In-vitroアッセイのためのヒト単球由来マクロファージのリプログラミングモデル

マクロファージは、メチニコフによってその食作用能力によって最初に特定され、後生動物の生命の基本となる古代の細胞です。成体の哺乳類に遍在し、解剖学的および機能的に顕著な多様性を示します。マクロファージは、樹状細胞や単球と並んで、単核食作用システムの一部として、発生や恒常性から病原体に対する免疫応答まで、さまざまな生物学的プロセスで重要な役割を果たします^1,2。常在するマクロファージは、組織の微小環境に特化したセンチネルとして機能し、組織の健康状態を監視し、生理学的変化や外部の脅威に対応します。その限られた可塑性は、組織の恒常性を維持するための進化的適応であると考えられています。対照的に、募集された単球はより柔軟性があり、炎症中に多様なマクロファージ表現型に分化することができます。この炎症と組織ニッチの二重の影響が、マクロファージの機能的多様性を形作ります³.したがって、局所組織環境に応じて、単球由来マクロファージ(M-DM)は多くのサブタイプに分化することができます。局所代謝物、成長因子、サイトカイン、および細胞間相互作用^4,5,6は、それらの表現型と機能を概説しています。さらに、マクロファージは、炎症を抑制し、再血管新生と組織修復を促進する因子の主要な生産者です^7,8.

少なくとも3つの主要なアームが分極を制御していることを考えると(外因性、内因性、および組織環境条件)、マクロファージの分極は多次元と見なすべきです²。マクロファージの分化と分極を説明する際の主な障害と落とし穴は、文献全体の実験条件が不均一であることと、in vitroおよびin vivo実験でマクロファージ用語を定義することに関するコンセンサスの欠如です⁹。それにもかかわらず、多様な実験シナリオに対して、実験基準の統一がある程度始まっています。

ヒトマクロファージフィールドをよりよく理解するためには、特定の機能だけでなく、リンク、分化、分極、表現型、再プログラミングのための標準化された明確に定義されたM-DMのin-vitroモデルが必要です。私たちの目標は、フローサイトメトリーとリアルタイムPCRによるM-DMのスキューリプログラミングを研究するために、ヒト非分極M-DM M0およびサイトカイン分極マクロファージの標準化されたin-vitroモデルを設定することでした。マクロファージの分極は、その高い可塑性と環境からの複数のシグナルを統合する能力のために動的なプロセスですが、ここでは、非分極化されたM-DM(M0)といくつかのin-vitro分極状態を、IFNγおよびLPSによって誘導される古典的な炎症誘発性、一般にM1としても認識されるものとして特徴付けました。同様に、組織修復および調節性M2マクロファージは、IL-4で誘導された場合はM2a、デキサメタゾンまたはIL-10で刺激された場合はM2cと定義できます。これらの偏光状態は、時間と空間における広範なM-DM環境スペクトルのスナップショットを捉えますが、試験条件を配置する分析マップを設定するためのいくつかの基本点を提供します。

表面マーカーと転写プログラムが複雑かつ動的に組み合わされているにもかかわらず、in vitro M-DMを解析する際には、CD64、CD206、CD163、CD14、MERTKが非分極M0状態を、IFNγ/LPS誘導M1、IL-4誘導M2a、IL-10またはフローサイトメトリーによるデキサメタゾン誘導から分離できると設定しました。さらに、IRF1およびCXCL10遺伝子発現は、IFNγ/LPS誘導M1に特異的であると定義されました。IL-4由来M2aに対するIRF4、CCL22、およびTGM2特異的転写産物。デキサメタゾン由来のM2cのMERTK遺伝子は、異なる刺激で挑戦されたM-DMの歪んだリプログラミングを比較するための追加の基本ポイントを設定します。

すべての健康なボランティア献血者は書面によるインフォームドコンセントを提供し、この研究はアルゼンチンの全米医学アカデミー(IMEX-CONICET-ANM)の制度倫理委員会によって承認されました。このプロトコルで使用されるすべての材料と試薬の詳細については、材料の表を参照してください。

1. 末梢血単核細胞(PBMC)の単離

注:PBMCは、クエン酸ナトリウム3.8%で40mLの抗凝固末梢血から分離され、Ficoll-Hypaque密度勾配(1077)遠心分離を使用して分離されます。このプロトコルは、BSL2バイオセーフティキャビネット内の無菌条件下で行われます。

1. 受け取った抗凝固末梢血サンプルを適切な15 mLまたは50 mLチューブに移して遠心分離します。
2. 血液サンプルを室温で200 × gで15分間遠心分離し(加速:4、減速:2、最大5)、上部に多血小板血漿(PRP)、下に赤血球と白血球を含む細胞画分を取得します。図 1 を参照してください。
3. 上部画分(PRP)を15mLチューブに移し(血漿を保存する場合)、600 × gで10分間遠心分離(最大加速および最大減速)して、血小板を含まない最終的な血漿画分を取得します。プラズマは-20°Cで保存します。
4. 最初の遠心分離で得られた細胞画分を、室温で予熱した滅菌済みの1xリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)を使用して、2倍(最小)から3倍(最大)に希釈します。それを穏やかに均質化し、この希釈した画分をFicoll-Hypaque密度勾配遠心分離に使用します。
5. 15 mLのFicoll-Hypaqueを滅菌済みの50 mLチューブに移します。.次に、フェーズの混合を避けて、30 mLの希釈した血液をFicollの上に慎重にゆっくりと加えます。.希釈した血液が10 mL以下の場合は、4 mLのFicoll-Hypaqueを15 mLのチューブに移し、希釈した血液サンプル10 mLを追加します
   注:この手順は、単核画分を取得するために重要です。
6. Ficoll plusを含んだチューブを600 g × gで25分間遠心分離します(加速:1;減速度:室温で0)。
7. 滅菌済みの3 mLパスツールピペットで黄色の最上層の一部を取り除きます。次に、黄色の最上層とFicoll層との間に形成された界面(単核の「環」画分)を滅菌パスツールピペットで慎重に収集します。この「リング」には、目的の単核細胞(PBMC)が含まれています
   注:残りの血漿相の一部を収集できますが、PBMCに対して毒性がある可能性があるため、Ficoll相は避けてください。
8. 収集したPBMCを、最低3 mLの滅菌1x PBSを含む新しい15 mLチューブに移します。次に、対応する量の滅菌1x PBSを12〜15mLに補充します。PBMCを600 × g(最大加減速)で10分間遠心分離します。
9. 上清を捨て、PBMCを再度洗います。1 mLの滅菌1x PBSを加えて細胞ペレットを再懸濁し、次に追加の滅菌1x PBSを12〜14 mLまで補充します。チューブを600 × g(最大加速および最大減速)で10分間遠心分離します。
10. 上清を捨て、PBMCペレットを不活化ウシ胎児血清の2%を含む滅菌1x PBS(1x PBS-2%FBS)に再懸 ?? し、容量を最大10 mLにします。.自動セルカウンターを使用するか、細胞をカウントし、滅菌済みの冷たくした1x PBSで希釈した1:5細胞懸濁液を調製し、次にトリパンブルーで(1:2)調製して、最終希釈を1:10にします。カウントには光学顕微鏡を使用してください。
11. PBMC懸濁液を300 × gで5分間、8-10°Cでスピンダウンし、無菌の冷たく1x PBS-2% FBSの所望の量で細胞を再懸濁し、最終濃度10⁸細胞/mLを得る。これらの細胞を次のステップまで4°Cに保ちます.
    注:収集したPBMCを同じ日に使用しない場合は、適切な凍結培地(ジメチルスルホキシド、DMSOを10%含むFBSの90%)で10⁸細胞/ mLの極低温バイアルで凍結することをお勧めします。-80°Cでポリエチレングリコール容器に一晩保存すると、細胞がゆっくりと凍結し、細胞の損傷が最小限に抑えられます。翌日、細胞を貯蔵ボックスに移し、-80°Cで数日間放置するか、液体窒素タンクに長時間保管します。

2. 磁気ビーズを用いたCD14⁺単球選別

注:健康なドナーのPBMCに見られるCD14単球の量は、年齢と性別によって異なります。可能な場合は、セルカウンターを使用して各サンプル中の単球の割合を取得し、必要なCD14単球を選別するために必要なPBMCの数を計算します。セルカウンターが利用できない場合、PBMCサンプルあたりの単球の10%は、幅広いアプローチと見なすことができます^{4,6,7,10,11,12,13}.

CD14⁺単球は、ヒトCD14ポジティブセレクションキット^{5を使用して単離されます}。100μLの反応中に1〜2×10⁷ PBMCを使用して単離プロトコルを標準化しました。この比率は、より大きな数値に使用します。推奨される最小反応量は、細胞数が1 × 10⁷ PBMCよりも低い場合でも、100 μLです。

1. 1 mM のエチレンジアミン四酢酸 (1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA) バッファーを含む 1x PBS-2% FBS に 1-2 ×^{10 8} 細胞/mL 濃度の PBMC 細胞懸濁液を調製し、所望量の PBMC を 5 mL ポリスチレン丸底チューブに移します。
2. 細胞懸濁液100 μLごとに10 μLのポジティブセレクションカクテルを加え、よく混合し、室温で15分間インキュベートします。
3. 細胞懸濁液100μLあたり10μLの磁性ナノ粒子を添加し、5倍以上激しく上下させて磁性ナノ粒子を均一に懸濁させ、室温で10分間インキュベートします
   注:ボルテックスはお勧めしません。
4. 1x PBS-2% FBS-1 mM EDTAバッファーを添加して、細胞懸濁液の総容量を2.5 mLにします。チューブ内の細胞を2〜3倍上下に静かにピペットで動かします。チューブをマグネットソーターに挿入し、5分間離して置きます。
5. 磁石を取り、磁石とチューブを1回の連続的な動きで反転させ、上清画分を捨てます。磁気的に標識された細胞はチューブ内に留まります。磁石とチューブを逆さまにして2〜3秒間放置してから、垂直に直立させます
   注意: チューブの口からぶら下がっている滴は残しておきます。振ったり、吸い取ったりしないでください。
6. チューブを磁石から取り外し、2.5 mLの1x PBS-2% FBS-1 mM EDTAバッファーを再度チューブに加えます。細胞懸濁液を2〜3倍上下に静かにピペットで動かして混合します。チューブを磁石に戻し、5分間離して置きます。
7. 1回の連続動作で、磁石とチューブの両方を反転させ、上清分画を破棄します。チューブを磁石から取り外し、細胞を適切な量の1x PBS-2% FBSバッファー(EDTAなし)に再懸濁します。正に選択されたセルは、使用する準備が整いました。
   注意: 磁石には合計2回の5分間の分離が必要です。
8. 1x PBS-2% FBSバッファーを使用してCD14細胞を洗浄し、細胞懸濁液を12〜14 mLにして残りのEDTAを希釈し、600 × g(最大加速および最大減速)で10分間遠心分離します。
9. 上清を捨て、最初に1×PBS-2%FBSバッファー1mLで細胞ペレットを再懸濁し、次に容量を12〜14mLに補充して洗浄を繰り返します。チューブを600 × g(最大加速および最大減速)で10分間遠心分離します。
10. 上清を捨て、陽性で選択したCD14単球を1x PBS-2% FBSバッファーの2 mLに再懸濁します。自動セルカウンターを使用するか、細胞懸濁液を滅菌冷たくした1x PBSで希釈(1:5)し、次に光学顕微鏡を使用してトリパンブルーで(1:2)希釈して細胞をカウントします。培養準備まで細胞を氷上に置きます.
    注:細胞純度は、フローサイトメトリーで50μLの細胞懸濁液を採取し、CD14⁺細胞(クローンHCD14)を染色することで試験できます。純度90%以上を推奨します。
11. 培養のために、細胞懸濁液を300 × gで5分間、8-10°Cでスピンダウンします。10%不活化FBSと1%ペニシリン-ストレプトマイシン(RPMI-10%FBS-1%P / S)を添加したRPMI 1640を使用して、ペレットを10⁶細胞/mLの濃度で再懸濁します>< 注:高品質で低エンドトキシンの熱不活化FBSを使用することが重要です。めっきする前に、単球がプラスチック壁に付着しないように、常に氷の上に置いてください。

3. 単球由来マクロファージ(M-DM)の分化と分極

注:M-DM培養は、500μLのRPMI-10%FBS-1% P/Sを含む48ウェルプレートに2.5×10⁵ CD14⁺単球をプレーティングし、37°Cの加湿インキュベーターで_CO2(5%)を7日間培養することによって行われます。プレートへの単球接着を強化するために、処理されたプレートを選択します。

1. 基礎M-DM(M0)、炎症性M1、組織修復M2a、制御M2c、および目的の試験条件のウェルを含む、実行するすべての実験条件を定義します。
2. ステップ2.11で調製した細胞懸濁液250μLをピペットで、各ウェルに2.5×10個の^CD14+単球を播種します。
3. 各ウェルに250 μLのRPMI-10% FBS-1% P/Sと50 ng/mLのM-CSFを添加して、総容量500 μLを完成させます。
4. 細胞培養プレートを加湿インキュベーターで37°C、5%_CO2で4日間インキュベートし、マクロファージ分化の最初のステップを可能にします
   注:細胞培養の分化を定期的にチェックして、形態学的変化が予想どおりに発生したかどうか、または望ましくない未付着細胞が存在するかどうかを確認します。
5. M-DM培養の4日目に、培地の半分(RPMI-10%FBS-1%P / Sの250μL)を交換します。分極条件用のサイトカインまたは試薬を添加し、3日間培養します(エンドポイントは7日目):LPS(1 ng / mL)とIFNγ(50 ng / mL)をM1に、IL-4(40 ng / mL)をM2aに、IL-10(50 ng / mL)またはデキサメタゾン(0.1 μM)をM2cに
。
6. 7日目にM-DMを採取して表現型の特性評価を行い、次の2つのステップで示されるようにmRNA発現のためにそれらを収集するか、または機能アッセイを実施します。

4. フローサイトメトリーによる偏光M-DMの表面表現型評価

1. 全培養培地容量(48ウェルプレート500 μL)を廃棄し、細胞回収用の1x PBS-2% FBS-1 mM EDTAバッファー200 μLを添加します。氷上で20分間インキュベートした後、1x PBS-2% FBSを200 μL加えてEDTAバッファーを希釈します。1.5 mLマイクロチューブ内でピペッティングしてM-DMを回収します。これらの回収した細胞を1x PBS-2% FBSで1回洗浄し、800 × gで3分間遠心分離します。
2. M-DMペレットを200μLの1x PBS-5% FBSで再懸濁し、96ウェル丸底マイクロプレートに移して室温で15分間ブロッキングします。細胞を800 × gで3分間遠心分離します。
3. 直接標識抗体の適切な組み合わせを1x PBS-2% FBSで調製します。各ウェルまたはコンディショニング(1x)を50 μLの抗体パネルで染色し、暗所で4°Cで30分間インキュベートします
   注:ここで、抗体パネルは、CD11b-APC/Cy7、CD64-APC、CD163-PerCP/Cy5.5、CD206-AlexaFluor 488、CD14-PECy7、およびMERTK-ビオチンとストレプトアビジン-PEで構成されていました。漸増抗体濃度を表1に示します。
4. 染色したM-DMを1x PBS150 μLを加えて洗浄し、800 × gで3分間遠心分離します。
5. 細胞生存率を測定するには、固定生存率色素Zombie Violet(1x PBS中1:1,000)100 μLを加え、暗所で4°Cで30分間インキュベートします。
6. 1x PBSを100 μL加えて染色した細胞を洗浄し、800 × gで3分間遠心分離します。1x PBS200 μLを使用して洗浄手順を繰り返します。
7. M-DMペレットを100 μLの固定試薬(固定/透過化キットから)で再懸濁し、氷上および暗所で20分間インキュベートして固定します><。 注:適切な固定を達成するためには、細胞ペレットを正しく均質化することが不可欠です。
8. 1x PBS-2% FBSを100 μL加えてM-DMを洗浄し、800 × gで3分間遠心分離します。1x PBS-2% FBSを200 μL使用して洗浄手順を繰り返します。
9. M-DMペレットを200 μLの1x PBSに再懸濁し、染色した細胞をフローサイトメーターで泳動します。

5. qPCRによるM-DM分極判別のための遺伝子プログラムプロファイル

注:培養の7日目に、高品質の全RNAを単離するためのRNA抽出試薬を使用して、2.5 ×^{10 5} M-DMを回収できます。RNA単離は、カラムベースのRNA抽出や溶出キットなどの代替方法を使用して行うこともできます。

1. 全培養培地と溶解したM-DMを、抽出試薬350μLを直接添加して廃棄します。この細胞懸濁液をホモジナイズし、1.5 mLのRNase/DNaseフリーマイクロチューブに移し、RNA単離を続けます
   注:RNA単離を同日に行わない場合、ステップ5.1のサンプルは4°Cで一晩、または-20°Cで最大1年間保存できます。
2. 核タンパク質複合体を完全に解離させるには、ステップ5.1で均質化したサンプルを25°Cで5分間インキュベートします
3. 各サンプルに70 μLのクロロホルムを加えます。漏れを防ぐために各チューブをしっかりとキャップし、チューブを振って内容物を完全に混合します。サンプルを2〜3分間インキュベートした後、サンプルを12,000 × gで4°Cで15分間遠心分離します。このステップでは、相を下部フェノール-クロロホルム相、間相、および無色の上部水相に完全に分離します.
   注:クロロホルムの容量は、溶解ステップ中に使用される抽出試薬1 mLあたり0.2 mLのクロロホルムの比率に基づいています。
4. RNAを含む水相を新しい1.5 mLのRNase-/DNaseフリーマイクロチューブに移します.
   注:水相を取るときは、相間層や有機層の移動を避けるために、少量を残してください。
5. 各サンプルに175 μLのイソプロパノールを加えて、RNAを沈殿させます。4 °Cで10分間インキュベートするか、-20 °Cで一晩インキュベートします
   注:イソプロパノールの容量は、初期抽出試薬1 mLあたり0.5 mLのイソプロパノールの比率に基づいています。
6. サンプルを12,000 × gで4°Cで10分間遠心分離します。全RNAの白いゲル状のペレットがチューブの底に沈殿します。マイクロピペットを使用して上清を慎重に取り除き、廃棄します。
7. 白色のゲル状ペレットを350 μLの75%エタノール(溶解に使用する抽出試薬(v/v)1 mLあたり1 mL)に再懸濁してRNAを洗浄します。
   注:RNAは、-20°Cで最大1年間、または4°Cで最大1週間、75%エタノールで保存できます。
8. 再懸濁したペレットを短時間ボルテックスし、7,500 × gで4°Cで5分間遠心分離します。マイクロピペットを使用して上清を取り除き、廃棄します。RNAペレットを5〜10分間風乾または真空化します
   注:RNAを可溶化するためには、RNAペレットの過剰乾燥を避けてください。
9. ペレットを20-30 μLのRNaseフリー水に再懸濁します。55〜60°Cにセットしたウォーターバスまたはヒートブロックで10〜15分間インキュベートします。RNA濃度の測定に進み、RNAを-70°Cで保存します。
10. cDNA合成キットを用いて、反応容量20μL中に100-500 ngのRNA(それぞれ最小および最大)を用いて逆転写(cDNAコピー)を行います。
11. 1 μLのcDNA(5-25 ng)を使用してリアルタイムPCR反応を実行します。
    1. 5 μL の SYBR 緑色混合物 (2x)、各プライマー (フォワードおよびリバース) 0.2 μL、および 3.6 μL のヌクレアーゼフリー水を使用して、各チューブ (1x) の反応ミックスを調製します。サンプル番号に従ってすべてのコンポーネントをスケーリングします。反応ミックスを十分に混合し、各qPCRチューブに9 μLを分注し、最後に1 μLのcDNAを分注して、最終総容量10 μLに到達します。
    2. 98 °C で 2-3 分間 (1x)、98 °C で 5-15 秒、さらに 60 °C で 15-30 秒 (35-40x)、最後に 2-5 s/step で 0.5 °C 刻みの溶融曲線分析 (65-95 °C) を含めるか、装置のデフォルト設定を使用します。
       注:この反応は、ユニバーサルSYBRグリーンミックスを使用して標準化されました。M-DM分極分析に推奨されるプライマーを表2に示します。
12. 真核生物の翻訳伸長因子1α1(EEF1A1)を参照遺伝子として結果を正規化し、解離曲線の解析を通じて増幅産物の特異性を確認します
    注:解離曲線解析により、反応中のqPCR増幅産物が1つだけ存在することを確認できます。

数年にわたるマクロファージの特性評価の研究に基づいて、in-vitro M-DMのさまざまなサブセットを明確に区別するマーカーの正確な組み合わせを設定しました。表現型マーカーは、文献と以前に実施した広範な先行スクリーニングに基づいて選択されました9,14,15,16,17。さらに、CD64、CD206、CD163、CD14、およびMERTKは、フローサイトメトリーにより、非分極M-DM(M0)、分極IFNγ/LPS誘導M1、IL-4誘導M2a、およびIL-10またはデキサメタゾン誘導M2cを明確に区別するのに役立つことを決定しました4,5,7,11,12。選択した各マーカーの説明と機能は、表 24 にあります。

フローサイトメトリーでM-DM分極のin vitro解析のために分析したマーカーのパネルを図2に示します。異なる分極マクロファージを比較すると、IFNγとLPSによって誘導されるM1は、CD64のレベルが最高で、CD206の発現がなく、CD163とMERTKのレベルが低いという特徴があることがわかります。一方、IL-4によって誘導されるM2aマクロファージは、CD206の発現の増加とCD64、CD163、およびMERTKの減少によって特異的に特徴付けられます。最後に、IL-10またはデキサメタゾンによって誘導されるM2c表現型は、CD163発現の特異的な増加、CD64の中間レベル、およびMERTKとCD14の増加によって特徴付けられます。さらに、IL-10と分極した場合にのみ、CD206の顕著な減少があります。デキサメタゾン誘導性M2cは、興味深いことに、CD206のレベルも増加させます。これらすべてのマーカーは、CD11b+生細胞のゲーティング後に分析されました。表面表現型解析に加えて、古典的なIFNγ/LPS誘導M1(IRF1およびCXCL10)およびIL-4誘導M2a(IRF4、CCL22、およびTGM2)の特異的遺伝子発現パネルも設定しました。デキサメタゾン-M2c転写誘導プログラムは、MERTK発現によって特徴付けられます。

図1:Ficoll勾配による末梢血単核細胞の単離。多血小板血漿を廃棄した後、希釈した末梢血サンプル(2-3x)をFicoll-Hypaque密度勾配の上にロードし、600 × gで25分間遠心分離します(加速:1;減速度:0)、示されているようにPBMCを取得するための室温で。黄色の最上層とFicoll層の間に形成された界面を滅菌パスツールピペットで慎重に収集します。この「リング」には、目的の単核細胞が含まれています。略語:PBMC =末梢血単核細胞;RBC = 赤血球。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:フローサイトメトリーによる偏光M-DMの表現型特性評価。単球由来マクロファージ(M-DM)を、10% FBS と 1% P/S に加えて 50 ng/mL の M-CSF を含む RPMI 1640 培地で 7 日間 in vitro 分化しました。4日目に、培地の半分を交換し、偏光サイトカインを添加しました。非偏光M-DM(M0)は中程度のみを受け取りました。LPS(1 ng/mL)とIFNγ(50 ng/mL)をM1に添加しました。IL-4(40 ng/mL)をM2aに添加しました。IL-10(50 ng/mL)またはデキサメタゾン(0.1 μM)をM2cに添加し、M-DMをさらに3日間培養しました。7日目に、M-DMを採取し、(A)CD64、CD206、CD163、CD14、および(B)MERTKの5つのM-DMマーカーのパネルを使用して、フローサイトメトリーによる表現型の特性評価を行いました。ゲーティング戦略には、生細胞とCD11b+細胞も含まれていました。代表的なドットプロットは、M-DMの種類(M0、M1、M2a、M2c)ごとに各偏光マーカーの発現レベルを比較したものです。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:M-DM免疫表現型検査に用いる抗体パネル この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2:フローサイトメトリーおよびqPCRで使用されるin-vitro分極単球由来マクロファージを区別するために選択された各マーカーの簡単な説明と機能 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者には開示すべき利益相反はありません。