Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization(EASI-FISH)は、拡大顕微鏡法と蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を組み合わせて、厚膜組織における複数の遺伝子の発現を検出する堅牢な技術です。このプロトコルは、無傷のショウジョウバエ中枢神経系を標識するための方法とその適応における最近の進歩を概説しています。
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方法論記事
Expansion-assisted iterative Fluorescence In Situ Hybridizationを用いたInsact Drosophila Brainにおける遺伝子発現のマルチプレックス検出
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この記事について
サマリー
要約
細胞の機能を解読するためには、遺伝子の発現を理解することが大切です。しかし、特定の組織内で多数の遺伝子をin situで発現解析する方法は依然として限られています。ここで説明するEASI-FISHプロトコルは、市販の試薬を使用して、無傷の成体ショウジョウバエ中枢神経系(CNS)における数十の遺伝子の発現を検出するように適応されています。このプロトコールには、ゲルの堅牢性を高める新しいゲル製剤が含まれており、複数回のハイブリダイゼーションを可能にし、ゲルごとに複数の脳を埋め込むことができます。この改善により、スループットが向上し、実験条件の最適な比較が容易になり、試薬コストが削減されます。さらに、緑色蛍光タンパク質(GFP)の共検出にGAL4-UASシステムを採用することにより、特定のニューロン細胞またはグリア細胞タイプでの遺伝子発現を視覚化できます。特に、拡大顕微鏡法による高分解能と分析法の感度の組み合わせにより、単一のRNA転写産物の検出が可能になります。このアプローチは、高画質とハイスループットを効果的に統合し、無傷のハエ脳全体の遺伝子発現を研究するための強力なツールとなっています。
概要
FISHは、40年以上前にショウジョウバエで初めてポリテン染色体上の遺伝子をマッピングするために利用されました1,2.今日、単一分子FISHは、無傷の組織3中のmRNA転写産物を空間的に局在化および定量するためのゴールドスタンダードです。しかし、サンプルの完全性とRNA損失の問題により、ショウジョウバエのホールマウント単一分子FISH技術は、同じサンプルで分析できる少数の遺伝子のみに制限されています4,5,6,7。近年のバーコード化(例:8,9,10)により、厚い組織でも検出できる転写産物の数が数百にまで増えています11,12sup class="xref"12など、このようなプロトコルの確立には相当なリソース投資が必要であり、実装のハードルとなる可能性があります。実際、多くの独創的な空間トランスクリプトーム技術は、その起源<機関を超えて広まることはありませんsup class="xref">13。したがって、同じ無傷の脳内の数十の遺伝子の発現を検出するための簡単で比較的安価な方法は、RNA配列および細胞アトラスデータの検証、CNS全体の分子細胞タイプのマッピング、遺伝子発現の発生、性別、または種特異的な遺伝子発現の違いの定量化、またはショウジョウバエで利用可能な多種多様な遺伝的または環境的摂動によって引き起こされる遺伝子発現の変化の測定など、さまざまな研究目的を促進します。
膨張顕微鏡は、研究者が膨潤性ハイドロゲルで組織を膨張させることにより、より高い分解能で組織を観察できるようにする技術です14。EASI-FISHは、増殖顕微鏡とRNA FISH15を組み合わせたもので、オリゴプローブの結合を検出するための非酵素的手法であるハイブリダイゼーション連鎖反応(HCR)を利用しています16。EASI-FISHは、マウス外側視床下部の厚い(300μm)組織スライス中の数十の遺伝子の発現パターンをマッピングするための、薄い組織FISHの代替アプローチとして最初に開発されました17。この方法は、この組織の厚さが300μm未満であり、プロトタイプのハエEASI-FISHプロトコルが最近説明されていることを考えると、成虫のハエの脳への適用に理想的です18。ここでは、解剖および固定されたショウジョウバエの脳が膨潤性ヒドロゲルに埋め込まれ、mRNAとタンパク質がそれぞれアルキル化剤Melphalan-XおよびAcryloyl-X(Ac-X)を使用してゲルポリマーに共有結合的に固定されています。タンパク質消化後、脳の等方性拡大が可能になると、遺伝子特異的DNAオリゴプローブを組織内のmRNAにハイブリダイズして、目的の転写産物を同定します。次に、蛍光タグ付きDNAヘアピンを2番目のハイブリダイゼーションステップで追加します。HCR反応では、複数のヘアピン分子が重合して準安定なDNAポリマーを形成します。これにより、個々の転写産物のシグナルが増幅され、ライトシート顕微鏡や共焦点顕微鏡で輝点として検出できます。
mRNAとタンパク質のゲルマトリックスへの共有結合とゲル形成後のタンパク質のタンパク質分解消化により、mRNA転写産物が比較的安定し、プローブ結合に容易になる可能性のある環境を作り出します。mRNAとゲルの安定性により、ラウンド間で酵素DNase1とのインキュベーションによりDNAプローブとHCR産物をストリッピングし、複数回の再プローブとイメージングが可能になります15,17。さらに、サンプルの拡張により、分子の脱クラウディングによる自家蛍光と光散乱が減少し、画像の解像度が効果的に向上します14。したがって、個々のmRNA転写産物をより簡単に分解できます。
GFPは、蛍光または増殖後の抗体結合によって検出可能な状態を維持するのに十分な手順を維持します。したがって、このレポーターを使用して、関心のある細胞タイプをマークおよびセグメント化できます。利用可能な多くのニューロン特異的な分割GAL4ドライバーライン(例:19,20)と組み合わせることで、ニューロンタイプの分子同一性についてさらに洞察を得たり、解剖学的構造では容易に区別できない分子サブタイプを特定したりする可能性が開かれます。
ここで説明するのは、プロトタイプのフライEASI-FISHプロトコルの更新版です18は、優れたmRNA保持、技術的な問題の除去、およびゲルのより大きな堅牢性を特徴としています。修飾には、PFA濃度の増加、固定温度の低下、およびMelphalan-XおよびAc-Xとのインキュベーション前に脳をマウントすることによるサンプル調製の促進が含まれます。このプロトコルには、ゲルの堅牢性を高めるための新しいゲルレシピも組み込まれており、FISHの多くのラウンドとイメージングを実行するときにゲルの損傷を効果的に軽減します。これらの変更により、プロトコールの実行がより容易になり、処理時間と試薬の使用量の両方が削減され、一貫した結果に対する信頼性が向上します。重要なことは、マルチプレックスの能力が向上し、同じ脳で数十の遺伝子を数か月にわたって調査できるようになることです。これは、成体のショウジョウバエの脳におけるいくつかのニューロン遺伝子の発現パターンによって、さまざまな発現レベルにわたって示されています。
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プロトコル
このプロトコルは、成体(生後5〜6日)のDrosophila melanogasterの女性に対して実施されましたが、性別またはDrosophilaの種はどれでも適用できます。ゲルアンカーのレシピについては、補足表1を参照してください。ゲルレシピについては、補足表2;その他のEASI-FISH試薬については、補足表3を参照してください。日常的な材料および試薬のガイドについては、補足表4を参照してください。図1A-Cは、増殖およびプローブハイブリダイゼーション(ステップ2.1から3.8)の前に、ゲルに脳を包埋する様子を概略的に示しています。図1Dは埋め込まれた脳の写真、図1Eはライトシート顕微鏡用のゲルホルダー、図1Fは典型的な実験のタイムラインを示しています。試薬および使用される機器の商業的な詳細は、材料表に記載されています。
1. ハエ脳の解剖と固定
- ハエの脳またはCNSを冷たいS2培地で解剖します(解剖の詳細については、reference21を参照してください)
- 脳を固定するには、最大20個の脳または10個のCNSを2 mLの冷たい4% PFA/PBSに加え、4°Cのニューテーターで一晩インキュベートします
注意:PFAは、飲み込んだり吸い込んだりすると有害で、皮膚や目に刺激を与え、発がん性がある可能性があります。 - サンプルを2 mLの冷PBT(0.5%、補足表4を参照)で1回洗い流し(1回)、2 mLの冷PBT(4回)で4°Cのニューテーターで15分間サンプルを洗浄します。
- サンプル(1x)を2 mLの冷たい70% EtOHですすいでください。脳を2 mL 70% EtOHに4°Cで最大6ヶ月間保存します。
2. 脳のマウントとRNAとタンパク質リンカーの追加(1日目)
注:常に手袋を着用し、RNase Awayで機器と作業スペースを一貫して拭き取ってください。手袋は、(1)RNaseをサンプルから遠ざけるため、および(2)健康被害をもたらすいくつかの試薬からの保護として必要です。
- 非荷電スライドをRNase除染試薬で拭いて、ゲルチャンバーを調製します。シリコーンガスケットから接着剤を保護している不透明なフィルムをはがし、ガスケット(最大4チャンバー)をスライドに接着し、P20ピペットチップを使用して各チャンバー表面に1μLのポリリジンをコーティングします。風乾してプロセスを繰り返します.
注:ステップ2.1は前日に行うことができます。 - 脳を0.2mL PCRチューブ(チューブあたり最大4脳)に移し、150μLのPBT(0.1%)で5分間(2回)5分間、PBSで5分間(2回)水分補給します。
- 脳をマウントするには、チャンバーごとに40μLのPBSを追加し、細かいピンセットでチャンバーの中央に脳を一列にそっと突き刺し、脳と脳の間にいくらかのスペースを残します(図1Dを参照)。チャンバーごとに最大6つのブレインまたは2つのCNSを取り付けることができます。
- PBSを取り外し、すぐに50 μLの20 mM MOPSバッファーを加えます。室温(RT)で30分間インキュベートします。
- 脳がMOPSバッファーで平衡化している間に、Melphalan-XおよびAc-Xストック溶液を解凍し、チャンバーあたり75μLのMelphalan-X/Ac-X溶液を調製します(Melphalan-XストックをMOPSバッファーで1:1に希釈し、Ac-Xを1:100で添加します)。渦巻き、短時間回転して溶液を収集します。溶液が30分のインキュベーション時間の終わりに準備が整うように、準備の時間を計ります。
注意:メルファラン-Xは、飲み込んだり吸い込んだりすると有害で、皮膚や目に刺激を与え、発がん性がある可能性があります。 - すべてのMOPSバッファーを取り外し、50 μLのMelphalan-X/Ac-X溶液を加えます。
- カバースリップを上に置いてチャンバーを覆いますが、ガスケット接着剤を使用してシールしないでください。チャンバーを加湿ボックスに入れ、光から保護されてRTで一晩インキュベートします。
3. ゲル化とプロテイナーゼKの消化 (2日目)
- カバーガラスとMelphalan-X/Ac-Xを慎重に取り外し、マウントされたブレインを100μLのPBT(0.1%)で2分間、(1x)100μLのPBSで2分間洗浄します。
- TREx-1000溶液、4HT、TEMED、およびAPSを解凍し、氷上に保ちます.
注:TREx-1000は-20°Cで沈殿することがあります。解凍後に完全に溶解するようによく渦巻きます。
注意:これらの試薬は、飲み込んだり吸い込んだりすると有害または有毒であり、皮膚や目の刺激物にもなります。 - TREx-1000と4HT、TEMED、APSを94:2:2:2の比率で混合してゲル溶液を調製します。渦を巻いて氷の上に保ちます。各チャンバーについて、150 μLのゲル溶液を調製します。
- ピペットチップでチャンバーからPBSを取り出し、糸くずの出ないワイプで残りのPBSを慎重に吸い取ります。各チャンバーについて、すぐに40μLのゲル溶液を脳の上に加えます。4°Cで10分間インキュベートします。
- ゲル溶液を取り出し、40 μLの新鮮なゲル溶液を加え、4°Cでさらに10分間インキュベートします
注:ゲル廃液をマイクロ遠心チューブに集め、重合してから廃棄してください。 - ゲル溶液をはがし、ガスケットの表面接着剤から透明な保護フィルムをはがします。最後に45 μLの新鮮なゲル溶液を加え、カバースリップをチャンバーにそっとかぶせ、気泡が溜まらないようにします。カバーガラスを押してチャンバーをシールし、4°Cで10分間インキュベートします(4°Cで合計30分間平衡化)。
- ゲルを37°Cで1.5時間重合します。
- ゲルが固まったら、ベンチで数分間冷まします。カバースリップを慎重に取り外し、新しいカミソリの刃でシリコンガスケットを取り外します。次に、ゲルを長方形にトリミングし、右上隅をカットしてサンプルの向きを追跡します。
- 少量のProKバッファーで湿らせた細いペイントブラシでスライドからゲルを取り出し、2 mLの微量遠心チューブに個別に移します。
- 各ゲルを500 μLのProKバッファーと5 μLのProK酵素(1:100)と37°Cで一晩インキュベートします。
4. DNAの消化とプローブのハイブリダイゼーション (3日目)
- ゲルを3回、PBS1 mLで10分間RT.
で洗浄します。 注:溶液を交換するときにゲルが損傷しないように、先端の細いトランスファーピペットを使用してください。 - ゲルを1 mLのDNase1バッファーに37°Cで30分間インキュベートします。
- DNaseバッファー450 μLにDNase1酵素50 μLを添加します。穏やかに混ぜますが、渦巻きはしないでください。各ゲルを500 μLのDNase1で2時間37°Cインキュベートし、1 mLのPBSと15分間RT.
で洗浄(4回)します 注:ゲルは、DNase消化/洗浄の前後に数週間、4°Cで5x SSCに保存できます。 - ハイブリダイゼーション(hyb)とプローブ洗浄バッファーを解凍します。ゲルをプローブなしの500 μLのhybバッファーに37°C.
で30分間インキュベートします。 注意:hybおよびプローブ洗浄バッファーには、がんを引き起こす疑いのあるホルムアミドが含まれています。 - プローブをhybバッファー(10 nM)で1:100に希釈し、ゲルあたり300 μLを調製します。ゲルをhybバッファーおよびプローブと共に37°Cで一晩インキュベートし、プローブ洗浄バッファーおよびPBSを37°Cに保ちます。
5. プローブ洗浄 (4日目)
- ゲルを3回洗浄(3回)し、750μLのプローブ洗浄バッファーで37°Cで30分間洗浄します。
- ゲルを3回30分間洗浄し、次に3回3回、PBS1 mLを37°Cで1時間洗浄します。
- ゲルを2 mLのPBSでRTで一晩、または週末に4°Cで洗浄します。
6. 蛍光ヘアピンを用いたハイブリダイゼーション連鎖反応(HCR)(5日目)
注: HCR の原則については、reference22 を参照してください。
- ゲルを500 μLの増幅(アンプ)バッファーに室温で30分間インキュベー トします。
- 蛍光ヘアピンをPCRマシンで95°Cで90秒間加熱し、25°Cまで30分間急速に冷却します。
- 各プローブについて、適合するヘアピンペア(h1およびh2)をアンプバッファーで1:50に希釈し、ゲルおよびボルテックスあたり300μLを調製します。
- ヘアピン混合物とゲルを暗所のRTで3時間インキュベートします。
- ゲルを(2回)750 μLの5x SSCTで15分間、(2回)1 mLの0.5x SSCTで30分間RTで洗浄します。
- 脳がGFPを発現している場合は、5 mg/mLの超高純度BSAを含むPBT(0.1%)中の500 μLの抗GFP-AF488抗体(1:500)で染色し、4°Cで一晩(または週末)インキュベー トします。
7. ゲルの埋込とイメージング (6日目)
- 抗体インキュベーション後、ゲルを1回すすぎ、PBT1 mL(0.1%)で30分間洗浄(1回)、続いてPBS.
1 mLで30分間洗浄します 注:PBSで洗うと2倍に膨張します。3倍膨張の場合は、0.05x SSCで洗浄します。 - 洗浄中は、ライトシート顕微鏡ゲルホルダーのゲル付着面に1μLのポリリジンを2回塗布し、コーティングの合間に37°Cで乾燥させます。同様に、共焦点イメージングでは、ガラス底皿のゲル付着領域にポリリジンを繰り返し塗布してコーティングします。
- ゲルを5 μg/mlのDAPI/PBSまたはDAPI/0.05x SSCの1 mLの室温で30分間染色するか、または4°Cで一晩染色します。
- ゲルホルダー(ライトシート顕微鏡)またはガラスボトムディッシュ(共焦点顕微鏡)にゲルを取り付けるには、ゲルをカバーガラスに置き、糸くずの出ないワイプで端を注意深く乾かします。組織が目的に最も近いようにゲルが向きを合わせていることを確認してください。絵筆を使用して、ゲルをポリリジン表面に1回でそっと置きます。イメージングには、ゲルをPBS(または3倍に拡大する場合は0.05倍SSC)に浸します><。 注:イメージング後、湿ったペイントブラシでポリリジン表面からゲルを静かに取り除き、2mLの微量遠心チューブに移すことができます。
- すぐに再プローブを行うには、7日目に進みます。長期保存(1週間から6ヶ月)の場合は、ゲルを5x SSC1 mLに入れて4°Cで保存してください。使用する準備ができたら、ゲルを1mLのPBSで10分間(3回)洗浄してから続行します><。 注:拡張の程度は、通常、説明されているバッファーで一貫しています(PBSでは~2倍、SSCでは0.05倍~3倍)。拡張係数を確認するためには、蛍光実体顕微鏡で撮影した画像で拡大前後の脳の大きさを測定します。拡張後の脳を視覚化するには、DAPIで脳を短時間染色します。おおよその拡張係数は、拡張後のサイズを拡張前のサイズで割った値です。
8. 多重化のためのプローブとヘアピンの剥がし (7日目)
- ゲルを1 mLのDNase1バッファーに30分間インキュベートします(37°C)。
- DNaseバッファー450 μLにDNase1 50 μLを添加します。穏やかに混ぜますが、渦巻きはしないでください。ゲルを500 μLのDNase1で2時間、37°Cでインキュベートします。
- RTで1mLのPBSで15分間洗浄(4回)し、ゲルは次のハイブリダイゼーション(3日目、ステップ6)の準備が整いました。
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結果
この改良されたEASI-FISHプロトコルの性能は、成体Drosophilaの脳において、複数のラウンドにわたり、いくつかの異なる神経伝達物質関連遺伝子およびニューロペプチド遺伝子の発現を検出することで実証されています。通常、ゲル化および拡張された脳に対し、1ラウンドあたり2～3種類のプローブでハイブリダイゼーションを行い、続いてAlexa Fluor (AF) 48（GFPが発現している場合を除く）、AF546、AF647、またはJanelia Fluor (JF) 69が結合したヘアピンペアを用いてHCRを行いました。イメージングは主にライトシート顕微鏡を用いて行われ、単一のz-stackまたは脳全体をカバーするように繋ぎ合わせられた複数のタイル画像を取得しました。また、共焦点顕微鏡を用いて単一のz-stackも取得しました（詳細はFigure 2およびFigure 3の凡例を参照）。
図2
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ディスカッション
無傷の ショウジョウバエ 神経系について説明されているEASI-FISHプロトコルは、同じ脳またはCNS内の数十の転写産物の検出を可能にします。堅牢で、単純で、感度が高く、GFP 検出と組み合わせて、ニューロンまたはグリアのサブセットを識別できます。この方法は実装が簡単なため、無傷のハエの脳における遺伝子発現のマッピングと定量化に関心のある ショウジョウバエ 研究室による研究が容易になるはずです。
EASI-FISHには、膨張顕微鏡を含まない以前のFISHプロトコルに比べていくつかの利点があります。マウス組織17で以前に報告されているように、FISHの多くのラウンドにわたって優れたRNA安定性が観察されます。これは、mRNAのゲルマトリックスへのアンカー、および組織由来RNアーゼのアンカーと部分消化が原因である可能性があります。他の公開されたプロトコル5、7、<...
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開示事項
利益相反は宣言されなかった。
謝辞
膨張顕微鏡のダイナミクスに関するアドバイスを提供してくださったPaul Tillberg氏、脳の解剖を支援してくださったChristina Christoforou氏、重要なフィードバックを提供してくださったGeoffrey Meissner氏に感謝します。さらに、2つの大規模な研究の一部として生成された結果を含めることを許可してくれたTanya Wolff氏とGerry Rubin氏、Geoffrey Meissner氏とWyatt Korff氏に感謝します。すべての作業はJanelia Research Campusで行われ、Howard Hughes Medical Instituteの資金を通じて、MultiFISHおよびFly-eFISHプロジェクトチーム、Gerry Rubin、およびProject Technical Resourcesの支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.2 mL PCRチューブ | USAサイエンティフィック | 1402-4700 | |
| 0.5 mLスクリューキャップ微量遠心チューブ、Amber | USA Scientific | 1405-9707 | |
| 0.5M EDTA, PH 8, RNase free | Invitrogen | AM9260G | |
| 10M NaOH | Sigma | 72068 | |
| 10x PBS | フィッシャーBP | 3994 | |
| 20x SSC | サーモフィッシャーAM | 9763 | |
| 40%アクリルアミド | バイオ・ラッド | 1610140 | |
| 4-Hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma | 176141 | |
| 5 M NaCl RNase-free | サーモフィッシャー | AM97060G | |
| 5 ml トランスファー ピペット - ファインチップ | グローバル サイエンティフィック | 134070-S20 | |
| 6ウェルガラス底板 | セルビス | P06-1.5H-N | |
| アセトニトリル、無水 | サーモフィ | ッシャー042311-K7 | |
| アクリル酸 | TCI | A0141 | |
| アクリロイル-X | ThermoFisher | A20770 | |
| 過硫酸アンモニウム (APS) | Sigma | A3678 | |
| 増幅バッファー | 分子機器 | https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish | |
| 無水 DMSO | Invitrogen | D12345 | |
| AstA_B2 | 分子機器 | PRR477 | |
| ChAT_B1 | 分子機器 | PRG115 | |
| Crz_B5 | 分子機器 | PRR480 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| FIJI | Open source | https://imagej.net/software/fiji/ | |
| FMRFa_B2 | Molecular Instruments | PRR487 GAD1_B5 | |
| Molecular Instruments | RTE581 | ||
| GFP Polyclonal Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21311 | |
| Hybridization Buffer | Molecular Instruments | ||
| イマリス スティッチャー | オックスフォード・インスツルメンツ | https://imaris.oxinst.com/products/imaris-stitcher | |
| イマリス・ビューア | オックスフォード・インストゥルメンツ | https://imaris.oxinst.com/imaris-viewer | |
| JF-669, SE | Tocris | 6420 | |
| Melphalan | Caymen Chemicals | 16665 | |
| MOPs緩衝 | フィ | ッシャーBP308-100 | |
| N、Nメチレン-ビス-アクリルアミド | バイオ・ラッド | 1610142 | |
| N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン (TEMED) | Sigma | T22500 | |
| ヌクレアーゼフリーウォーター | Ambion | AM9932 | |
| オリゴプローブ | |||
| EMS | 15710 | ||
| PBS | Fisher | ||
| BP24384 Photoflo-200 | EMS | 74257 | |
| ポリ-L-リジン臭化水素酸塩(ポリリジン) | Sigma | P1524 | |
| Probe Wash Buffer | Molecular Instruments | https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| QIAquick ヌクレオチド除去キット | Qiagen | 28306 | |
| RNase Away | ThermoFisher | 7003、除染試薬 | |
| RNase-Free DNase1 | Qiagen | 79254 | |
| S2 Medium | ThermoFisher | 21720024 | |
| Silicone Gaskets | Invitrogen | P24743 | |
| Tdc2_B5 | Molecular Instruments | RTE880 Tk_B5 | |
| Molecular Instruments | PRR484 | ||
| UltaPure 10% SDS | Thermofisher | 15553027 | |
| Ultrapure | BSA ThermoFisher | AM2616 | |
| 非標識およびAlexa Fluor標識ヘアピン | 分子装置 | ||
| VAChT_B1 | Molecular Instruments | RTA904 | |
| vGLUT_B2 | Molecular Instruments | RTB212 | |
| Zeis Z7 ゲルホルダー | ジャネリア | CADファイルもご要望 | |
| ツァイス LSM 980 共焦点倒立顕微鏡 | ツァイス | https://www.janelia.org/node/46947/#lsm980 | |
| ツァイスZ7ライトシート顕微鏡 | ツァイス | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html |
参考文献
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