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方法論記事

反復磁気刺激下 でのin vitro でのミエリン破片のミクログリア食作用の評価

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DOI:

10.3791/67642

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2025年6月17日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Rehabilitation Medicine, The Affiliated Suzhou Hospital of Nanjing Medical University, 2Rehabilitation Medicine Center, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, 3Department of Children's Rehabilitation, Linyi People's Hospital, 4Department of Endocrinology, People's Hospital of Dongxihu District, 5Department of Rehabilitation, Hengyang Medical School, The First Affiliated Hospital, University of South China

この記事について

サマリー

本プロトコルは、ミクログリアのミエリン破片の食作用能力に対する反復磁気刺激の影響を評価するために考案されました。そのために、 in vitro ミクログリアとミエリンデブリの共培養システムが確立されています。

要約

ミクログリアは、中枢神経系(CNS)に常在する食細胞であり、損傷した細胞、細胞残骸、ミエリン残骸を除去することにより、CNSの完全性と恒常性を維持する上で極めて重要な役割を果たします。ミエリン破片の蓄積は、多発性硬化症、アルツハイマー病、外傷性脳損傷、脊髄損傷など、さまざまな中枢神経系障害に関与しています。ミエリンの破片の存在は、神経炎症を悪化させるだけでなく、ミエリンの再生能力も妨げます。したがって、食作用を通じてミクログリアがミエリンの破片を除去する能力を高めることは、有望な治療戦略を表しています。磁気刺激法は、中枢神経系疾患の革新的な治療法として浮上しており、ミクログリア食作用を促進し、中枢神経系の回復をサポートする可能性を示唆する証拠が増えています。磁気刺激がミエリンデブリのミクログリアクリアランスに及ぼす影響をさらに解明するために、ミクログリアとミエリンデブリの共培養を含む in vitro 実験を設計しました。共培養物は、CNS病理の文脈でミクログリア食作用活性への影響を評価するために、反復磁気刺激を受けました。

概要

ミエリンは、中枢神経系(CNS)のオリゴデンドロサイトによって産生される軸索を取り巻く安定した管状膜構造です。このミエリン鞘は、活動電位の迅速かつ効率的な伝播を促進する上で重要な役割を果たします1。しかし、多発性硬化症(MS)、脳卒中、脊髄損傷(SCI)や外傷性脳損傷(TBI)などの外傷性損傷など、さまざまな神経障害は、ミエリンの完全性の喪失につながる可能性があります。これにより、ミエリン鞘の破壊とミエリン構造への直接的な損傷により、ミエリン破片が生成されます2,3,4。ミエリン破片の蓄積は、再髄鞘形成と機能回復を妨げるだけでなく、神経炎症を悪化させます5,6。したがって、ミエリン破片の効果的な除去は、神経疾患後の神経系における神経炎症の解消、軸索再生の促進、および恒常性の回復に不可欠です。

ミエリンの破片は、主に中枢神経系(CNS)のマクロファージやミクログリアなどの食細胞によって除去されます。中枢神経系に常在する免疫細胞であるミクログリアは、常に周囲の環境を調査して潜在的な脅威を探し、損傷したミエリンやミエリンの破片を取り除くことで中枢神経系を保護します。さらに、ミクログリア食作用は、破片の除去を通じて神経新生を促進する上で重要な役割を果たします7,8。ミエリン破片のミクログリア食作用を増強すると、炎症の有害な影響を軽減し、CNS損傷を軽減し、神経損傷後の軸索再生を促進できることを示唆する証拠が増えています。4、9、10。

非侵襲的な神経調節技術である磁気刺激療法は、さまざまな神経疾患の治療に広く使用されています11。特に、反復経頭蓋磁気刺激法(rTMS)は、アルツハイマー病(AD)、脳損傷、および脳卒中の治療アプローチとして有望であることが示されています12,13,14。最近の研究では、rTMS がアミロイドベータ (Aβ) とアポリポタンパク質 E (ApoE) のミクログリア食作用を増強し、それによって動物モデルにおける AD の病理学的進行を阻害できることが実証されています15。同様に、私たちの最近の研究では、反復経脊髄磁気刺激(rTSMS)がラットの脊髄損傷後のミエリン破片のミクログリア食作用を促進することがわかりました16。

それにもかかわらず、ミクログリアに対する反復磁気刺激の影響は、主に動物17,18,19の実験モデルを通じて実証されています。実際、磁気刺激は、電流の誘導を通じてニューロンの興奮性を調節することが実証されている20。したがって、ニューロンとミクログリアとの相互作用がミクログリアの機能に影響を与える可能性があることも無視できません。したがって、ミクログリアに対する磁気刺激の影響がニューロンの興奮性の変化とは無関係であるかどうかを確認するためには、in vitro実験が必要です。最近の研究では、実験モデルでミクログリアに対する反復磁気刺激の調節効果が特定されています。いくつかの研究では、反復的な磁気刺激がミクログリアのM2への分極を促進する可能性があることが示されました19,21。しかし、そのミクログリア機能については、まだ解明されていない。特に、Amelie Eichlerらは、10Hzの磁気刺激を使用してin vitroで脳組織切片に介入し、10Hzの磁気刺激がミクログリアからのサイトカインの放出を促進し、神経の興奮性と可塑性に影響を与えることができることを発見した22。本研究により、磁気刺激がミクログリアに及ぼす影響についての理解が深まった一方で、そのメカニズムを完全に解明するためには、細胞レベルでのさらなる研究が必要です。

したがって、磁気刺激がin vitroでミエリン破片の食作用を促進することができるかどうかを検証するためのプロトコルを確立しました。病気や組織損傷後のミエリン破片は損傷の産物であるのに対し、この実験で用いたミエリン破片は、骨折後のミエリン鞘の形状をしています。さらに、ミエリンデブリの概念はミエリン崩壊の産物です。脳の主要な食細胞として、ミクログリアは、多発性硬化症やアルツハイマー病24,25などの疾患に関連する損傷細胞やミエリン破片23の除去において極めて重要な役割を果たしている。ミエリン破片の蓄積は、神経炎症を悪化させ、再生を妨げることが実証されています26。この研究の目的は、磁気刺激の可能性を調査することです ミエリン破片のミクログリア食作用を促進し、それによって神経炎症を軽減し、神経変性および外傷性の状態における CNS 回復をサポートします。要約すると、この研究では、ミクログリアをミエリン破片と共培養し、繰り返し磁気刺激を行うことで、ミクログリアの食作用能力に対する反復磁気刺激の効果を検証する共培養アプローチを採用しています。

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プロトコル

ここでは、3匹のSD雌ラット(2〜3週齢)を使用して、ショ糖勾配遠心分離によりミエリン破片を抽出しました。すべてのラットは、中国南京市の南京医科大学の動物コア施設から購入しました(動物ライセンス:SYXK(Su)2021-0023)。すべてのラットを対照条件(温度22±2°C、12時間/12時間の明暗期、相対湿度55%±5%)で飼育しました。すべての動物実験は、南京医科大学動物管理および使用委員会によって承認されました(No.IACUC-1903031およびNo.IACUC-2005001)であり、苦痛を最小限に抑え、使用される動物の数を減らすことを目的としていました。

1.ミエリン分離

注:ミエリンの破片は前述のように抽出され、いくつかの修正が行われました27。すべてのステップが4°Cで無菌条件下で行われたことを確認してください。

  1. 粗ミエリンの単離
    1. 脳組織抽出
      1. ペントバルビタール(50 mg / kg、腹腔内注射)による麻酔後、つま先のピンチ反応によって麻酔の深さを評価します。.雌のネズミの首を切る。氷の上で頭全体を解剖し、ハサミで頭蓋骨を二等分して脳を完全に露出させ、完全な脳の除去を促進します。
      2. 脳組織のショ糖混合物の汚染を防ぐために、はさみと鉗子で膜、小脳、海馬を細心の注意を払って無菌的に切除します。PBSで脳を3回洗浄し、残留血液や組織を取り除きます。
      3. 洗浄した脳を10mLの0.32M滅菌スクロース溶液に移し、顕微手術用ハサミで脳組織を5mm3 個に切断して、脳組織スクロース混合物を得ます。
    2. 脳組織の均質化
      1. 脳組織スクロース混合物を50 mLの滅菌ホモジナイザーに移し、30 mLの0.32 M滅菌スクロース溶液を加えます。.50 mLガラスホモジナイザーを使用して2分間均質化し、滑らかな脳組織ホモジネートを得ます。
      2. 脳組織ホモジネートを0.32 M滅菌ショ糖溶液で90 mLに希釈し、混合し、20 mLの0.83 M滅菌スクロース溶液を含む6本の38.5 mL滅菌薄肉ポリプロピレン超遠心チューブの上部にゆっくりと分注します。各遠心チューブに15 mLのホモジネートを加え、0.32 M滅菌ショ糖溶液で水平にします。
    3. 粗ミエリン破片コレクション
      1. 超遠心分離機のローターを4°Cで予冷し、サンプルを75,000 x g で45分間遠心分離します。遠心分離プロセスに続いて、滅菌パスツールチューブを使用して、2つのショ糖密度間の界面からミエリン破片を回収します。
        注:収集プロセス中は、汚染されたサンプルの他の成分を誤って収集しないように注意を払うことが不可欠です。
  2. 最初の等張分離と精製
    1. 回収したミエリン破片溶液を50 mLの遠心チューブに移し、予冷した滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)バッファーで容量を35 mLに調整します。溶液を新しい50 mL滅菌ホモジナイザーに移し、2分間ホモジナイズしてホモジネートを得ます。
    2. ミエリン破片を6本の38.5 mL滅菌薄肉ポリプロピレン超遠心チューブに均等に分配し、滅菌PBSバッファーを添加します。チューブを75,000 x g で45分間、4°Cで遠心分離します。
  3. セカンドアイソトニック分離と精製
    1. 遠心分離後、上清を捨て、固体の白色ペレットを10 mLの予冷滅菌PBS緩衝液に再懸濁して、ミエリンデブリ懸濁液を得ます。懸濁液を2本の38.5 mL滅菌薄肉ポリプロピレン超遠心チューブに均等に分配し、滅菌PBSバッファーを添加することで容量をバランスさせます。
    2. サンプルを4°C、75,000 x g で45分間遠心分離します。
  4. 精製ミエリンコレクション
    1. 遠心分離後、上清を廃棄し、固体の白色ペレットを6 mLの滅菌PBSバッファーに再懸濁します。ミエリン破片懸濁液を6本の1.5 mL遠心チューブに分割し、4°Cおよび12,000 x g で10分間遠心分離します。
    2. 遠心分離後、上清を捨て、固体の白色ペレットを100 μLの予冷滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁します。
  5. ミエリン破片の定量化
    1. BCAタンパク質定量キットを使用して、ミエリンデブリ懸濁液3 μLを摂取し、タンパク質含有量を定量します。残りのミエリン破片懸濁液を-80°Cで保存します。

2. ミエリン破片の蛍光標識

  1. カルボキシフルオレセインジアセテートN-スクシンイミジルエステルのインキュベーション
    1. 必要なミエリン破片を4°Cまたは氷水で解凍し、12,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を捨て、ミエリンの破片を200 μLのカルボキシフルオレセインジアセテートN-スクシンイミジルエステル溶液(CFSE;50 μM)に再懸濁します。.
    2. 暗所で室温で30分間インキュベートします。インキュベーション期間後、12,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
    3. 上清を捨て、サンプルを500 μLの滅菌PBSバッファーで3回洗浄します。洗浄プロセスに続いて、ミエリンデブリを100 μLの予冷滅菌PBSバッファーに再懸濁して、-80°Cで保存できる蛍光標識ミエリンデブリの懸濁液を取得します。

3.ミクログリアの培養

  1. 10%(v/v)FBS、ペニシリン(100 U/mL)、およびストレプトマイシン(100 U/mL)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で、加湿した5%CO2 、37°CでBV-2細胞を培養します。12ウェルプレートと24ウェルプレートに約50%のBv-2細胞を播種し、さらなる試験を行います。

4. in vitro 反復磁気刺激法

  1. 次の設定で in vitro 反復磁気刺激介入を実行します: 治療周波数 20 Hz、最大出力強度の 1% の治療強度 (つまり、0.035 テスラ)、刺激時間 5 秒、休息期間 20 秒。1回の治療時間2.5分で600パルスを投与します。
  2. 磁気刺激中は、コイルの中心を培養プレートの中心に合わせて配置し、コイルが培養プレートの底にぴったりと収まるようにします。
    1. 磁気刺激のパラメータを事前に決定し、磁気刺激コイルの方向を地面に対して垂直で上向きに固定します。磁気刺激コイルをアルコールで滅菌して、細胞からの汚染を防ぎます。
    2. これに続いて、インキュベーターから細胞培養プレートを取り出し、磁気刺激用の磁気刺激コイルの上に置きます。プレートにアルコールを噴霧して滅菌し、その後インキュベーターに戻します。プロセス全体を通してプレートを覆ったままにしてください。

5. ミエリン破片のミクログリア食作用の試験

  1. LPS+rMSグループに対する磁気刺激治療の繰り返し
    1. CFSE(50 μM)を使用してミエリン破片を標識し、食作用を評価します。1 x 104 BV-2細胞を24ウェルプレートで一晩プレート化します。培地を無血清培地に交換し、細胞をリポ多糖(LPS;1 μg/mL)で12時間処理します。ピペットを使用して古い培地を穏やかに吸引し、すぐにピペットを使用して新しい無血清培地を追加します。
    2. 12時間のLPS介入後、ミエリン破片(100 μg/mL)を培地に加え、暗所条件下で共培養します。ステップ4.2で説明されているように、細胞に繰り返し磁気刺激介入をさらします。
  2. 免疫蛍光法およびイメージング
    1. 吸着しなかったミエリンの破片をPBSで優しく洗浄し、細胞を4%PFAで15分間固定します。10%ロバ血清アルブミンと0.3%Triton X-100を含むPBSで細胞を室温で1時間ブロックした後、PBSで洗浄し、一次抗体(IBA-1、1:200)と4°Cで一晩インキュベートします。
    2. 細胞を二次抗体(1:300、マウス)と室温で2時間インキュベートします。共焦点顕微鏡を使用して、40倍と20倍で画像を撮影します。

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結果

本研究では、まず、脳由来のミエリン破片を抽出し、反復磁気刺激を利用して食作用能を高めることにより、in vitro でBV-2ミクログリア細胞に栄養を与えました。その後、BV-2ミクログリア細胞を培養し、磁気刺激の前にLPS介入を行ったため、厳密な神経学的検証の下でミクログリアの in vivo 状態をエミュレートしました。その後、LPS刺激後にrMS介入を適用しました。細胞の食作用を検証するために、免疫蛍光法を使用し、IBA-1を使用してミクログリアを標識し、CFSEを使用してミエリン破片を標識しました(図1)。免疫蛍光の結果は、包み込まれた外側のミエリン破片(CFSE)の面積と、対照群と比較してLPS群のIBA+/myelin+ 細胞の数の両方で有意な減少を示しました。さらに、磁気刺激後、飲み込まれた外部ミエリン破片の領域とIBA+/myelin+ 細胞の数は、LPSグループと比較してLPS+rMSグループで有意な増加を示しました(

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ディスカッション

反復磁気刺激法(rMS)は、認知障害、アルツハイマー病(AD)、脳卒中、脳損傷、脊髄損傷(SCI)など、さまざまな神経疾患や精神疾患の治療に広く適用されている非侵襲的神経刺激技術です。rMSは、パルス磁界を利用してニューロンの膜電位を調節し、神経系内の神経興奮性に選択的に影響を与える11。ニューロンへの影響に加えて、rMSはミクログリア機能を調節し、神経炎症を抑制し、CNS微小環境を改善することが示されています19。私たちの以前の研究では、損傷部位への反復磁気刺激が、ミクログリアがミエリン破片を飲み込む能力を大幅に強化し、ミエリン破片のクリアランスを促進し、SCIラットの脊髄微小環境を改善することを観察しました16。この現象をさらに調査するために、細胞レベルでのミクログリア食作用に対する反復磁気刺激の影響を検証するためのin vitroプロトコルを確立しました。この実験方法は、ミクログリア機能の調節における反復磁気刺激の役割を理...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金会(82302877年、82172541年)、湖南省自然科学基金会(2023JJ30549)からの助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Beyotime、中国P0131付き退色防止マウント培地
ThermoFisher Scientific、アメリカ23227
Bv-2 セルATCCCBP60922
細胞培養 12 ウェル プレートBiofil、中国
培養 24 ウェル プレートBiofil、中国
共焦点レーザー スキャン顕微鏡Zeiss、ドイツ800
恒温インキュベーターThermoFisher Scientific、アメリカ
CFSEMedChemExpress、アメリカHY-158820
DMEM 培地KeyGen、中国KGL1202-500
FBSGibco、アメリカ16250078
Iba1Abcam、アメリカab48004
磁気刺激装置Yiruide、中国CCY-IA
磁気刺激コイルYiruide、中国
パラホルムアルデヒドBioSharp、中国
PBSKeyGen、中国KGL2210-500
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco、アメリカ15140-122
スクロースMedChemExpress、アメリカHY-B1779
トリプシンKeyGen、中国KGL2107-100
超遠心分離機ベックマン、アメリカL-100XP
DAPI BCA キット 細胞

参考文献

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