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方法論記事

レサズリンマイクロタイターとチェッカーボードアッセイを用いた結 核菌 における薬物感受性と薬物相互作用の検出

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DOI：

10.3791/67672

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2025年10月24日

 ,  , 
1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2University of Madras, 3Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

この記事について

サマリー

ここでは、結 核菌の薬物感受性と相互作用プロファイルを評価するためのレサズリンマイクロタイターアッセイ(REMA)とその市松模様のバリエーションを視覚化および標準化するためのプロトコルを提示します。この方法は、治療計画で使用される薬物の組み合わせを最適化し、多剤耐性結核と闘うための洞察を in vitro で提供します。

要約

多剤耐性結核 (MDR-TB) の出現により、効果的な治療を導くために迅速かつ正確な薬剤感受性試験 (DST) 方法が必要です。この研究では、レサズリンマイクロタイターアッセイ (REMA) とチェッカーボードアッセイを組み合わせて、最小阻害濃度 (MIC) を決定し、 結核菌 に対する抗結核薬の薬物間相互作用を評価する方法論を紹介します。REMAは、96ウェルフォーマットに適応し、代謝活性結 核菌 によるレサズリン色素の還元を薬物感受性の視覚的指標として活用します。さまざまな濃度の抗結核薬を結 核菌 分離株に対してテストし、色の変化を観察してMICを決定します。その後、チェッカーボードアッセイを使用して、薬物の組み合わせ間の潜在的な相乗効果、相加効果、または拮抗効果を評価します。このシンプルで安価な方法は 7 日以内に結果が得られ、従来の DST 方法に比べて大きな利点をもたらします。この方法は、 結核菌 分離株の DST に関する貴重な洞察を提供し、MDR-TB に対する治療結果を改善するための有望な薬剤の組み合わせの特定を容易にします。

概要

結核菌によって引き起こされる結核 (TB) は、依然として世界的な健康上の大きな課題であり、薬剤耐性株の出現によって悪化しています。世界保健機関 (WHO) によると、2023 年には推定 1,060 万人の新規結核患者と 130 万人の死亡があり、より効果的な診断および治療戦略の差し迫った必要性が浮き彫りになっています1。多剤耐性結核 (MDR-TB) および広範囲薬剤耐性結核 (XDR-TB) は、現在の治療レジメンの複雑さ、毒性、および長期にわたる期間により、疾患管理に大きな課題をもたらします 2,3。

結核菌の特異な生化学的経路を標的とするベダキリンやデラマニドなどの新規抗結核薬の最近の導入は、結核管理における画期的な進歩を表しています 4,5。これらの薬剤は、WHOが承認した長期および短期のMDR-TBレジメンの一部として、主にフルオロキノロン耐性およびリファンピシン耐性結核症例での使用が承認されています6,7。ただし、最適な薬物の組み合わせと投与計画の決定、特にこれらの薬剤が確立された治療法と組み合わせて使用される場合、依然として調査の重要な分野です 8,9。薬剤感受性試験 (DST) の現在の方法は、信頼性はありますが、多くの場合、時間とリソースを大量に消費し、臨床または研究環境で複雑な薬物の組み合わせを評価するには実用的ではありません10。これは、結核菌における薬効と相互作用プロファイルの両方を評価できる、シンプルでスケーラブルな表現型アッセイの必要性を強調しています。

このような表現型アプローチの中で、レサズリン マイクロタイター アッセイ (REMA) は、薬物感受性を評価するための広く受け入れられている従来の方法として浮上しています。このアッセイは、代謝活性細菌による青色のレサズリン色素のピンク色のレソルフィンへの還元に基づいており、細胞生存率の視覚的な指標として機能します。200211 年に Palomino らによって普及しましたが、細菌の増殖を評価するためにレサズリンを使用する原理は、Pital et al.12 の研究にまでさかのぼります。過去20年間にわたり、REMA法は広範囲に検証され、マイコバクテリア研究および診断検査の標準操作手順に組み込まれてきました13,14,15。

REMAを補完するチェッカーボードアッセイは、Caleffi-Ferracioliらによって導入され、同じレサズリンベースの読み出し16を使用して微量希釈形式で2つの薬物相互作用研究を可能にすることにより、REMAの有用性を拡張します。この方法は原則的には有望ですが、日常的な診断アッセイではなく、初期の前臨床評価中に潜在的な相乗的または拮抗的な薬物の組み合わせをスクリーニングするのに役立つ研究ツールであることに変わりはありません。

この原稿は、REMAまたはその市松模様の変種を新しい方法として提示していません。むしろ、この研究の目標は、以前の研究で説明され、うまく適用されている、MIC 測定および薬物相互作用試験のための有用で検証済みの方法論を視覚的に表現することです。接種物の調製、薬物滴定、プレートレイアウト、MIC解釈、市松模様相互作用分析に関する詳細なガイダンスを含むステップバイステップのプロトコルを提供します。この原稿は、結核薬開発および実験薬理学におけるREMAおよびチェッカーボードアッセイのより広範でより一貫した使用をサポートすることを目的としています。

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プロトコル

注:実験例で使用された化学物質と材料は、 材料表ファイルで入手できます。

1. 7H9-S培地の調製

  1. 100 mLの7H9-S培地の場合、0.47 gの7H9粉末と0.1 gのカシトンを秤量し、90 mLの蒸留水に溶解します。完全に溶けるまでかき混ぜます。
  2. 250 mLフラスコで、オートクレーブを121°Cで15分間滅菌します。
  3. オートクレーブ滅菌して冷却したら、10 mLのオレイン酸アルブミンデキストロースカタラーゼ(OADC)サプリメントと0.5 mLのグリセロールを加えます。
  4. 37°Cで一晩インキュベートして、無菌性を確認します。
    注:調製した7H9-S培地の無菌性は、37°Cで一晩インキュベートすることによって検証されます。 培地は翌日も透明なままで、濁りは観察されません。
  5. 7H9-S 培地は、直射日光を避けて 4 °C で保管してください。

2. 結核菌接種物の製剤

  1. Lowenstein Jensen(LJ)固体培地で培養した 結核菌 培養物からの接種物の調製
    1. 無菌接種ループを使用して、増殖したての(21〜28日齢)LJ培地から結 核菌 培養物のフルループを収集します。
      注:古いコロニーを乱す可能性のある培地の奥深くにこすり落としすぎないように注意してください。
    2. 収集した細菌を、滅菌ガラスビーズと2.5 mLの7H9-Sブロスが入った滅菌ビジューボトルに入れます。ガラスビーズがボルテックス中の塊の機械的破壊に役立つことを確認してください。
      注:信頼性の高い感受性試験結果を確保するには、21〜28日の新鮮な培養が不可欠です。古い文化は一貫性のない結果につながる可能性があるため、使用は避けてください。
    3. ビジューボトルを固定し、少なくとも1分間激しくボルテックスします。細菌の塊を分解するために連続的な混合を確保し、比較的濁った懸濁液をもたらします。目標は、培地内の細菌の均一な分布です。
    4. 培養懸濁液を新鮮なビジューボトルに移し、15分間放置します。このステップにより、より大きな細菌の塊が底に定着します。
    5. McFarland 1.0 Standardを基準として使用し、培養懸濁液の濁度を確認し、所望の濁度に達するまで7H9-Sブロスで調整します。
      注:マクファーランド標準(通常1.0)は、約1.97 × 106 CFU / mLに相当する濁度の基準として使用されます17。標準物質は、0.1 mLの1%塩化バリウムと9.9 1 mLの1%硫酸を組み合わせて調製され、その結果、濁度を提供する硫酸バリウムの微細な沈殿物が得られます。細菌懸濁液は、黒い線の付いた白い背景に両方のチューブを保持することにより、マクファーランド標準と視覚的に比較されます。細菌懸濁液の濁度は、規格に合わせて調整されます。
  2. 7H9液体培地で増殖した 結核菌 培養物からの接種物の調製
    1. 滅菌ピペットを使用して、2.5 mLの 結核菌 培養物(2〜3週間齢)をガラスビーズの入った新鮮なビジューボトルに移します。
    2. 混合物を少なくとも1分間渦にして、均一な懸濁液を確保します。ボルテックス作用は、塊を壊すのに役立ちます。
    3. 2.5 mLの培養懸濁液を新しいビジューボトルに移し、15分間放置して、塊が底に沈殿するようにします。
    4. 濁度をマクファーランド 1.0 標準と比較して、7H9-S ブロスを使用して調整して、必要な濃度を達成します。
  3. 接種物の希釈
    1. 1:10希釈液を調製する:接種物を希釈するには、滅菌容器内の9 mLの7H9-Sブロスに1 mLの細菌懸濁液を加えます(これにより、約1.97 × 105 CFU / mLが得られます)。

3. 抗生物質の調製と保管

  1. ストックおよび作業溶液の調製: 表1に要約されているように、サンプル実験で使用した薬物を、そのストックおよび作業溶液の調製方法とともに調製します。
    1. イソニアジド(INHまたはI):イソニアジドの1 mg / mLストック溶液を調製するには、2 mgのイソニアジド粉末を2.0 mLの蒸留水に溶解します。0.22 μmのシリンジフィルターを使用して溶液を滅菌します。
    2. モキシフロキサシン(MOXまたはM):モキシフロキサシンの1 mg / mLストック溶液を調製するには、2 mgのモキシフロキサシン粉末を2.0 mLの蒸留水に溶解します。0.22 μmのシリンジフィルターを使用して溶液を滅菌します。
    3. ベダキリン (BDQ または J): ベダキリンは水に溶けにくいです。1 mg/mLのストック溶液を調製するには、2 mgのベダキリン粉末を2.0 mLのDMSOに溶解します。0.22 μmのシリンジフィルターを使用して溶液を滅菌します。
    4. デラマニド (DEL または D): ベダキリンと同様に、デラマニドは水溶性が低くなります。1 mg/mLのストック溶液を調製するには、2 mgのデラマニド粉末を2.0 mLのDMSOに溶解します。0.22 μmのシリンジフィルターを使用して溶液を滅菌します。
  2. 保管:各薬物原液100 μLを滅菌クライオバイアルにアリコートし、-20°Cで最大3か月間保存します。解凍したら、残った溶液を捨てます。再冷凍しないでください。

4. レサズリン溶液の調製と保管

  1. レサズリンを蒸留水中の最終濃度0.01%または0.02%まで溶解します。0.2 μmフィルターで溶液をろ過して滅菌します。
  2. 滅菌したレサズリン溶液は、劣化を防ぐために光から保護して、4°Cで最大1〜2週間保存します。

5. REMAプレートの調製

注:REMA 96ウェルマイクロタイタープレートのセットアップに関する視覚的なガイドについては、 図1 を参照してください。96ウェルプレートは、6回の2倍希釈で各薬物の薬物アッセイを2回実行するのに十分なスペースを提供します。

  1. 7H9-Sブロスを追加する:マルチチャンネルピペットを使用して、100 μLの7H9-Sブロスを列2〜11、行B-Gに加えます。すべての井戸に均等に分布していることを確認します。
  2. 薬物溶液の追加:100 μLの作業INH溶液をウェルB2およびB6に加えます。同様に、MOX、DEL、およびBDQ作業溶液をそれぞれのウェル(B3およびB7、B4およびB8、B5およびB9)に追加します。
  3. 薬物濃度を希釈する:マルチチャンネルピペットを使用して、行BからG(2〜9列目)まで2倍に連続希釈し、行Gで混合した後、最後の100 μLを確実に廃棄します。
  4. 増殖制御ウェル:増殖制御のためにウェルB10およびC10に100 μLの7H9-Sブロスを加えます。
  5. ネガティブコントロールと無菌コントロール:ウェルB11とC11に200 μLの7H9-Sブロスを加えて、ネガティブコントロールと無菌コントロールとして使用します。
  6. 蒸発の防止:インキュベーション中の蒸発を最小限に抑えるために、すべての外側ウェルに200 μLの滅菌蒸留水を加えます。
  7. プレートを接種する:ネガティブコントロールウェルを除き、1:10の希釈培養懸濁液100 μLを各ウェルに接種します。すべてのウェルで均一な接種を確保します。
  8. 密封してインキュベートする:プレートをビニール袋に密封して無菌性を維持し、37°Cで7日間インキュベートします。

6. REMAチェッカーボード滴定アッセイ

注:薬物の組み合わせ(BDQおよびDELなど)のREMAチェッカーボード滴定アッセイテンプレートの視覚的ガイドについては、 図2A、 B を参照してください。

  1. 薬物を垂直方向と水平方向に希釈する: 最初の薬物(BDQ)を垂直方向(行B-H)に希釈し、2番目の薬物(DEL)を水平方向(2〜8列目)に希釈して、さまざまな2剤の組み合わせを生成します。
    注:水平に希釈された薬物用に、滅菌バイアル(4 μg/mL〜0.06 μg/mL)で連続希釈した作業溶液を調製します。
  2. 垂直希釈用のBDQ作業溶液の追加:100 μLの作業BDQ溶液をウェルB2およびB8に加えます。
  3. 7H9-S ブロスを追加する: マルチチャンネルピペットを使用して、50 μL の 7H9-S ブロスをカラム C2-H8 に加えます。すべての井戸に均等に分布していることを確認します。
  4. 薬物濃度を希釈する:マルチチャンネルピペットを使用して、行B-H(2〜8列目)から2倍に希釈し、行Hで混合した後、最後の50 μLを確実に廃棄します。
  5. 水平希釈用のDEL作業溶液の追加:4 μg/mLから0.06 μg/mLまでの薬物の連続希釈作業溶液を対応するウェルに加えます。
  6. 成長制御ウェル:成長制御のためにウェルB9およびC9に100 μLの7H9-Sブロスを追加します。
  7. ネガティブコントロールと無菌コントロール:ウェルB10およびC10に200 μLの7H9-Sブロスを加えて、ネガティブコントロールと無菌コントロールとして使用します。
  8. プレートを接種する:ネガティブコントロールウェルを除き、1:10の希釈培養懸濁液100 μLを各ウェルに接種します。すべてのウェルで均一な接種を確保します。
  9. 密封してインキュベートする:プレートをビニール袋に密封して無菌性を維持し、37°Cで7日間インキュベートします。

7. インキュベーションと結果の解釈

  1. レサズリン染色:7日間のインキュベーション後、各ウェルに30 μLのレサズリン(0.01%-0.02%)を加えます。プレートを密封し、発色のために一晩インキュベートします。
  2. 色の変化を解釈します。
    1. 一貫した白色光または昼光バランスのとれた照明の下で井戸を目視で調べます。
      注:成長コントロール(薬物なし)は青からピンクに変わり、活発な細菌代謝を示します。青色は成長の完全な阻害を示します。ピンクは活発な成長を示し、紫(混合色合い)は部分的な抑制を表します。
    2. 正確な解釈のために、色の強度をネガティブコントロール(培地のみ)とポジティブコントロール(薬物なしの細菌増殖)の両方と比較します。観察者のバイアスを最小限に抑えるには、二重の独立した読み取り値またはプレート写真を使用します。
      注意: 視覚的な判断は周囲の照明条件によって異なる可能性があるため、一貫した照明が不可欠です。
  3. 最小阻害濃度(MIC)
    1. MIC は、ウェルが完全に青いままであり、代謝活性の ≥99% 阻害を示す最低濃度の薬物として定義します。部分的または完全な成長を示す紫またはピンク色を示す井戸を考えてみましょう。
      注:REMAによるMIC測定は、MICが薬物フリーコントロールと比較して接種物の≥99%を阻害する最低濃度と見なされる古典的な比率法の原則に近似しています。REMA は CFU カウントを使用しませんが、視覚的エンドポイントは、この比率ベースのしきい値の表現型相関を表します。この解釈は、以前に確立された比色プロトコル11,14と一致しています。

8. フラクショナル阻害濃度(FIC)指数の計算

注:フラクショナル阻害濃度(FIC)指数は、2つの薬物間の相互作用(相乗効果、拮抗作用、または無関心)を決定するのに役立ちます。チェッカーボードアッセイから得られたMIC値に基づいて計算されます。

  1. 各薬物単独のMICを特定する:REMAアッセイから、個別に使用した場合の各薬物のMICを決定します。
  2. 組み合わせた各薬物のMICを特定する:チェッカーボード滴定アッセイから、2番目の薬物と組み合わせて使用した場合の各薬物のMICを特定します。
  3. 各薬剤のFICを計算します。
    注:FICおよびFICインデックスの計算に使用される式については、 表2 を参照してください。 表3は 、REMAアッセイに基づく統合MICを示しています。代表的な MIC および FIC インデックス値を 表 4 に示します。
    1. FIC インデックスを次のように解釈します。
      FIC ≤ 0.5: 相乗効果を示す - 薬物が連携して、いずれかの薬物単独よりも効果的に成長を阻害します。
      FIC>0.5から<4.0:加法性を示します-複合効果は個々の効果の合計に等しくなります。
      FIC ≥ 4.0:拮抗作用を示します-薬物は互いの活動を妨げます。
  4. 例: H37Rv の BDQ と DEL の FIC インデックスを計算する
    1. H37Rv の BDQ の MIC を決定します (例: 0.125 μg/mL)。DELと組み合わせて、BDQのMICを0.03μg/mLとして記録します。
    2. H37Rv の DEL の MIC を決定します (例: 0.063 μg/mL)。BDQと組み合わせて、DELのMICを0.125μg/mLとして記録します。
    3. BDQ の FIC を計算します。
      FIC(BDQ) = BDQの組み合わせのMIC / BDQ単体のMIC = 0.03 / 0.125 = 0.24
    4. DELのFICを計算:FIC(DEL) = DELの組み合わせのMIC / DEL単独のMIC = 0.125 / 0.063 = 1.98
    5. 両方のFICを加算してFICインデックスを取得します。FICインデックス= FIC(BDQ)+ FIC(DEL)= 0.24 + 1.98 = 2.26
    6. 結果を解釈します。
      注:FIC指数2.26は、相加相互作用範囲(>0.5〜<4.0)内に収まり、BDQとDELの組み合わせが結核菌の増殖阻害に相加的な効果があることを示しています。

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結果

REMAアッセイによる抗結核薬のMICの測定
ベダキリン、デラマニド、モキシフロキサシン、およびイソニアジドの活性は、薬剤感受性 H37RV および結 核菌の薬剤耐性臨床分離株に対する REMA を使用して評価されました。ベダキリン、デラマニド、およびイソニアジドは(1 μg/mL〜0.03 μg/mL)の濃度範囲で使用され、モキシフロキサシンは(2 μg/mL〜0.06 μg/mL)の範囲で使用されました。次に、 結核菌 およびH37Rvの薬剤耐性臨床分離株の細菌懸濁液を接種し、さまざまな薬物濃度の存在下で7日間インキュベートした。

細菌増殖の生存率は濃度依存的に著しく阻害され、薬剤感受性H37RVおよび結 核菌 の薬剤耐性臨床分離株に対するベダキリンの濃度範囲は0.25〜0.125 μg/mL、デラマニドの濃度は0.063 μg/mL、モキシフロキサシンの濃度は0.063 μg/mLであった(表3).ベダキリン、デラマニド、およびモキシフロキサシンは、...

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ディスカッション

薬剤耐性結核 (DR-TB) によってもたらされる世界的な脅威は、差し迫った問題となっています 1,19。このため、特に二次治療薬や新しい抗結核薬について、薬剤感受性試験(DST)の改良された迅速な方法の開発が緊急に必要とされています。このような方法は、治療戦略を強化し、抗結核薬を効果的に管理し、疾患の進行とさらなる耐性のリスクを軽減するために不可欠です20。薬物感受性と相互作用プロファイルの両方を評価する方法は、この文脈で大きな利点をもたらし、治療結果を改善し、より効果的な結核制御戦略をサポートします。

酸化還元感受性色素であるレサズリンは、代謝活性の指標として細菌生存率アッセイで広く使用されています21。レサズリンマイクロタイターアッセイ(REMA)とその市松模様のバリエーションは、個々の抗結核薬とそ...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
キャップ付き250mL角型ボトルショット・デュラン218203655培地の準備
7H9スープベクトン・ディキンソン271310結核菌用増殖培地(室温装置)
蓋付き96ウェルプレートコーニング359696ウェル透明平底ポリスチレンTC処理マイクロプレート、個別包装、蓋付き、滅菌(室温)
ART-Tips(1000 &L)ターソンズ528106疎水性ポリエチレンフィルター ポリプロピレンラックフィルターチップ-滅菌(室温)
ART-Tips(200μL)ターソンズ528104疎水性ポリエチレンフィルター ポリプロピレンラックフィルターチップ-滅菌(室温)
塩化バリウム二水和物メルク217565マクファーランド標準調製(室温)
ベダキリン (BDQ)ヤンセンとヤンセンヤンセンとヤンセンからの贈り物抗結核薬 (4 >C)
カシトーンベクトン・ディキンソン225930細菌培養用サプリメント(室温)
デラマニド (DEL)大塚製薬大塚製薬からの寄贈抗結核薬 (4 >C)
ジメチルスルホキシドシグマ・アルドリッチ67-68-5ドラッグストック調製(室温装置)
フィルター 0.2 &mミリポールSLGVR33RS0.22 &ミュー;m PVDF、使い捨て、滅菌シリンジフィルター(室温)
グリセロールメルク356350培地への添加(室温装置)
接種ループシグマ・アルドリッチI8263培養懸濁液調製用(室温装置)
イソニアジド (INH)シグマ・アルドリッチI3377-5G抗結核薬 (4 >C)
LJミディアムスラントBDマイコバクトセル221414結核菌の増殖培地(4°C;C)
マッカートニー ビジュー ナローマウスボトル、14 mLスーパーテック12.124.0014培養懸濁液調製用(室温装置)
マッカートニー ビジュー ナローマウスボトル、7 mLスーパーテック12.124.0007培養懸濁液調製用(室温装置)
マイクロピペット (1000 &L)ギルソンF144059M精密なリキッドハンドリング(室温装置)
マイクロピペット (200 &L)ギルソンFA10005M精密なリキッドハンドリング(室温装置)
モキシフロキサシン(MOX)シグマ・アルドリッチSML1581-50MG抗結核薬 (4 >C)
マルチチャンネルピペット(20–200 & ムー;L)VWRの849070024ウェルをまたいで同時にピペッティングする場合
OADCのベクトン・ディキンソン211886細菌培養用サプリメント(4°C;C)
ピペットフィラーメルクZ333980精密なリキッドハンドリング(室温装置)
レサズリンナトリウム塩シグマ・アルドリッチ62758-13-8REMAアッセイ用酸化還元インジケーター(室温装置)
血清ピペット、10 mLコーニングCLS4100滅菌ポリスチレン製使い捨てピペットを使用しました(室温装置)
固体ガラスビーズ、直径6mmシグマ・アルドリッチZ265950培養懸濁液調製用(室温装置)
硫酸95–97%メルク100731マクファーランド標準調製(室温)
フィルター用シリンジディスポバン100032シリンジフィルター用
ボルテックスミキサーレミCM-101プラス培養懸濁液調製用
ジッパートップポリ袋シグマ・アルドリッチZ162949

参考文献

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