方法論記事

解剖された幼生ゼブラフィッシュの神経筋接合部におけるシナプス小胞のリサイクルのライブイメージング

1.2K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/67633

⸱

2025年2月7日

 , 
1Department of Physiology, Osaka Medical and Pharmaceutical University

この記事について

サマリー

ゼブラフィッシュの幼生の神経筋接合部は、シナプス生理学を研究するための魅力的なモデルです。電気生理学や光学イメージングなど、多くの実験技術に適しています。ここでは、直立した落射蛍光顕微鏡下でpHluorinベースのプローブを使用してシナプス伝達をイメージングするためのプロトコルについて説明します。

要約

ニューロンのコミュニケーションはシナプス伝達によって媒介され、これは主に活動電位(AP)に応答してシナプス小胞(SV)に貯蔵された神経伝達物質の放出に依存します。SVはシナプス前末端で局所的にリサイクルされるため、SVエキソサイトーシスとエンドサイトーシスの協調は、持続的なシナプス伝達にとって重要です。pH感受性緑色蛍光タンパク質(pHluorin)は、SVルーメンを標的とすることにより、SVエキソ/エンドサイトーシスをモニタリングするための強力なツールを提供します。しかし、pHluorinベースのプローブによるAP駆動型SVリサイクルの追跡は、遺伝的にコードされたプローブの導入とその後の光学イメージングがin vivo動物モデルや組織調製物にとって一般的に技術的に困難であるため、依然としてin vitro培養調製物に大きく制限されています。ゼブラフィッシュは、遺伝子操作の容易さ、光学的透明度、迅速な外部開発などの貴重な機能を提供するモデルシステムです。私たちは最近、運動ニューロン終末でpHluorin標識プローブを高度に発現するトランスジェニックゼブラフィッシュを作製し、in vivoで形成される確立されたシナプスモデルである神経筋接合部(NMJ)でのAP駆動型SVエキソ/エンドサイトーシスをモニターするプロトコルを開発しました。この記事では、pHluorinイメージングに適したゼブラフィッシュ幼生NMJ調製方法をご紹介します。また、この調製により、従来の正立落射蛍光顕微鏡でのタイムラプスイメージングが可能になり、NMJ機能を分析するための費用対効果の高いプラットフォームが提供されることも示しています。

概要

シナプス伝達は、シナプス前末端のシナプス小胞(SV)からの神経伝達物質の放出によって媒介され、神経機能の根底にある基本的なプロセスです1。初期の研究では、シナプス伝達は、主に神経伝達物質とその受容体によって誘発されるシナプス後応答を検出する電気生理学的手法によって測定されていました。しかし、過去数十年の間に、シナプス前機能2を直接可視化するいくつかのタイプのイメージング技術が開発されてきました。最も広く使用されているプローブの1つは、pHluorin 3,4と呼ばれるpH感受性緑色蛍光タンパク質です。

シナプス前末端でのシナプス小胞(SV)のリサイクルは、神経伝達物質の持続的な伝達にとって重要なプロセスである5。SVのエキソサイトーシスによる神経伝達物質の放出に続いて、その内腔は一般に酸性pH6,7に維持され、膜とSVタンパク質はエンドサイトーシスによって原形質膜から直ちに回収されます。次に、新しく形成されたSVが再酸性化され、神経伝達物質がリロードされます。pHluorinをSVタンパク質に融合させることによりSV内腔に標的とすると、静止状態での蛍光は最小限に抑えられます。しかし、SVエキソサイトーシスでは、細胞外空間で中性pHにさらされ、明るい蛍光が発せられます。その後、SV再酸性化に続いて蛍光は徐々に減少します。したがって、pHluorin蛍光はSVリサイクルプロセスのモニタリングを可能にします。

先駆的な研究では、前脳シナプスにおけるシナプス小胞融合に関与する水疱性SNARE(可溶性NSF付着タンパク質受容体)タンパク質8であり、SVタンパク質9の中で最も豊富であるシナプトブレビン/VAMP2をpHluorinの融合パートナーとして選択し、得られた融合タンパク質をsynaptopHluorin(SpH)3,4と命名しました.しかし、SpHは、プローブの実質的な表面発現により、低いS/N比を示しました。したがって、他のSVタンパク質は、キャリアパートナーとして試験されている10、11、12。今日までに、小胞性トランスポーターは最も低い表面発現を示すことが実証されている13,14,15。これらのプローブの使用は、AP駆動SVリサイクル8,9,10,11,12,13を追跡するために培養哺乳動物ニューロンで最初に確立され、解剖された組織およびインビボ動物16,17,18,19,20を含む他の調製物に拡張された。21,22.

ゼブラフィッシュの幼生は、遺伝子操作の容易さ、光学的透明度、急速な外部発達などの貴重な特性を持つモデルシステムです。SypHyと呼ばれるシナプトフィジンに融合したpHluorinを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュを作製し、in vivoでの脊髄ニューロンの自発的なSV融合のモニタリング21、in vivoでのリボン型シナプス20,22または単離細胞23,24,25でのAP非依存性SVリサイクルなど、複数の実験設定に適用しました.しかし、ゼブラフィッシュモデルにおけるAP駆動型SVリサイクルのpHluorinイメージングの適用はまだ限られています。

神経筋接合部(NMJ)は、シナプス生理学を研究するための魅力的なモデルとして機能し26、いくつかの研究では、マウス18,19のSpHによるAP駆動型SVリサイクルのイメージングに成功しました。ゼブラフィッシュのSVリサイクルのためのNMJの使用は、Wen et al.16によって開拓されました。最近、我々は、小胞性GABAトランスポーター(VGAT)でタグ付けされたpHluorinを運動ニューロンに特異的に高発現するTgゼブラフィッシュを作製した27。このプローブには、VGATの管腔テールにpHluorinと並行してHaloTagも含まれているため、VpHaloと名付けられています。VGATはコリン作動性運動ニューロンでは内因的に発現しませんが、電気生理学的記録、HaloTagリガンドによる活動依存性SV標識、およびpHluorin27のライブイメージングを組み合わせることで、VpHaloがすべてのSVプールに局在し、APに応答して適切にリサイクルされることを確認しました。VpHaloの発現レベルが高く、表面分率が最小限に抑えられているため、このTg魚からのNMJ調製により、良好なS/N比でAP駆動型SVリサイクルをモニタリングすることができました。さらに、透明体内のNMJの分布がまばらであるため、この目的のために共焦点レーザー走査型顕微鏡検査は不要になります。無傷のゼブラフィッシュにおけるAP主導のSVリサイクルのモニタリングは、将来の望ましい方向性ですが、培養調製物3、4、10、11、12、13、14、15で行われたように、十分に制御された条件下でpHluorinベースのプローブの使用を検証するのに適したNMJ調製物を確立することが最も重要です.ここでは、上述したように、エンドプレート電流のパッチクランプ記録、リサイクルSVのHaloTag標識、pHluorinライブイメージングなど、複数のタイプの実験に使用できるゼブラフィッシュ幼生NMJサンプルを調製するための解剖プロトコルについて説明します。さらに、電気刺激装置と溶液灌流システムを備えた従来のエピ蛍光顕微鏡下で、このNMJ調製物を用いたpHluorinのライブイメージングに着目し、詳細なプロトコールを提供しました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

すべての動物処置は、大阪医科薬科大学の動物の世話と使用に関するガイドラインに従って行われました。ゼブラフィッシュは、14時間の光から10時間の暗サイクルで飼育および維持されました。胚と幼虫は、0.006%の海塩と0.01%のメチレンブルーを含む卵水で28〜30°Cに維持されました。実験は受精後4〜7日(dpf)に行われました。実験が6dpfの後に行われる場合、魚は5dpf以降から1日2回給餌することをお勧めします。各給餌の前に培地を交換する必要があります。

1. 溶液の調製

  1. 200 mLの細胞外溶液(112 mM NaCl、2 mM KCl、10 mM HEPES、10 mMグルコース、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、pH 7.3-7.4)を調製します。3.5 M NaCl 6.4 mL、1 M KCl 0.4 mL、1 M HEPES (pH 7.5) 1 mL、1 M CaCl2 0.4 mL、1 M MgCl2 0.2 mL、グルコース 360 mg を混合し、200 mL に超純水を加えます。pHが7.3〜7.4の範囲外の場合は、1 M NaOHで調整します。各実験には、調製したばかりの細胞外溶液を使用してください。
  2. 3 μM D-ツボクラリン(D-TBC)を含む細胞外溶液100 mLを調製します。15 mM D-TBC原液20 μLを100 mLの細胞外溶液に加えます。
    注:D-TBCストック溶液は水で調製し、-20°Cで保存します。
    注意:D-TBCパウダーを取り扱うときは、手袋を着用し、フード内で準備を行ってください。D-TBC溶液を取り扱う際には、手袋の着用も推奨されます。
  3. 0.02%トリカイン(MS-222)を含む細胞外溶液25mLを調製します。0.5 mLの1%トリカインストック溶液を25 mLの細胞外溶液に加えます。
    注:トリカインストック溶液は水で調製し、4°Cで保存します。 トリカインは解剖にのみ使用され、イメージング中には使用されません。

2. シータガラスキャピラリーからのバイポーラ電極の作製

  1. マイクロピペットプーラーを使用してシータガラスキャピラリーを引っ張り、先端の直径が3〜10μmの範囲になるようにします(図1A)。
    注:キャピラリーを引っ張るための2つ以上のステップを含むプロトコルをお勧めします。
  2. シータガラスピペット(内径1.17 mm、セプタムの厚さ0.165 mm)を刺激アイソレーターに接続します。ピペットに細胞外溶液を入れます。細い白金線(直径0.1 mm)をシータガラスキャピラリーの各開口部に挿入し、ワイヤーの後端を刺激アイソレータに接続します(図1B)。2本のプラチナ線をショートさせないように注意してください。

3. サンプル調製

注:このプロトコルは、Tg(hb9:tTAad、TRE:TagRFP-P2A-VpHalo)ゼブラフィッシュ幼生27で使用するために最適化されており、P2A切断ペプチドによってリンクされた次の2つのタンパク質が運動ニューロンで特異的に発現されました:レポーター赤色蛍光タンパク質TagRFPと、VGATの管腔部分へのpHluorinとHaloTagの融合タンパク質であるセンサータンパク質VpHalo(図2A)).hb9プロモーターはtTAad(テトラサイクリン制御トランスアクチベーターアドバンスド)の発現を駆動し、tTAadはテトラサイクリン応答エレメント(TRE)複合プロモーターの下で遺伝子の発現を誘導します。Tet誘導性発現システムは、タンパク質の発現レベルを増加させます。pHluorinは、活性依存性のSVリサイクルのライブモニタリングを可能にしますが、HaloTagは、融合タンパク質を共有結合的に標識することにより、特定の期間にリサイクルされたSVを視覚化します(図2A)。どちらの方法にも独自の利点がありますが、この記事ではpHluorinイメージングに焦点を当てます。

  1. 0.02%トリカンを含む25mLの細胞外溶液をガラスのペトリ皿に注ぎます。
  2. 解剖のために、幼虫をペトリ皿に移します。2本の細い鉗子で幼虫の皮膚をはがします。最初の鉗子を使用して幼虫を所定の位置に保持し、他の鉗子で水泳膀胱の背側の皮膚をつまみます(図3A)。
  3. 水泳用膀胱、内臓、頭をメスで取り除きます。魚の体の両側の皮膚は、多くの場合、同時に取り除くことができます( ビデオ1を参照)。

4. イメージングチャンバーへのサンプルの配置と刺激電極の挿入

注:SVの静止管腔pHがpH 6.0未満であるため、生きている魚のNMJでのpHluorin蛍光はほとんど観察できません(図2B)。しかし、SVルーメンをアルカリ化すると、VpHaloのNMJへの限定的な局在化が観察されました(図2C)。特に、NMJの共焦点zスタック画像は、ボディセグメントのエッジを除いて、それらがxy平面で互いに重なっていないことを示しました(図2C)。この観察結果に基づいて、落射蛍光顕微鏡はゼブラフィッシュの幼生におけるVpHaloのライブイメージングに適用可能であると仮定し、以下のプロトコルで詳細に検証されました。

  1. ファイヤーポリッシュチップ付きのガラスパスツールピペットを使用して、サンプルをイメージングチャンバー(図3B)に移します。C字型のプラチナワイヤーに接着されたナイロン糸でサンプルを機械的に固定し、刺激電極とほぼ平行な角度で向きます。(図3C)。
    注:ナイロン糸付きのC字型プラチナワイヤーを実験室で製造しました。直径0.5mmのプラチナ線約1cmをC字型に成形し、ハンマーで叩いて平らにしました。ナイロン糸は家庭用品から入手できます。食料品店で手に入るキッチンの水切りを分解して得られたナイロン糸を接着しました。同様の固定装置が、脳切片実験28で日常的に使用されている。
  2. 重力流灌流システムを使用して、3 μM D-TBCを含む細胞外溶液を約1.0 mL/minの速度でサンプルに連続的に灌流します。
    注:チャンバーの温度は、インライン溶液ヒーターを使用して制御することをお勧めします。
  3. 刺激電極を脊髄に挿入します。ステップ2でシータガラスピペットから調製した電極を、電動マイクロマニピュレーターを装備したピペットホルダーに保持します。電極をサンプルに挿入して、先端が脊髄の腹側に位置し、この標本でTagRFP陽性ニューロンとして識別できる脊髄運動ニューロンの近くにくるようにします(図3D)。隣接するセグメントから目標位置まで電極を斜めに進めます。
    注:ボディセグメント間の境界は密集していて貫通しにくいため、電極をゆっくりと押す必要があります。電極先端の位置は非常に重要です。脊髄から離れていると、隣接する筋肉に直接刺激を与えるため、その後のタイムラプス撮影で大きな画像がドリフトします。

5. 画像取得

  1. イメージング領域を選択します。TagRFP蛍光のライブ画像に基づいて、数個以上のブートンを含み、体節境界のものを除外するイメージング領域を選択します(図2Cおよび図4A)。運動ニューロンの神経支配は単一の身体セグメント29,30内で制限されるため、刺激電極の同じ身体セグメント内の領域を選択する。蛍光フィルターユニットをGFP/pHluorin蛍光に切り替えます。
    注:この実験セットアップでは、pHluorinを470/40 nm励起フィルターと510/20 nm蛍光フィルターでイメージングしました。TagRFPは、555/20 nmの励起フィルターと595/44 nmの蛍光フィルターでイメージングしました。Micro-Managerソフトウェアは、科学用cMOSカメラとLED光源のTTLシャッターで画像取得を同時に制御するために使用されます。画像取得と電気刺激を同期させるために、ArduinoはデジタルI/Oデバイスとして使用されます。スクリプトを必要としない別のオプションは、DigidataとそのソフトウェアをMolecular Devicesから使用することです。
  2. 画像取得ソフトウェアとデジタルI/Oデバイスの設定を決定して、画像取得と電気刺激が同期するようにします。光源の露出と強度を最適化して、飽和のない 1 Hz タイムラプス モードで十分に明るい画像を取得し、メインの Micro-Manager ウィンドウの [露出 [ms]] フィールドに露光時間を入力します。
  3. 刺激周波数、活動電位(AP)の数、および画像取得の開始から刺激配信までの時間を決定し、それらをArduinoスクリプトにコーディングします。パラメータに応じて、画像取得の全長に対応する取得画像の数を決定し、Micro-ManagerのMulti-Dimensional AcquisitionウィンドウのCountフィールドに入力します。インターバルフィールドに1秒を設定して、1Hzのタイムラプスイメージングを実現します。電気刺激の場合は、刺激アイソレータを介して1msの定電圧パルス(70mV)を送達します。
  4. 画像取得を実行します。デジタイザコマンドを実行し、画像取得を実行します。許容できない画像ドリフトがないこと、およびpHluorin応答が観察できることを確認します。そうしないと、電極の位置が正しくありません。ステップ 4.2 に戻ります。
    注:pHluorin応答に影響を与える可能性のある組織損傷は、筋線維のDIC画像によって簡単に識別できます。このような損傷がないのにpHluorin応答が観察されない場合は、電極の位置が正しくない可能性があります。これは、ステップ4.2で説明したように、不適切な電極の配置が筋肉の収縮を引き起こすため、大きな画像ドリフトとして識別できます。pHluorin応答を引き出せないことがある別の問題は、シータガラスキャピラリーに空気が閉じ込められ、電極の電気的絶縁につながることです。電極の不適切な配置による筋肉の収縮は、Z軸の画像ドリフトを引き起こし、その後の画像解析では補正できません(ステップ6.5を参照)。したがって、画像ドリフトが大きいデータは、画像取得中に特定し、除外することをお勧めします。
  5. 実験の目的に応じて、刺激強度(パルスの周波数と数)や温度を変更します。タイムラプス画像をTIFF画像の時系列スタックとして保存します。 ビデオ 2 を参照してください。

6. 画像解析

注:フィジーを使用して、次の画像処理と分析を実行します。Microsoft Excelまたは同様のスプレッドシートソフトウェアを使用して、測定結果を計算します。Igor Proを使用して、取得した結果に対してカーブフィッティングを実行します。

  1. 以下で説明するように、アクティブなシナプスを強調表示する差分画像を作成します。
    1. フィジーで画像の時系列スタックを開くには 、[ファイル] > [開く] を選択します。表示されている画像が暗い場合は、 画像>調整>明るさ/コントラスト>自動]を選択します。[適用]をクリックしないでください。クリックすると、信号強度が再スケーリングされ、それ以上の解析ができなくなります。 [解析] > [スケールの設定 ] を選択し、イメージング条件で定義されたキャリブレーション係数を入力します。
    2. 「 Image >of Duplicate 」を選択し、画像シーケンスの範囲を示す適切な番号(例えば、15秒の事前刺激期間の実験の場合は11-15)を入力して、事前刺激期間中に撮影された5枚の画像のスタックを作成します。
    3. [Z Project] > [Image Stacks] を選択し> [Projection Type] ドロップダウン メニューから [Average Intensity] を選択します。[OK]を押して、刺激前の期間の代表的な画像を作成します(図4B)。平均化プロセスは、信号変動の影響を減らすために重要です。
    4. 同様の処理を使用して、刺激後の期間の平均画像を作成します(図4B)。刺激の終了直後に5つの画像のスタックを複製します(例:15秒の刺激前期間と10秒の刺激期間の実験の26〜30番目の 画像)。 [Process > Image Calculator ]を選択し、平均化された事前刺激画像と平均化された後刺激画像を、ドロップダウンメニューでそれぞれ[画像1]と[画像2]に設定します。
    5. [操作] ドロップダウン メニューから [減算 ] を選択し、[ OK ] を押して、アクティブなシナプスを強調する差分画像を作成します (図 4B)。
  2. 分析する関心領域 (ROI) を定義します。
    1. [Edit > Selection] > [Specify (指定)] を選択し、手順 6.1 で作成した差分イメージに直径 7 μm の円形 ROI を作成します。ハイライト表示されたアクティブ シナプスに ROI を配置し、T キーを押して ROI マネージャーに ROI を追加します。図 4C-D に示す代表的な結果では、6 つの ROI がボタンの周囲に配置されています。
    2. 同じサイズの別の 5 つの ROI を、シグナルの増加が観察されない領域に配置します。それらの平均蛍光を次のステップのバックグラウンドシグナルとして使用します。ROI を保存するには、[ROI マネージャー] メニューから [その他] > [保存 ] を選択します。
  3. シグナル強度を測定し、蛍光の大幅な変化を計算します。
    1. 元の時系列スタックを選択し、手順 6.2 で保存した ROI をスタックに転送します。 「分析」>「測定値の設定 」を選択し、「平均グレー値」チェック・ボックスのみを選択します。ROIマネージャーメニューから More > Multi Measure を選択することにより、すべての時点におけるROIの平均蛍光強度を測定します。
    2. [結果] ウィンドウのすべての値をコピーし、スプレッドシート プログラムに貼り付けます。5つのバックグラウンドROIから平均バックグラウンドシグナルを計算し、それを各シナプスROIから差し引くと、各ボタンの蛍光が大幅に変化します(図4D)。1 つのビュー (この場合は 6 つのボタン) からすべてのデータを平均化し、n = 1 実験としてカウントします。 図4Eでは、平均化によって得られた各トレースは、すべての時点での値を初期ベースライン期間の平均値で割ることにより、F/F0 として表されます。
  4. カーブフィッティングにより、蛍光減衰時定数(tau)を推定します。
    1. Igor Proで新しいデータテーブルを開くには 、[ウィンドウ]>[新しいテーブル]を選択します。スプレッドシートから時点と F/F0 データをコピーし、テーブルの別の行に貼り付けます。 「ウィンドウ」>「新規グラフ」を選択し、「F/F0 」データを「Y Wave」に、「Time Point data」を「X Wave」として選択し、「 Do It 」を押してグラフを作成します。
    2. 「Window > Show Info」を選択し、一方のカーソルを信号のピークに置き、もう一方のカーソルをトレースの最後に配置して、解析するデータの範囲を定義します。解析>カーブフィットを選択し、関数ドロップダウンメニューでexp_XOffsetを選択し、ウェーブドロップダウンメニューで適切なX波とY波動を選択します。
    3. データオプションをクリックし、カーソルボタンを押してカーブフィット範囲を設定します。[係数] をクリックし、[Y0] に「1」と入力して [実行] を押します。この手順によるカーブフィッティングは、SVエンドサイトーシスと再酸性化の速度を反映する蛍光減衰速度を表すタウ値を提供します。
  5. 以下で説明するように、手動ドリフト補正(オプション)を実行します。
    1. 画像ドリフトが発生し、画像取得期間中に選択したスポットが直径7μmのROIの外側に移動した場合は、Manual Drift Correctionプラグインを実行します。フィジーで時系列画像スタックを開くには 、[ファイル] > [開く] を選択します。Pointツールバーのをクリックして、 Pointツール を選択します。
    2. ランドマークとして最も明るいブートンを見つけ、その中心にポイントを置きます。 T キーを押して、ポイントを ROI マネージャーに追加します。このプロセスを画像のシーケンス全体に対して繰り返します。最初の画像を表示し、[ Plugins] > [Registration > Manual Drift Correction] を選択します。補正した画像シリーズスタックを新規ファイルとして保存し、解析に利用します。
      注:XYドリフトは修正できますが、過度のZドリフトはこの方法では修正できません。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

解剖したサンプルが深刻な組織損傷なしに調製され、刺激電極が脊髄に適切に挿入されている場合、高周波電気刺激によって強力なpHluorin応答を誘発できます(図4D、E)。刺激前のベースライン蛍光は、シナプス前部の表面に存在するプローブによるものであった可能性が高い。刺激中の蛍光の増加は、プローブの表面へのエキソサイトーシス放出を反映しています。その後の崩壊は、プローブ含有SVのエンドサイトーシスと再酸性化を反映しています。pHluorinベースのプローブのこれらの特性は、さまざまな実験設定10、11、12、13、14、15、

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

ゼブラフィッシュの幼生NMJは、シナプス生理学および病理学の研究のための新たなモデルシステムである26,31。SpHをニューロン特異的に発現するトランスジェニックゼブラフィッシュは、すでに作製されており、自発運動障害を示す変異体の解析に用いられている17。Wen et al.17 は、WT 制御 NMJ において、100 Hz で 1000 AP の刺激中に pHluorin 蛍光が約 2 倍に増加することを示しました。対照的に、VpHaloを使用した最近の研究では、200 APs、20HzでpHluorin蛍光の3倍以上の増加が観察されたことが示されました。これは、前回のSpH17,27の報告と比較してかなり弱い刺激でした。したがって、VpH...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

利益相反は宣言されません。

謝辞

本研究は、日本学術振興会科研費18K06882の支援を受けて、F. O.;日本学術振興会 科学研究費補助金 21K06429 and 24K10020 to Y.E.

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
40倍水浸対物レンズオリンパスLUMPLFLN40XW
4ch 重力流灌流システムALAVCPlus-4G
5倍対物レンズオリンパスNPLN5X
カスタムメイド イメージングチャンバーフィジオテックカスタムメイドブラックアクリル板(直径10.7cm、厚さ3mm)にウェル(底部径1cm、上部径1.5cm)を収納約0.5mlの灌流液。
デジタルI/OデバイスArduinoUno Rev3
D-ツボクラリン二塩化物 五水和物Sigma93750
ExcelMicrosoftMicrosoft Office Professional Plus 2016
フィジー / imageJhttps://imagej.net/imageJ 1.54f
細い鉗子AsOne7-562-05 (Dumont #5)
ガラス パスツールピペットいわきIK-PAS-5P先端はトリミングし、最終直径が1.5°1.5°ndashになるまでファイヤーポリッシュする必要があります。2 mm. 
ガラスシャーレAsOne1-4564-06
Igor ProWaveMetricsVer. 6.37
インラインソリューションヒーターワーナーインスツルメンツSF-28
LED照明システムX-cyteXYLIS
メチレンブルー和光133-06962
Micro-Managerhttps://micro-manager.org/Ver.2.0.0
灌流管用ミニ磁気クランプワーナーインスツルメンツ64-1553
マイクロマニピュレーターScientificaPatchStar
電動可動サンプルプレートScientificaMMSP
ピペットホルダー成茂H-13
ピペットプーラー成茂PC-100
プラチナ線(φ0.1mm)NilacoPT-351165
プラチナ線(φ0.5 mm)NiacoPT-351381
ScalpelAsOne8-3086-02 (Feather #11)
Scientific cMOS cameraThorlabsCC215MU
Sea saltNAPQOInstant Ocean
Stereo microscopeOlympusSZX7
Stimulusisolater AMPIISO-FLEX
吸引チューブワーナーインスツルメンツST-3、64-1406
温度コントローラーワーナーインスツルメンツTC-324C
シータガラスキャピラリーサッターインストゥルメントBT-150-10
トリカイン(MS-222)TCIT0941
直立顕微鏡リンパスBX51WI
電動オ

参考文献

  1. Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Ann Rev Neurosci. 27, 509-547 (2004).
  2. Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).
  3. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  4. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of phluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys. J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  5. Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms. J Neurosci. 39 (42), 8209-8216 (2019).
  6. Egashira, Y., Takase, M., Takamori, S. Monitoring of vacuolar-type h+ atpase-mediated proton influx into synaptic vesicles. J Neurosci. 35 (8), 3701-3710 (2015).
  7. Egashira, Y., et al. Unique ph dynamics in gabaergic synaptic vesicles illuminates the mechanism and kinetics of gaba loading. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10702-10707 (2016).
  8. Schoch, S., et al. Snare function analyzed in synaptobrevin/vamp knockout mice. Science. 294 (5544), 1117-1122 (2001).
  9. Takamori, S., et al. Molecular anatomy of a trafficking organelle. Cell. 127 (4), 831-846 (2006).
  10. Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51 (6), 773-786 (2006).
  11. Fernandez-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling. Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).
  12. Kwon, S. E., Chapman, E. R. Synaptophysin regulates the kinetics of synaptic vesicle endocytosis in central neurons. Neuron. 70 (5), 847-854 (2011).
  13. Voglmaier, S. M., et al. Distinct endocytic pathways control the rate and extent of synaptic vesicle protein recycling. Neuron. 51 (1), 71-84 (2006).
  14. Balaji, J., Ryan, T. A. Single-vesicle imaging reveals that synaptic vesicle exocytosis and endocytosis are coupled by a single stochastic mode. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (51), 20576-20581 (2007).
  15. Santos, M. S., Park, C. K., Foss, S. M., Li, H., Voglmaier, S. M. Sorting of the vesicular gaba transporter to functional vesicle pools by an atypical dileucine-like motif. J Neurosci. 33 (26), 10634-10646 (2013).
  16. Wen, H., et al. Synchronous and asynchronous modes of synaptic transmission utilize different calcium sources. Elife. 2, e01206(2013).
  17. Wen, H., Hubbard, J. M., Wang, W. C., Brehm, P. Fatigue in rapsyn-deficient zebrafish reflects defective transmitter release. J Neurosci. 36 (42), 10870-10882 (2016).
  18. Wyatt, R. M., Balice-Gordon, R. J. Heterogeneity in synaptic vesicle release at neuromuscular synapses of mice expressing synaptophluorin. J Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).
  19. Tabares, L., et al. Monitoring synaptic function at the neuromuscular junction of a mouse expressing synaptophluorin. J Neurosci. 27 (20), 5422-5430 (2007).
  20. Odermatt, B., Nikolaev, A., Lagnado, L. Encoding of luminance and contrast by linear and nonlinear synapses in the retina. Neuron. 73 (4), 758-773 (2012).
  21. Almeida, R. G., et al. Myelination induces axonal hotspots of synaptic vesicle fusion that promote sheath growth. Curr Biol. 31 (17), 3743-3754.e5 (2021).
  22. Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nat Comm. 9 (1), 1388(2018).
  23. Vaithianathan, T., Henry, D., Akmentin, W., Matthews, G. Nanoscale dynamics of synaptic vesicle trafficking and fusion at the presynaptic active zone. eLife. 5, e13245(2016).
  24. Vaithianathan, T., Wollmuth, L. P., Henry, D., Zenisek, D., Matthews, G. Tracking newly released synaptic vesicle proteins at ribbon active zones. iScience. 17, 10-23 (2019).
  25. Shrestha, A. P., Vaithianathan, T. Tracking the dynamics of single fused synaptic vesicle proteins from a single ribbon active zone in zebrafish retinal bipolar cells. STAR Protoc. 3 (1), 101107(2022).
  26. Egashira, Y., Zempo, B., Sakata, S., Ono, F. Recent advances in neuromuscular junction research prompted by the zebrafish model. Curr Opinion Physiol. 4, 70-75 (2018).
  27. Egashira, Y., Kumade, A., Ojida, A., Ono, F. Spontaneously recycling synaptic vesicles constitute readily releasable vesicles in intact neuromuscular synapses. J Neurosci. 42 (17), 3523-3536 (2022).
  28. Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. Recording synaptic plasticity in acute hippocampal slices maintained in a small-volume recycling-, perfusion-, and submersion-type chamber system. J Vis Exp. (131), e55936(2018).
  29. Myers, P. Z., Eisen, J. S., Westerfield, M. Development and axonal outgrowth of identified motoneurons in the zebrafish. J Neurosci. 6 (8), 2278-2289 (1986).
  30. Westerfield, M., Mcmurray, J. V., Eisen, J. S. Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish. J Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).
  31. Brehm, P., Wen, H. Zebrafish neuromuscular junction: The power of n. Neurosci Lett. 713, 134503(2019).
  32. Ben Fredj, N., et al. Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection. J Neurosci. 30 (32), 10939-10951 (2010).
  33. Mandal, A., et al. Retrograde mitochondrial transport is essential for organelle distribution and health in zebrafish neurons. J Neurosci. 41 (7), 1371-1392 (2021).
  34. Wong, H. C., Drerup, C. M. Using fluorescent indicators for in vivo quantification of spontaneous or evoked motor neuron presynaptic activity in transgenic zebrafish. STAR Protoc. 3 (4), 101766(2022).
  35. Truckenbrodt, S., Rizzoli, S. O. Spontaneous vesicle recycling in the synaptic bouton. Front Cell Neurosci. 8, 409(2014).
  36. Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular ph. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 50-61 (2010).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

pHluorin

関連記事