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方法論記事

マウスの小児脳震盪モデル:長期障害を伴う閉鎖性頭部外傷(CHILD)

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⸱

DOI:

10.3791/67667

⸱

2025年2月7日

 ,  ,  , 
1Centre d'Études Biologiques de Chizé-Centre National de la Recherche Scientifique (CEBC-CNRS), UMR 7372 CNRS/Université de La Rochelle, 2Univ. Bordeaux, CNRS, CRMSB, UMR 5536, 3Division of Biomedical Sciences, School of Medicine, University of California Riverside, 4Department of Basic Sciences, Loma Linda University School of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

小児脳震盪は、生理学的および心理的な摂動を伴う長期的な後遺症を引き起こす可能性があります。この小児脳震盪マウスモデルは、長期的な神経炎症、白質の変化、および行動機能障害を伴うニューロンの変化をもたらします。このモデルは、影響の異なる場所や脳震盪の繰り返しに適合させて、寿命の変化を評価できます。

要約

小児期の脳震盪や軽度の外傷性脳損傷(mTBI)は、重大な健康上の危険にさらされており、多くの患者が後年、衰弱させる生理学的、神経学的、心理社会的結果を示しています。細胞および分子の病態生理学的メカニズムは比較的不明であり、この大きなギャップは、慢性的な後遺症を軽減するための特定の治療戦略の研究を効果的に妨げています。単一の動物脳震盪モデルは、ヒト被験者で報告されたすべての特徴を再現するものではなく、現在のモデルは特定の研究課題に答えるように設計されています。私たちは、臨床的に早期に遭遇した長期的な症状を再現する若年性脳震盪の開発に着手しました。これは、長期障害を伴う閉鎖性頭部外傷 (CHILD) と呼ばれます。このモデルでは、電磁インパクター を介した 脳震盪力が、軽く麻酔された出生後17日目(P17)マウスの頭部に伝達され、頭部の自由な回転を可能にします。マウスを定位装置を横切ってしっかりと張った錫箔の上に置き、インパクターを標的皮質領域に注意深く位置合わせします。電磁インパクターは、損傷の重症度を判断するための衝撃の深さ、滞留、および持続時間の選択を容易にします。このモデルの強みは、重要な臨床的特徴である頭の回転を可能にすることです。衝突後、マウスはすぐに監視され、環境を探索する時間と時間が正しくなり、その後、ダムに戻ります。脳震盪の重症度が増加すると、マウスのサブセットで頭蓋内出血が起こります。マウスは、必要に応じて、その生涯にわたって行動と神経イメージングについて定期的に監視できます。さまざまな傷害の重症度は、若年性脳震盪の不均一な性質を模倣しています。現在の標準 CHILD モデルは、頭蓋骨骨折、観察可能な従来の神経画像の変化 (臨床と同様) を示さず、進行性および持続的なニューロン死、拡散 MRI の変化、ニューロンの活動と可塑性の変化、神経膠症の増加、および年齢に伴う進行性の行動摂動につながります。要約すると、この CHILD モデルは、多くの臨床脳震盪患者で観察される初期および長期の特徴を模倣しています。

概要

小児外傷性脳損傷(TBI)は、小児救急医療の訪問の主な原因であり、後年の健康状態を衰弱させることに関連しているため、主要な健康上の懸念事項です。全脳外傷の75%を占める軽度の脳外傷(mTBI)でも1、生理機能障害、心理的機能障害、神経機能障害、認知機能障害などの長期的な異常を引き起こします2。小児のmTBIの発生率が高く、それに関連する重大な健康リスクがあるにもかかわらず、慢性的な欠損に先行する病理学的、細胞的、および分子的なメカニズムはまだ十分に調査されていません。この知識のギャップは、小児mTBIの効果的な治療法と診断方法の開発を妨げています。

成体のげっ歯類のTBIモデルには、体重減少、制御された皮質衝撃、および体液打楽器の損傷が含まれ、中等度から重度の損傷を引き出すために滴定することができます(結果の測定に依存)3,4。これらの成人モデルの多くは、小児外傷性脳外傷5,6に適合しています。過去10年間で、mTBIのモデルは、閉鎖性頭部外傷のげっ歯類と回転モデル7で開発されました。ただし、げっ歯類の開発におけるこれらのモデルの実装は、成体のTBI文献8と比較してまばらです。小児の臨床的不均一性をモデル化する幅広い重症度を網羅する臨床的関連性に対処するために、この研究では、長期障害を伴う閉鎖性頭部外傷 (CHILD) TBI モデルを開発しました。CHILDは、P17マウスを用いた非外科的、拘束されていない脳震盪モデルであり、2〜3歳の子供9で観察される髄鞘形成のピークに対応する発達年齢です。脳震盪力は、軽くイソフルラン麻酔をかけたマウスの体性感覚皮質に電磁インパクターを使用して伝達されます。拘束されていない頭部に衝撃を与えると、多くの臨床脳震盪報告で報告されているように、脳10に回転力が加わります。臨床mTBIと一致して、CHILDモデルは、従来の神経画像で頭蓋骨骨折や目に見える異常を引き起こさない。

CHILD モデルにはいくつかの利点があります。まず、早期および長期の病理学的特徴がCHILDで観察されており、若年性脳震盪患者で観察された病理学的臨床的特徴を模倣しています。これは、後期の時点で神経膠症、拡散テンソルMRIの変化、および年齢10,11、ニューロン活動の変化、および可塑性11,12に伴う進行性の行動摂動で観察されています。興味深いことに、1回の小児損傷後の長期にわたる心臓の異常では、思いもよらない末梢の影響も発見されました13。第二に、このモデルは再現可能であり、研究者間および研究室間で同等の結果を示しました13。第 3 に、CHILD モデルは柔軟性があり、TBI の異種性をカプセル化するように拡張できます。例えば、以前の研究では、衝撃の速度と深さが異なると、重大度が異なることが示されています10,11。最後に、このモデルのさらなる強みは、CHILDを繰り返し投与でき、異なる場所に簡単に適用して、繰り返しの損傷に対する反応を調査し、脆弱な脳領域を特定できることです。

全体として、CHILD モデルは臨床的な小児 mTBI と脳震盪を再現し、小児 mTBI の病態生理学的特性の理解を促進するための研究ツールとして機能します。実際のTBIの症例で説明される特徴のすべての側面をカプセル化するモデルはありませんが、このモデルは、未解決のままである多くの未解決の研究課題に対処できます。

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プロトコル

実験は、ボルドー大学(フランス)とカリフォルニア大学リバーサイド校(米国カリフォルニア州)の2か所で再現されました。

ボルドーでは、すべての実験を大学の動物施設で繁殖させた雌のP17 C57Bl6Jマウスで行いました。初期のブリーダーは商業供給源から入手し、12/12時間の暗/明サイクル、温度21°C±1°C、湿度55%±10%の標準条件下で飼育し、餌と水 を自由に提供しました。実験手順は、ボルドー大学動物管理委員会の規則、実験動物の使用を規定するフランスの法律(認可#29324-2021012118549817 v3)、欧州理事会指令(86/609/EEC)、およびARRIVEガイドラインに準拠しています。このプロトコルは、外傷性脳損傷の軽度のモデルであり、痛みや苦痛を引き起こさない。そのため、通常の疼痛管理以外に特定の疼痛管理は必要ありません。子犬(TBI、シャムス)の離乳はP25で効果的でした。

リバーサイドでは、E13妊娠C57Bl6J雌マウスを市販し、P17の雄と雌の両方の子マウスで得られた同腹仔に対してすべての実験を行った。動物は、自動化された12/12時間の暗/明度サイクルと21°Cの温度で飼育されました。 ダムや子 犬は、 食べ物や水を自由に手に入れることができました。すべての実験手順は、カリフォルニア大学リバーサイド校の動物管理および使用委員会によって承認され、動物福祉法および公衆衛生サービスの方針に準拠していました。その施設のすべての子犬(TBI、Sham)はP21で離乳しました。

この研究で使用された動物、試薬、および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. 事前準備

  1. 低体温症を防ぐために、麻酔導入用のチャンバーとリカバリーケージを事前にウォーミングパッドで温めてください。
  2. 定位固定装置をインパクターを90°の角度で取り付けてセットします。
  3. すべての部品が適切に締められて固定されていること、およびピストンがインパクターにしっかりとねじ込まれていることを確認します。
  4. 脳定位固定装置(この場合は18 cm x 30 cm)に合うアルミニウムシートをカットします。ここで使用されているアルミニウムは、標準的なアルミニウム品質です。定位固定装置フレームをホイルで包み、動物を載せるパッドを形成します。動物の体重を支えるために、ホイルの位置と張力を通常のラボテープで固定します。
  5. インパクターコントローラーの電源を入れ、怪我の重症度に応じて、衝撃の速度をグレード1(G1)の場合は2 m.s-1に、グレード2(G2)の場合は3 m.s-1に設定します(このパラメーターを変更すると、脳震盪の重症度に影響します)。
  6. 動物の重さを量ります。P17では、C57Bl6マウスの動物の体重は5.9gを超えている必要があります。その体重に該当する動物は除外されます。
    注:一部の研究では、CD1マウスを使用し、P17については、閾値を6.5g以上(個人データ)に固定しました。

2. 若年性軽度外傷性脳損傷の手技

  1. イソフルランに5分間曝露してマウスに麻酔をかけます。ガス組成を2.5%の混合物(この場合、キャリアは21%の酸素を含む合成空気混合物)に設定、流量は1.5 L / minです。
    注:このステップから、影響を受けていない動物は5分以内に目を覚ますため、すべてのアクションを迅速に実行する必要があります。
  2. マウスヘッドをインパクターの下に置きます。子犬はすべての長さに広げられるべきです。先端は直径3mmで、金属が頭蓋骨に与える影響を最小限に抑えるためにゴムで覆われています。
  3. インパクターを下げるには、ノブを エクステンド の位置に切り替えます。
  4. インパクターを大まかに下げ、インパクターがちょうど耳の間にくるようにマウスを配置します。次に、マウスをスライドさせて、ピストンの先端が 1 つのピストン チップに相当する前方に移動し、1 つのピストン チップが動物の左側に移動するようにします ( 図 1 を参照)。
    注意: 偽の動物はピストンから少し離れた位置にあります(動物のどの部分も衝撃を受けないようにしてください)。
  5. インパクターを下げて、動物の頭に接触させます(図1、E2)。
  6. インパクターをRetractに設定します(図1、E3)。
  7. 怪我の重症度を判断するには、ピストンをグレード1(G1)の場合は1mm下に動かします。より深刻な衝撃グレード2(G2)の場合は、ピストンを3 mm下に動かします(図1E4)。
  8. 重症度に関係なく、滞留時間を 0.1 秒に設定します (このパラメーターを変更しても、脳震盪の重症度には影響しません)。
  9. 右のノブの[Impact]を押します(図1、E5)。
  10. システムが過熱しないように、左のノブをオフの位置にすばやく設定します。詳細については、フローチャートを参照してください(図2)。

figure-protocol-1
図1:インパクターチップの位置 (A) インパクターチップは、まず耳の間の正中線上に配置されます。(B)次に、先端を3mm前方(先端の直径に相当)動かします。(C)最後に、ピストンチップをマウスの左側で3mm動かします。(D,E)磁気バレルに対するインパクター先端の可能な位置。(D)インパクターには、ピストン本体に対して3つの位置(ニュートラル、引っ込み、または伸長/衝撃)があり、その間に5mmの範囲があります。(E)手順のさまざまな段階での頭蓋骨表面に対するインパクター先端の位置。(1)インパクターの中立位置の位置。(2)ピストンを動かして動物の頭蓋骨にそっと触れます(ステップ2.5)。(3)次に、インパクターがリトラクトするように設定されます(ステップ3.6)。(4)インパクターの全身をXmm下に移動します(ステップ2.7)。G1グレードの場合、G1の衝撃速度(y)は2 m.s-1、深さ1 mm(x)、G2の衝撃速度(y)は3 m.s-1、深さ3 mm(x)です。(5) レバーインパクトを押すと、インパクターの先端は、中立位置に戻ると滞留時間中に頭蓋骨表面からxmm下をy速で移動します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-2
図 2: CHILD フロー チャート。 PND17マウスでCHILDを誘導する手順を詳述したフローチャートは、脳震盪誘発のさまざまなフェーズを示すために色分けされています。セットアップの写真には、(A)インパクトコントローラー、インパクターとチップがぴんと張った錫箔の上に配置された定位装置、および加熱パッドの上部にあるリカバリーボックスを含む、CHILDインダクションセットアップ全体(麻酔器は見えません)が含まれます。(B)目盛り付きラバーインパクトチップ(3mm)。(C)錫箔を定位フレーム全体に張った定位装置と、インパクトチップが箔の上に配置されたインパクターソレノイド。(D)ヒートパッドの上に座っている回復チャンバー。(E)フローチャートのように強調表示された2つの制御スイッチを備えた衝撃コントローラー(赤いボックス=伸縮/後退/オフ、紫のボックス=衝撃トグル)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3.心的外傷後のフォローアップ

注:次の手順は、オフライン分析のためにビデオ録画できるため、実験者は複数の動物に対して連続してCHILDを実行できます。それにもかかわらず、動物の健康状態について定期的かつ反復的な評価を実施する必要があります。

  1. 無呼吸がある場合(衝撃直後)、および衝撃中に頭が回転したかどうか、無呼吸の持続時間に注意してください。
  2. マウスをリカバリーケージの右側に置きます。
  3. マウスの立ち直り時間(4本足で育てる)と探索行動を再開する時間に注意してください。通常、偽マウスは3〜4分以内に目を覚まし、3〜4分後に探索的行動を再開します(図3)。CHILDマウスは、衝撃後7〜12分以内に覚醒し(図3A)、衝撃後12〜18分以内に探索を再開します(図3B)、性別と衝撃の重症度に応じて(図3A、B)。
    注:影響を受けた動物が30分以内に探索行動を再開しない場合、その動物は除外されます。
  4. 完全に回復したら、動物を自宅のケージに戻します。この時点で、偽マウスとCHILDマウスの行動(G1またはG2の重症度)はまったく同じであるはずであり、同腹仔内で動物群を区別できないはずです。
    注:動物は、方法の開始時に示された条件で、損傷後18か月まで維持することができます14 。行動転帰評価は、MRI測定、ミニスコープイメージング、組織学、および免疫組織化学12に関連する一連のテストを使用して実行できます。GFAPおよびNeuNの免疫組織化学は、モデルと組織変化の存在を検証するために、早い時点で使用することができます。

4. 免疫組織化学

注:損傷の1日後、G2および偽群の動物(G2の場合はn = 4マウス、Shamの場合はn = 4)を麻酔し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)0.1 M、pH 7.4、4°Cで調製した4%パラホルムアルデヒド(PFA)で経心灌流しました。 脳を頭蓋骨から10 個抽出し、同じPFA溶液に一晩浸漬した後、アジ化ナトリウム(0.1%)を含むPBSに移してから切断しました。次に、ビブラトームを使用して冠状切片を厚さ50μmで調製しました。長期保存の場合、切片を凍結保護培地(PBS中の30%エチレングリコールと20%グリセロール)に-20°Cで使用し、使用しました。脳震盪が脳神経膠症およびニューロン損失に及ぼす影響を特徴付けるために、GFAPおよびNeuNを標的とした免疫組織化学を以下に説明するように実施した。

  1. PBSで脳切片を10分間4回洗浄します。
  2. ブロッキング溶液(1% BSA、0.3% Triton X-100 in PBS)で切片を室温(RT)で10分間移します。
  3. ブロッキング溶液で希釈した以下の一次抗体を用いて切片を4°Cで一晩インキュベートします:ニワトリ抗GFAP(1:3000)およびウサギ抗NeuN(1:500)。
  4. 攪拌しながら、スライスをPBSで10分間4回洗浄します。
  5. 次に、室温で1:1000で1時間希釈した二次蛍光抗体、Alexa-Fluor-488-nmヤギ抗ウサギ、およびAlexa-Fluor-568-nmヤギ抗ニワトリを含むブロッキング溶液に切片を移します。
  6. 次に、攪拌しながらPBSで切片を4回10分間洗浄します。
  7. 封入剤を使用してスライドに切片を取り付け、カバースリップを追加します。画像取得までスライドを4°Cに保ちます。
  8. 落射蛍光顕微鏡とmicromanagerソフトウェアを使用して免疫蛍光を取得します。10倍レンズ付きのスティッチングプラグインを使用して、同側および反対側の半球のタイル画像を取得します。
    注:一次抗体または二次抗体が省略されたネガティブコントロール染色では、検出可能な標識は示されませんでした。より詳細な画像解析のために、Fijiソフトウェア15 を使用して、関心16の様々な領域における免疫染色パラメータを定量化することができる。

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結果

CHILDモデルは、小児マウスにおけるmTBIの比較的迅速で再現性の高いモデルであり、重症度と場所のばらつきも許容します。CHILDマウスは、予想通り、閉鎖性頭部外傷からの回復時間が有意に長かった(図3)。コホート(n = 36 雌の偽、n = 140 雄の偽、n = 30 雌の G1、n = 55 雄の G1、n = 32 の雌 G2、n = 141 の雄 G2)を集約すると、直立時間(図3A、3元配置ANOVA p < 0.001)と探索的行動を再開する時間(図3B、3元配置ANOVA p < 0.001)の遅延が観察されました。回復期間は、影響の深刻度にも依存していました(図3、G1 対 G2、3元配置分散分析、 p <両方のパラメータで0.001)。性の影響は明確に観察され、年齢が一致した女性は、正解時間...

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ディスカッション

プロトコルの重要なステップ
ここで説明するCHILDプロトコルでは、(1)衝撃パラメータ(速度、深さ、持続時間)を標準化し、(2)ラボ内およびラボ間での再現性を確保し、(3)市販できる電磁インパクター(図2A)の使用が必要です。もう一つの重要なコンポーネントは、げっ歯類の頭を打つインパクターの先端です。シリコンチップから金属チップまで、さまざまな可能性を使用できますが、このプロトコルでは、2mLシリンジのプランジャーから得られるゴムチップを使用します(図2B)。ゴム製の先端の理論的根拠は、衝撃の力と回転を頭蓋骨に伝えることですが、頭蓋骨の骨折を引き起こさずに済みます。G2マウスでは、小さなサブセットが頭蓋骨骨折を示し、関連する硬膜下出血の有無にかかわらず。電磁インパクターを使用すると、G1およびG2の指定で行われているように、衝撃の深さとともに速度/持続時間を操作して重大度を調節する機会も提供されます。頭部のイン...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この手法論文は、Eranet Neuron Neuvasc (Badaut)、Agence Nationale de la Recherche Nanospace (Badaut)、CNRS IRP IINOVAtion (Badaut)、NIH NINDS Grant No. 1R01NS119605 (Obenaus, Badaut) および 1RF1NS138032 (Obenaus, Territo) の資金提供を受けました。図 1 は BioRender.com を使用して作成されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
BSASigma Aldrich Chimie S.a.r.l
80 Rue de Luzais
L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701
38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex
France		A7030
C57Bl6J mice チャールズリバー研究所フランスCRLF 9 All.ムーランベルガー、69130Écully, FranceElectromagnetic
impactorLeica Biosystems, Richmond, IL USAImpact One stereotaxic impactor
落射蛍光顕微鏡Olympus, BX41, Center Valley, PA
Ethylen glycolSigma Aldrich Chimie S.a.r.l
80 Rue de Luzais
L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701
38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex
France		102466
GFAP 一次抗体Millipore, Billerica, MAAB5541chicken anti-GFAP
GFAP secondary antibodyMolecular Probes, InvitrogenA11034ヤギ 抗ウサギ AlexaFluor  488
GlycerolSigma Aldrich Chimie S.a.r.l
80 Rue de Luzais
L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701
38297 Saint-Quentin-FallavierCedex
フランス		G5516
ヘビーデューティアルミホイルカークランドRK611Cosco
Micromanagerソフトウェアで取得 (NIH, USA
NeuN 一次抗体AbCam, Discovery Drive, Cambridge
Biomedical Campus,
Cambridge, CB2 0AX, UK		AB128886rabbit anti-NeuN
secondary antibodyMolecular Probes, InvitrogenA11041ヤギ抗ニワトリ AlexaFluor 568
PBSSigma Aldrich Chimie S.a.r.l
80 Rue de Luzais
L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701
38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex
France		P5493
PFASigma Aldrich Chimie S.a.r.l
80 Rue de Luzais
L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701
38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex
France		1.04003
アジ化ナトリウムSigma Aldrich Chimie S.a.r.l
80 Rue de Luzais
L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701
38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex
France		26628-22-8
Stereotaxic frame - baseKOPF instruments 7324 Elmo St, Tujunga, CA 91042, & Eacute;tats-Unis900-C
脳定位固定装置フレーム - 電極マニピュレーターKOPF instruments 7324 Elmo St, Tujunga, CA 91042, États-Unis960
Stereotaxic frame - U-frameKOPF instruments 7324 Elmo St, Tujunga, CA 91042, & Eacute;tats-Unis900-U
Triton x-100Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l
80 Rue de Luzais
L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701
38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex
France		X100
VectashieldVector laboratoriesH-1000-10Mounting medium
VibratomeLeica Biosystems, Richmond, IL USAVTS1000
ジャクソン研究所 ジャクソン研究所 600 Main Street Bar Harbor, ME USA 04609UCR
は

参考文献

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