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方法論記事

Ex vivoマウスモデルにおける肺機能の評価

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DOI：

10.3791/67668

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2025年5月16日

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1Department of Surgery, Medical University of South Carolina, 2Department of Microbiology and Immunology, Medical University of South Carolina

この記事について

サマリー

本プロトコルは、強制振動法(FOT)を使用して ex vivo マウスモデルの呼吸力学を分析するための段階的な方法を説明する。

要約

呼吸力学は、機能的な肺活量を評価することにより、肺の病状を定義および治療する上で重要な研究分野です。肺の力学は、さまざまな振動波形を含むさまざまな肺操作を通じて評価できます。これらのマニューバを肺に適用すると、波形への応答に基づいて、圧力、体積、流量などの複数の変数が測定されます。次に、これらの信号を計算および分析して、ヒステリシビティ、抵抗、コンプライアンス、組織減衰、組織エラスタンスなどのパラメーターを決定し、全体的な肺機能を詳細に評価します。呼吸力学の解析は、肺移植のためのドナー肺の評価において特に重要です。本プロトコルは、 ex vivo マウスモデルを使用して呼吸器力学を評価するための包括的で再現性のある段階的な方法を提供する、この種のものとしては初めてのものです。これには、選択した動物モデル、肺の回復、保存と保存、および強制振動技術ベースのシステムを使用した実験の詳細が含まれています。さらに、データ分析、臨床的意義、 およびex vivo モデルの研究における強制振動技術の応用について概説します。

概要

肺移植は、末期の肺疾患に対する唯一の持続的な治療法です。世界中で毎年約4,600人が肺移植を受けていますが、適切なドナーの肺の不足に続いて、約600人の患者が順番待ちリストで死亡しています1,2。利用可能な肺のプールを増やすために、ドナー割り当てシステムは継続的に調整され、その結果、外科医はドナー臓器を確保するためにより遠くまで移動するようになりました3。距離が長くなると、常に寒冷虚血時間が長くなり、臓器保存の追加の方法が必要になります。

肺移植のドナー臓器保存の現在の基準は、4°Cでの低温静的保存であり、保存時間を6〜8時間に制限します-移植の生存可能性の小さな窓4。ただし、移動距離が長くなり、その結果として虚血時間が長くなるため、移植前の肺機能の評価は非常に重要です4。肺移植の政策が進化する中、このニーズに対応するための新しい研究が行われてきました。最近の研究では、10°Cでの低温静電気保存が肺保存に最適な保存温度であり、その結果、肺機能、損傷に対する抵抗性、および移植されたときの一次移植片機能障害の同等の割合が改善されることが示唆されています4,5,6,7,8。さらに、ex vivo lung perfusion(EVLP)を中心とした研究では、レシピエントに害を及ぼすことなく、ドナーの肺利用と移植が大幅に改善されたことが示されています9。肺移植のためのドナープールを拡大し、保存期間を延長するためのEVLPの使用は十分に文書化されていますが、この技術は高価で時間がかかり、10を実行するには専門的なトレーニングが必要です。そのため、ex vivo の肺機能を研究するためには、包括的で安価で再現性のある追加の方法が必要です。

コンプライアンス、抵抗、エラスタンス、圧力-体積曲線など、肺力学の従来の測定値は、ボディプレチスモグラフィーを使用するか、シングルコンパートメントモデルを使用した人工呼吸器技術を使用して確実に決定できます。より詳細な力学は、強制振動モデルを使用して定相モデルに適合させることで得ることができ、これにより気道力学を中央コンパートメントと末梢コンパートメント(ニュートン抵抗、組織減衰/エラスタンス、ヒステリシビティ)に分割することができます11。 これらの技術の適用は再現性があり、包括的であるが、これまでのところ、限界は、おそらく、放血した肺が肺胞入口リング12で構造を失うため、生体内モデルでそのような測定を行う要件であった。この研究では、市販の強制振動技術に基づく小型げっ歯類人工呼吸器を使用し、肺移植アプリケーションの肺力学をより適切に特徴付けるための ex vivo モデルを開発することを目的としています。

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プロトコル

この研究は、National Institutes of Health Guides for the Care and Use of Laboratory Animals(国立衛生研究所の実験動物のケアと使用に関するガイド)に従って、動物研究委員会によって承認されました。6-8週齢、体重18-28gのC57Bl/6野生型マウスを用いた。試薬および装置の詳細は 、材料表に記載されています。

1. 事前準備

  1. すべての外科的処置に最大20倍の倍率の手術用顕微鏡を使用してください。
  2. 手順を開始する前に、すべての手術器具を洗浄および滅菌してください。オートクレーブ装置を使用するか、適切な滅菌溶液を使用して無菌状態を維持します。

2. ドナー肺の摘出

  1. すべての操作を無菌状態で行ってください。
    注:このステップは、専用の手術スペースで無菌条件下で行われます。
  2. マウスを麻酔導入チャンバーに入れ、酸素中の5%イソフルランで麻酔を誘発し、手順全体を通して酸素中の3.5%イソフルランで麻酔を維持します(施設で承認されたプロトコルに従います)。
  3. 最初の切開前にマウスの重量を記録します。
  4. マウスを手術台に固定し、つま先に圧力をかけて適切な麻酔の深さを確保します。マウスが痛みで引きこもる場合は、必要に応じて麻酔を増やします。
  5. 標準的な手順13に従って、ドナーから肺を取り出します。
    注:肺と心臓は、 生体外で肺を灌流するためにブロックで抽出され、気管の一部は後で挿管するために除去されました。

3.肺の保管と保存

  1. 肺がドナーから取り除かれたら、カテーテルを慎重に前進させることにより、18Gの静脈内血管カテーテルで気管を挿管し、気管に穴を開けないようにします。
  2. 3-0シルク縫合糸を使用して気管をカニューレに固定し、しっかりと密閉します。18 G の静脈内血管カテーテルを、肺動脈弁を過ぎたばかりの右心室流出路 (RVOT) 内になるまで進めます。
  3. 肺が体から取り除かれた時間を記録します。
  4. 市販の保存液が入った50 mLの円錐管に肺を4°Cまたは10°Cで一晩保存します。

4.セットアップとキャリブレーション

  1. まず、システムやソフトウェアの電源を入れます。
  2. プログラムを開始し、「 新しいスタディを作成」ボタンをクリックし、画面の指示に従ってプロトコルを定義し、被験者を割り当てます。
  3. [実験セッション] をクリックし、ユーザーの姓と名のイニシャルを使用してサインインします。
  4. 一貫した命名規則でサブジェクトのラベル付けを開始します。
  5. 各被験者の性別、生年月日、体重の情報を入力します。
  6. 被験者を選択して測定部位に割り当て、体重を確認します。
  7. 画面の指示に従って、ソフトウェアのセットアップとキャリブレーションを続行します。
    注:チューブのキャリブレーション中に、ドナー肺の挿管に使用されたのと同じタイプのカニューレがシステムのYチューブに取り付けられ、一貫性が確保されました。
  8. キャリブレーション値が許容範囲外にある場合は、キャリブレーションを繰り返します。
  9. 準備ができるまで換気を開始するように促すプロンプトをキャンセルします。換気とデータ記録を伴う実験セッションは、後で開始できます。

5. 肺換気とデータ取得

  1. 50 mLの円錐形チューブから肺を取り出します。.以前に配置した 18 G の静脈内血管カテーテルと 60 mL/kg の用量で追加の保存溶液を使用して、右心室流出路 (RVOT) をフラッシュし、肺の毛細血管をフラッシュします。
    注:ドナーの肺の脱水症を避けるために細心の注意を払う必要があります これは肺の力学を研究する際の既知の交絡因子です。
  2. ドナーの肺を人工呼吸器に固定し、実験を開始します。
  3. Start Ventilationをクリックし、準備ができたらStart Recordingを押して実験セッションを開始します。
    注: この研究に使用された人工呼吸器は、呼吸数が 150 回/分、一回換気量が 10 mL/kg、PEEP が 3 になるように設定されました。
  4. ページの右側にあるタスクリストから肺力学評価の タスク をダブルクリックして、各タスクを実行します。
  5. タスクリストにある Deep Inflation タスクを実行して、無気肺領域がリクルートされ、肺量が標準化されていることをさらに確認します。詳細については、「結果」セクションを参照してください。
  6. 一連のタスクを進めます。
    注:肺機能は、機械的特性を評価する複数のタスクを通じて評価できます。 Deep Inflationは 肺容量を標準化し、 Prime-8 は肺力学を安定させます。 PV-P および PV-V は、静的および動的コンプライアンス、気道抵抗、およびコンダクタンスを測定します。 Snapshot 150 は、抵抗性、コンプライアンス性、耐久性を迅速に評価し、 QuickPrime は、気道抵抗と組織抵抗、肺の粘弾性を評価します。これらのタスクをまとめて、肺機能の包括的な分析を保証します。本稿では、代表的な結果として、Deep Inflation、Snapshot 150、QuickPrime(市販の機器を使用)で行ったタスクのデータを提供します。肺活量は、データを解釈する際の交絡変数を最小限に抑えるために、Deep Inflation タスクを使用して摂動間で標準化されました。
  7. 選択した一連のタスクをトリプリケートで実行します。
  8. [録音の停止]をクリックし、[換気の停止]をクリックします。
  9. データを個別にエクスポートするか、次のサブジェクトに進んで手順5.1〜5.9を繰り返します。
    注: Snapshot 150 および QuickPrime 摂動から得られたデータの場合、信頼性の高い解析には COD >0.95 が必要です。

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結果

実験計画の図は、マウスモデルについて提供されています(図1)。市販の強制振動技術ベースの小型げっ歯類人工呼吸器システムを使用して肺を膨らませ、さまざまな条件下でのドナー組織の呼吸力学を評価しました(図2)。保存されたドナー肺のグループ間で結果を比較すると、10°Cで保存されたドナー肺のグループは、すべてのパラメーターで4°Cで保存されたすべてのグループよりも優れたパフォーマンスを発揮することがわかりました。10°Cの貯蔵グループでは、Snapshot 150摂動で評価すると、ドナーの肺は抵抗が有意に減少し、コンプライアンスが有意に増加することがわかりました。QuickPrime摂動を使用した場合、10°Cのグループでは、組織弾性、組織減衰、およびヒステリスティビティの減少傾向が認められました(図3)。このグループにおける肺機能の改善の根本的なメカニズムは調査中です。予備データは、周期的ストレッチの追加が肺の損傷を減らし、ミトコンドリアの健康の保護を強化すること...

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ディスカッション

重要性と潜在的な応用
呼吸器力学は、肺の病理学や肺損傷を研究するために、さまざまなアプリケーションで日常的に使用されています。呼吸力学の研究は、ARDSなどの疾患の進行や補助換気の場合について何度も説明されてきましたが、臓器移植に関連するため、文献でははるかに少ない説明がされています15,16,17,18,19。さらに、肺割り当てポリシーの変更やドナーの肺保存技術の進化が進む中、移植結果を最適化するために肺の呼吸力学を分析することが重要です。そのため、ドナーの肺の保管条件をシミュレートし、比較するためのex vivo動物モデルの研究が必要です。ここでは、ex vivoマウス...

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開示事項

著者らは、この研究が利益相反と誤解される可能性のある商業的または金銭的関係なしに行われたと宣言しています。

謝辞

著者は、人工呼吸器システムの使用についてSophie Paczensy氏と、彼の支援についてColin Welsh氏に感謝します。 図 1 は biorender.com を使用して作成されています。この研究は、サウスカロライナ臨床およびトランスレーショナル研究所(NIH/National Center for Advancing Translational Sciences)からの助成金によって支援されました(賞番号UL1-TR001450)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
18 G 血管カテーテルB. Braun4251687-02ストレートハブ
24 G 血管カテーテルB. Braun4251601-02ストレートハブ
3 mL シリンジフィッシャーサイエンティフィック14-823-41
3-0 シルク縫合糸MedexETH-A304H
50 mL コニカルチューブサーモフィッシャー339652
70% EtOHフィッシャーサイエンティフィックBP82031GAL
麻酔誘導室ハーバード装置75-2030ラット用気密誘導室
麻酔器 ハーバード装置75-0238パッシブスカベンジング麻酔マスク付き移動式麻酔システム
ハーバード装置59-8255ラット麻酔マスク
鈍いマイクロ鉗子世界精密機器501217 ドレッシング鉗子、12.5 cm、ストレート、鋸歯状
C57Bl/6 マウスCharles RiverStrain Code 027 野生型、6-8週間、18-28g
デジタル体重計フィッシャーサイエンティフィックS72422
FlexiVent システムScireqNC2926059強制振動技術ベースの小型げっ歯類用人工呼吸器 
インスリン注射器、1 mLフィッシャーサイエンティフィ14-841-33
イソフルラン、USPピラマルクリティカルケアNDC 66794-017-25
手術顕微鏡または手術用ルーペAmScopeSM-3BZ-80S3.5x - 90x 実体顕微鏡
Perfadex solutionXvivo19811, 19850
ペトリ皿ッシャーサイエンティフィック FB0875714
滅菌綿棒ピューリタン25-806 1WC
滅菌ガーゼスポンジフィッシャーサイエンティフィック22-037-902
手術用ハサミワールド精密機器1962Cメッツェンバウムハサミ
ック フィ

参考文献

  1. Erdman, J., et al. Lung transplant outcomes in adults in the United States: Retrospective cohort study using real-world evidence from the SRTR. Transplantation. 106 (6), 1233-1242 (2022).
  2. Valapour, M., Lehr, C. OPTN/SRTR 2022 Annual Data Report: Lung. , Available at: https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2022/Lung.aspx (2022).
  3. Benvenuto, L., Arcasoy, S. The new allocation era and policy. J Thorac Dis. 13 (11), 6504-6513 (2021).
  4. Ali, A., et al. Static lung storage at 10 °C maintains mitochondrial health and preserves donor organ function. Sci Transl Med. 13 (611), eabf7601(2021).
  5. Wang, L., et al. The effect of ischemic time and temperature on lung preservation in a simple ex vivo rabbit model used for functional assessment. J Thorac Cardiovasc Surg. 98 (3), 333-342 (1989).
  6. Date, H., et al. In a canine model, lung preservation at 10 °C is superior to that at 4 °C: A comparison of two preservation temperatures on lung function and on adenosine triphosphate level measured by phosphorus 31-nuclear magnetic resonance. J Thorac Cardiovasc Surg. 103 (4), 773-780 (1992).
  7. Hoetzenecker, K., et al. The advent of semi-elective lung transplantation-prolonged static cold storage at 10 °C. Transpl Int. 37 (1), 12310(2024).
  8. Abdelnour-Berchtold, E., et al. Evaluation of 10 °C as the optimal storage temperature for aspiration-injured donor lungs in a large animal transplant model. J Heart Lung Transplant. 41 (12), 1679-1688 (2022).
  9. Moreno Garijo, J., Roscoe, A. Ex vivo lung perfusion. Curr Opin Anaesthesiol. 33 (1), 50-54 (2020).
  10. Rajab, T., Keshavjee, S. Ex vivo lung perfusion. Artif Organs. 44 (1), 12-15 (2020).
  11. Oostveen, E., et al. The forced oscillation technique in clinical practice: Methodology, recommendations, and future developments. Eur Respir J. 22 (6), 1026-1041 (2003).
  12. Gibney, B., et al. Structural and functional evidence for the scaffolding effect of alveolar blood vessels. Exp Lung Res. 43 (9-10), 337-346 (2017).
  13. Rajab, T. Techniques for lung transplantation in the rat. Exp Lung Res. 45 (9-10), 267-274 (2019).
  14. Evaluation of ventilation at 10 °C as the optimal storage condition for donor lungs in a murine transplant model. Hill, M., et al. The International Society for Heart and Lung Transplantation 44th Annual Meeting and Scientific Sessions, Prague, Czech Republic, , (2024).
  15. Hess, D. Respiratory mechanics in mechanically ventilated patients. Respir Care. 59 (11), 1773-1794 (2014).
  16. Henderson, W., et al. Fifty years of research in ARDS: Respiratory mechanics in acute respiratory distress syndrome. Am J Respir Crit Care Med. 196 (7), 822-833 (2017).
  17. Mauri, T., et al. Respiratory mechanics to understand ARDS and guide mechanical ventilation. Physiol Meas. 38 (12), R280-R303 (2017).
  18. Bersten, A., et al. Respiratory mechanics and surfactant in the acute respiratory distress syndrome. Clin Exp Pharmacol Physiol. 25 (11), 955-963 (1998).
  19. Grinnan, D., Truwit, J. Clinical review: Respiratory mechanics in spontaneous and assisted ventilation. Crit Care. 9 (5), 472-484 (2005).

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