル濃度を補間できます。
  4. 速度論的パラメータの決定
    注:速度論的パラメータは、酵素触媒効率を定量的に評価するための重要なゴールドスタンダードとして広く認識されています。DgpA/B/C触媒反応を定量的に評価するために、DgpA/B/Cによって触媒される C-グリコシドプエラリン切断反応の速度論的パラメータを決定した。
    1. DgpA/B/C触媒C-グリコシド切断反応のための基質C-グリコシド(プエラリン)濃度グラジエント(0.01〜4 mMの範囲で2倍刻み)を調製します。
    2. ステップ3.1で説明した方法に従って、37°Cで8時間反応を行います。標準ダイゼインのHPLC検量線を使用して、製品(ダイゼイン)の定量分析を行います。次に、定量化された量を反応時間で割ることにより、反応速度(生成物形成速度)を計算します。
    3. 統計ソフトウェア(Table of Materials)を使用して、計算された反応速度と基質濃度をMichaelis-Mentenモデルに適合させることにより、Kmおよびkcatの速度論パラメータを決定します。

4. 反応中間生成物の調製と検出

注: C-グリコシド切断活性を超えて、DgpA/B/Cは O-グリコシドの C-グリコシドへの異性化も触媒します。したがって、 O-グリコシドをDgpA/B/Cの基質として使用すると、中間生成物は異性化した C-グリコシドとして生成されます。中間製品(プエラリン)の特性評価のために、中間化合物を精製し、続いてLC-MS/MSやNMR分光法などの分析化学ツールを使用して分析しました。

  1. DgpA/B/C 触媒C- グリコシド異性化反応における反応中間生成物の調製 27
    1. 0.2 mM O-グリコシド(daidzin)を基質とし、20 μM DgpAおよびDgpB/C複合体を90 mLの反応容量で使用して、DgpA/B/C触媒によるO---C-グリコシド異性化反応を調製します。上記のステップ3.1で説明したプロトコールに従ってください。
    2. 中間生成物 のC-グリコシド(プエラリン)を、グラジエント溶出法(注)で分取HPLCを使用して精製します。
      注:移動相はアセトニトリル(移動相 A)と 0.1% 酢酸水溶液(移動相 B)で、グラジエント溶出がありました。移動相溶出のグラジエントは、0-5分で5%-20%A、5-15分で20%-45%A、15-18分で45%-52%A、18-19分で52%-55%A、19-21分で55%-5%A、21-23分で5%Aです。
    3. ステップ3.3.2の標準キャリブレーションHPLC曲線を使用して精製された中間製品の濃度を計算し、ステップ4.1.1で90mLの反応システムで約6 mgのプエラリンを取得し、精製した中間製品を真空遠心濃縮器で乾燥させます。
  2. LC-MS/MSによる反応中間体の特性評価
    1. ステップ4.1.3の乾燥中間製品を収集します。100 μgのダイジン由来中間体を秤量し、2 mLのメタノールに溶解して最終濃度50 μg/mLにします。13,500 x g で 10 分間遠心分離し、上清を回収して LC-MS/MS 分析を行います。
    2. ステップ 4.1.2 と同じ HPLC グラジエント溶出プログラムを LC-MS/MS 分析に使用し、注入量を 5 μL にします。
  3. NMRによる反応中間生成物の評価
    1. ダイジン反応で精製した中間生成物4 mgをジメチルスルホキシド-d 6 340 μLに溶解し、1Hおよび13C NMR分光法を行います。機器のパラメータを次のように設定します:298 Kの温度、シム3回、パルス幅18 μs、緩和遅延1.5秒、48スキャン、その他のパラメータはデフォルト設定27。
    2. 600 MHz NMR装置を使用して、NMR 1Hおよび 13Cスペクトルを収集します。

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結果

で概説されている手順に従います。 図 1では、まずDgpA、DgpB、およびDgpC遺伝子を E. coli BL21(DE3)細胞。DgpBとDgpCは安定な酵素複合体(DgpB/C複合体)を形成するため10,26,27,34、これら2つのタンパク質を発現する細胞を結合して共精製しました。細胞溶解後、上清を48,000 xg 4°Cで40分間、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーにかけました。結合したタンパク質は、イミダゾール(0-500 mM)の線形グラジエントを使用して、バッファーA(図2A, 2G

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ディスカッション

現在、この分野でのC-グリコシド代謝酵素の構造的および機能的特性は不明のままであり、適切な研究方法が不足しています10,24,26。化学とバイオテクノロジーの組み合わせの大きな利点を活用することにより 40,41,42,43,44,45 この研究では、構造生物学、酵素学、およびその他のバイオテクノロジー技術とLC-MS / MSやNMRなどの化学技術を利用して、Cの構造と機能特性を探索する研究方法論を提案しています<...

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開示事項

著者は、競合する利益を宣言しません。

謝辞

この研究は、北京中医薬大学(BUCM)(90011451310011)からWMへのスタートアップファンドプログラム、BUCMでのCOVID-19に対する緊急資金プログラム(1000061223476)からWMへの資金提供、国家伝統中国医学行政管理局のイノベーションチームと人材育成プログラム(ZYYCXTD-C-202006)からWMへの資金提供、およびBUCM(ZJKT2023012)からH.P.の大学院生向けの独立した研究プロジェクト。有益な議論をしてくれたWenfu Ma研究室の研究室メンバーの皆さんに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
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2,6-ジクロロインドフェノール(DCPIP)Solarbio Science and TechnologyD6350
2-メルカプトエタノール(β-ME)Sigma-Aldrich08168
  5 ×蛋白質ローディング染料Sangon BiotechC508320
酢酸上海マックリンA111247
アセトニトリルサーモフィッシャーサイエンティフィック >InvitrogenA12147
Bruker Avance III HD 700 MHz NMR 分光計Bruker AVANCE III HD 700MHz
Bruker Ultrashield 400 Plus 400MHzBrukerAVANCE III 400 MHz
Centrifuge 5424REppendorf022620601
Chirascan™ Plus CD spectrometerApplied PhotophysicsChirascan™ 
DaidzeinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20227
DaidzinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20226
Dithiothreitol(DTT)Solarbio Science and TechnologyD8220
E. coli BL21 (DE3) competent cellsサーモフィッシャーサイエンティフィック™?InvitrogenEC0114
GenisteinShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31565
Genistein-8-C-glucosideShanghai Yuanye Bio-TechnologyBP2095
GenistinShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31591
GlucoseSigma-AldrichG8270
GraphPad Prism 9GraphPad Softwareバージョン。プリズム9Kmおよびkcat速度論パラメータの計算
HiLoad Superdex 200 pg 分取SECカラムCytiva28989335
HisTrap HP His tag タンパク質精製カラムCytiva17524802
HiTrap Q FF 陰イオン交換クロマトグラフィーカラムCytiva17515601
HKL-3000HKL research Inc バージョン 723
HPLC カラム TC-C18(2), 170Å, 5 µm, 4.6 x 250 mmAgilent Technologies518925-902
イソプロピル &β;-D-1-チオガラクトピラノシド?IPTG)Sigma-AldrichPHG0010
LactoseSigma-Aldrich17814
LC-20AT、高速液体クロマトグラフィー島津製作所 LC20AT
MaltoseSigma-Aldrich47288
MaltotrioseSigma-Aldrich443713
塩化マンガンShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31112
メタノールサーモフィッシャーサイエンティフィック&貿易;?InvitrogenM23142
NAD+Solarbio Science and TechnologyN8110
Olympus SZX12 実体顕微鏡OLYMPUS SZX7
フェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)Sigma-AldrichP7626 
フェニックスフェニックス開発チーム1.21.2フェニックスは、SAD(Single-wavelength Anomalous Dispersion)およびMR(Molecular Replacement)法をPhaserソフトウェアに組み込んだ、タンパク質結晶構造決定のための包括的なソフトウェアスイートです。
分取高性能液体クロマトグラフWaters2545/2998
タンパク質結晶スクリーニングキットハンプトンリサーチHR2-110/HR2-112/HR2-144/HR2-126/HR2-098
PuerarinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20446
振とうインキュベーターShanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd ZQZY-AF8
ネークスキン&貿易;透析メンブレン、10 kDa MWCO、35 mmThermo Fisher Scientific>?Invitrogen88245
可溶性デンプンSigma-AldrichS9765
Sorvall LYNX 6000 超高速遠心分離機Thermo Fisher Scientific™
SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダーMolecular DEVICESSpectraMax i3x 
SpectraMax QuickDrop マイクロボリューム分光光度計 仕様MOLECULAR DEVICESQuickDrop
ショ糖Sigma-AldrichS5016
SunFire C18 OBD Prep カラムWaters186002741
Thermo Fisher Scientific Q EXACTIVEThermo Fisher Scientific>?InvitrogenIQLAAEGAAPFALGMBDK
ユビキチン様プロテアーゼ 1Thermo Fisher Scientific™?Invitrogen12588018
超低温冷凍庫サーモフィッシャーサイエンティフィック905GP-ULTS
真空遠心濃縮器北京 JM テクノロジーCV600
バイテキシンSigma-Aldrich49513
ス75006590

参考文献

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