ここでは、マウスの耳に Mycobacterium avium の低用量皮内接種を実施して、曝露様条件を反映するためのプロトコルを紹介します。
この記事について
サマリー
要約
自然界の非結核性抗酸菌(NTM)への曝露や、その病理がゆっくりと複製する生物に基づく感染症とは対照的に、マウスモデルにおけるエアロゾル感染は、肺における細菌増殖の増殖亢進を引き起こす可能性がある。慢性エアロゾル感染症や全身感染症は、抗マイコバクテリア薬で治療することができ、これも以前の曝露を反映している可能性がありますが、これらの手順は時間がかかり、自然曝露の代表性は低いです。このプロトコルの目標は、NTM曝露様条件の低侵襲性マウスモデルを開発することです。ここでは、 Mycobacterium avium (M. avium)を使用して、前臨床マウスに耳組織を介して皮内チャレンジを行い、曝露を模倣し、明らかな病気なしに細菌に対する免疫応答を可能にする方法について説明します。この記事では、皮内耳内注射法について説明し、持続性および封じ込められたマイコバクテリア感染の存在を確認することで、この in vivo モデルにおける免疫応答を調査するさらなる機会を提供します。
概要
非結核性抗酸菌(NTM)は、治療が困難なことが多い病原性細菌のサブセットを含む種のリストを拡大しています1,2。NTMは、土壌、水、水エアロゾルなどの環境源に含まれています3,4,5。NTM感染の増加を示唆する傾向が報告されているにもかかわらず、全体としては、米国全体で20未満の州で日常的に報告されています6,7。嚢胞性線維症の人や免疫抑制剤を服用している人など、特定の併存疾患を持つ人は、病原性NTM種2に感染するリスクが高くなります。しかし、健康な人は、環境源を通じてNTMに繰り返し継続的に曝露され、強烈な感染症や慢性的な感染症を引き起こすことはないと推定されます。ワクチン接種8、他のマイコバクテリアへの曝露後の転帰、および診断検査9において、NTM曝露がマイコバクテリア抗原に対する全体的な免疫応答を「前処理」する可能性があるという証拠がいくつかありますが、これまで、この種の曝露の前臨床モデリングは困難でした。
慢性肺感染症10および病原体特異的ワクチンの有効性研究に活用される治療法は、比較的無害な環境曝露を表しているわけではなく、おそらく異なる結果として生じる免疫応答を表しているわけではない。例えば、慢性感染症は、重篤な損傷を受けた組織や播種性疾患を誘発する可能性がある10。最近では、Henao-Tamayo研究室11のマウスモデルが飲料水を介してNTMに曝露するなど、この研究のギャップを埋める機運が高まっており、この曝露に対する免疫応答がさらに詳細に調査されました。潜伏性結核(TB)は、マイコバクテリア感染症の別の病態であり、前臨床動物でモデル化することが困難でした。Kaufmann研究室は、C57BL/612およびNOS2-/-13マウスにおける結核菌による皮内耳感染症の先駆者であり、潜在性結核感染、再活性化を模倣し、低酸素性肉芽腫のメカニズムを特徴付けました。Nemethらは、封じ込められた皮内耳モデルを活用して、結核菌への以前の曝露を模倣し、明確な免疫応答を特徴付けて、これがその後のチャレンジ結果にどのように影響するかを決定しました14。皮内耳モデルは、結核菌H37Rv株とErdman株の104コロニー形成ユニット(CFU)を使用して成功裏に報告されていますが、現在までNTM分離株を使用した試験は行われていません。
この方法の全体的な目標は、他のチャレンジ経路によって引き起こされる疾患を制限する再現性のあるNTM耳チャレンジモデルを確立することであり、これは曝露に対する免疫応答に関してさらに研究することができます。感受性の高いC57BL/6マウスを飲料水中の高用量のM.アビウムに曝露すると、曝露よりも感染様状態が大きくなります11。したがって、この技術を開発する理論的根拠には、結核菌を耳真皮へのチャレンジ生物として使用し、比較的高いチャレンジ用量12,13,14を使用した以前の成功が含まれます。ここでは、モデルが以前に報告された細菌濃度の半分のM.avium分離株にうまく適応できるかどうかを評価することを目指しました12,13,14(102 CFU)。感染ではなくNTM曝露の新しいモデルを進めることで、この健康への影響や将来の感染/ワクチン接種のダイナミクスに関する未解決の生物学的問題に対処するのに役立つと期待しています。
プロトコル
雌のC57BL/6は、生後6-7週齢で研究モデル供給研究所から購入しました。マウスは、病原体のない条件下でシアトル小児研究所(SCRI)のバイオセーフティレベル2(BSL-2)動物施設に収容され、SCRI動物管理委員会(IACUC)によって承認された実験プロトコルに従って取り扱われました。すべての方法は、動物福祉に関する関連するガイドラインと規制に従って実施されました。この研究所は、USDA証明書#91-R-0061およびPHS保証 #A4337-01に基づいて運営されています。本試験で使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。
1. 接種用細菌ストックの調製
- 細菌の働きに役立つバイオセーフティキャビネットで、 Mycobacterium avium (ATCC 25291)のストックバイアルを-80°Cで保存し、室温で解凍します。
注: M. avium のストック濃度は、すべてのストック材料でのベストプラクティスとして、7H10寒天プレートに段階希釈をめっきし、コロニー形成単位(CFU)をカウントすることにより、事前に決定されます。 - 26 Gサイズの先端が鈍い針を使用して、1.0 mLシリンジに液体を10回以上上下に通すことでストックサンプルを再懸濁し、均一な懸濁液を作成します。
- 懸濁液の1:10希釈液を1:10直列に100μLでめっきし、 M. avium の濃度を確認します。プレートを37°Cで3週間インキュベートし、コロニーをカウントして、接種物の濃度が正確であることを確認します。
- M. aviumの濃度を好みの用量に調整するには、サンプルを滅菌PBSで希釈します。使用する準備ができるまで室温で保管してください。
注:この実験では、10μLの用量あたり102 CFUを使用しました。
2.動物の準備と麻酔
- 麻酔を施す前に、接種したマウスのケージをその上に置ける温熱パッドなどの暖かい表面を用意し、回復中の体温調節に努めます。
- ケタミン(100 mg / mL)とキシラジン(20 mg / mL)カクテルを腹腔内経路 で マウスに注射します。.
- 麻酔をかけたら、つま先をつまんで、マウスが処置操作に十分な麻酔をかけられていることを確認する。
- アイローションを左右に塗布します。
3.接種プラットフォームと材料の準備
- フォームボードを使用して、操作中にマウスが安定することを可能にする棚を作成します。
注意: 両面テープは、耳をプラットフォームに平らな向きで固定するのに役立ちます。接着剤は、耳組織の健康を維持するために強すぎてはいけません。 - 照明付きの虫眼鏡を配置して、プラットフォームを表示します。
- 滅菌済みのハミルトン注射器と作業中の M.アビウム 製剤を近くに集めます。
4.耳の真皮接種
- 耳が両面テープ上に配置できるように、マウスを棚の上の仰臥位に置きます。
- 耳をテープに平らにし、耳が動かないように優しく圧力をかけます。
注:アルコールワイプは、注射前に耳に使用して、感染後の皮膚共生による交差汚染や感染を制限するのに役立ちます。しかし、そのような感染は、アルコールワイプを使用しないパイロット研究では観察されていません。 - 100 CFUを含む10 μLの M. avium 調製物を滅菌ハミルトンシリンジに吸い上げます。
注:10 μLの容量を汲み上げる前に 、M. avium 懸濁液を渦巻き状にして、均質であることを確認します。 - 片手でプラットフォームを持ち、もう片方の手でハミルトンシリンジを持ち、針の斜角側が上を向いていることを確認します(図1)。
- ハミルトンシリンジを非常に軽い圧力で耳の真皮の下に配置します。.針が薄い耳の組織を完全に貫通しないようにしてください。
- 針が所定の位置に配置されたら、シリンジプランジャーをゆっくりとゆっくりと押し下げます。
- 投与中に耳の色を観察してください。
注:成功した投与は、泡のように、注射部位に不透明な隆起として表示されます。. - 投与量が完全に投与されたら、マウスの耳とテープに漏れの兆候がないか確認します。.
注:漏れが発生した場合は、推定損失線量を反対側の耳に投与できます。.少なくとも、動物は目標用量を下回る用量を与えられた可能性があるとマークし、記録する必要があります。 - 投与が成功したら、マウスを自宅のケージに戻して、麻酔から正常に目覚めるまで監視しながら、暖かい表面にさらされるようにします。
5. 細菌負荷評価
- 施設の動物管理および使用委員会が承認したプロトコルに従って動物を安楽死させます。
- ここでは、安楽死は犠牲ごとに最低2つの方法で完了します。この手順では、CO2 窒息と子宮頸部脱臼の 2 つの方法が選択されます。
- まず、チューブを伸ばしてCO2 ガスをマウスのホームケージに分注し、マウスからの動きの兆候がなくなるまでガスを投与します。ガスが漏れないようにケージの使用に注意してください。
- 次に、手動操作で頸椎を脱臼します。
- M. aviumに挑戦させた動物から、ばく露後4週間(28日、先行研究12と一致する)の耳を解剖します。滅菌ツールを使用して2匹のマウスの耳を解剖します。CFUバッファー(PBS + 0.05%Tween80)を含む円錐管に耳を挿入し、組織ホモジナイザーを使用して均一な懸濁液が形成されるまで均質化します。また、無難な耳も加工され、コントロールとして機能します。
注:曝露後の任意の時点と関心のある臓器を使用できます。この実験では、肺、脾臓、ドレナーミングリンパ節、脳の臓器も採取しました。 - 100 μL のホモジネートを 700 μL の CFU バッファーに 700 μL の CFU バッファーを 1/8 倍希釈液として加えます。ブロック全体で繰り返して、最低5つの段階希釈が生成されます。50-100 μLのニートホモジネートまたは段階希釈液(ここでは希釈液0〜5を使用)を7H10寒天トライプレートに加え、Tスプレッダーを使用して均一に広げ、5% CO2 で37°Cで2〜3週間インキュベートします。
- コロニー形成単位(CFU)をカウントし、スプレッドシートソフトウェアで分析目的でlog10 に変換します。
結果
上記のプロトコルを使用して、真耳を感染経路または曝露経路として使用した再現性のあるNTMチャレンジモデルが確立できるかどうかを判断しました。耳は、チャレンジ後 28 日目に 2 匹の動物から採取し、均質化し、マイコバクテリア選択性 7H10 培地に記載されているようにプレーティングしました。皮内チャレンジを受けた耳では 、M. avium は28日間持続し、チャレンジを受けていない耳では M. avium が存在しないことが観察されました(図2)。
感染後28日までに問題のない耳への播種は観察されなかったが、この真耳モデルを潜伏結核モデリングに使用している他の人々は、他の遠位臓器部位への播種を観察している14。私たちは、チャレンジの用量を減らし、 M. avium 分離物を使用すると、慢性感染 に対する曝露をより よく反映する可能性のある後の時点への播種を減らす可能性があるという仮説を立てました。したがって、安楽死は、感染後28日、56日、90日、および132日でn=5 M. avium チャレンジマウスのコホートに対して行われました。次の臓器は、耳組織について記載されたのと同じプロトコルで均質化されました:肺、脾臓、ドレナージリンパ節(DLN)、および脳。この挑戦のルートは、時間の経過とともに散発的な播種をもたらし、感染後56日または90日で検査された臓器で可算CFUを示した動物の半数未満でした(表1)。チャレンジ後132日までに、すべてのマウスの脾臓に検出可能な M.アビウム がいました(評価された動物= 5/5)が、この時点までに他の臓器に最小限の細菌(DLNのn = 1/5)またはまったく(肺または脳のn = 0/5)細菌を保有していないように見えました（表1)。
図1:ベベル面を上にした針の向き。 針を挿入する前に、接種物を適切に投与するために、ベベル側が上を向いている必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:チャレンジ後28日での M.avium による耳組織のコロニー形成。 雌のC57BL/6マウスに、102 CFUの Mycobacterium aviumを耳に投与しました。挑戦された耳(+)は、28日後に挑戦されなかった耳(-)と比較され、示された1つの実験からn=2匹の個々の動物が示され、各動物は異なる色と記号で示されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 時間(日) | オルガンログ10 CFU | |||
| 肺 | 脾臓 | DLNの | 脳 | |
| 28 | 3.08、ND、ND、ND、ND | 2.81、ND、ND、ND、ND | ND、ND、ND、ND、ND | 0.78、0.90、ND、ND、ND |
| 56 | 2.30、ND、ND、ND、ND | 1.53、3.43、ND、ND、ND | 2.78、ND、ND、ND、ND | 1.20、ND、ND、ND、ND |
| 90 | ND、ND、ND、ND、ND | 0.60、3.35、3.26、ND、ND | ND、ND、ND、ND、ND | 0.60、ND、ND、ND、ND |
| 132 | ND、ND、ND、ND、ND | 4.03, 3.58, 3.58, 4.03, 3.69 | 2.41、ND、ND、ND、ND | ND、ND、ND、ND、ND |
| DLN = リンパ節の排出、ND = 検出されない | ||||
表1:チャレンジ後の経時的な耳からの M.アビウム の播種。 肺、脾臓、ドレナージリンパ節(DLN)、および脳は、チャレンジ後の時点ごとにn = 5匹のマウスから採取されました。均質化された組織をプレーティングし、細菌の増殖を評価しました。log10 として提示された臓器CFUは、細菌がカウントされ、検出されなかった(ND)濃度メッキされたどの濃度でもCFUが観察されなかった場合に値を変換しました。1つの実験を代表するタイムコースデータ。
ディスカッション
ここでは、封じ込められた皮内耳モデルでマウスにマイコバクテリアを再現性よく挑戦する方法を示しました。この手順を実行するときは、無菌予防措置に従い、針刺しによる怪我を避けることが重要です。この接種方法では、真皮の空間が的を絞られ、耳全体に穴が開かないように、適切なセットアップステーションと適切な照明を用意することが重要です。その場合、研究によっては、もう一方の耳で2回目の試みを行うことができます。同じマウス内の未処理の耳は、マウスごとのコントロールとしても使用できます。この方法は、機器や時間の必要性が最小限で研究者が利用できる必要があります。マウスと時間をトレーニングに充てることで、プロトコルの接種成功率を高めることができます。この技術の最も一般的なエラーは、シリンジで皮内腔に入らない (および耳から穿刺する) こと、またはシリンジを急激に押し下げすぎて、皮内腔からの針の送達または滑りが不安定になることです。適切な照明と倍率は、接種のための針の適切な位置決めに役立ちます。
私たちは、NTMの「曝露のような」条件に対する方法論を活用しています。 M. avium の大部分は耳またはDLNに含まれています。しかし、この方法論の限界は、チャレンジ後132日で評価されたすべての動物で全身臓器、すなわち脾臓への播種が観察されたことです。細菌接種の閾値があり、播種の量や頻度を減らすことができるかもしれませんが、これは滴定研究で達成できます。この手順は、研究課題に応じて、生物(例えば、他のNTM種)と送達される用量の両方を改変するのに適しています。
人間の行動(適切な飲料水処理の欠如、汚染、喫煙)、15 歳やその他の併存疾患による健康状態の悪化者の増加、適切な診断テストの欠如、気候変動16 がNTM感染率の上昇に関与している可能性があり、この傾向は近い将来増加する可能性があります。私たちは、飲料水11 による粘膜送達やマウスのNTMによる皮内封じ込め耳感染症などのモデルが、この曝露の増加がその後のワクチン接種とワクチンの有効性にどのような影響を与えるかを判断する機会を提供すると提案します。この封じ込め耳モデルの方法論を M. aviumに採用しましたが、他のNTM種にも曝露技術としてうまく使用できる可能性があることを提案します。
開示事項
著者は、利益相反がないことを宣言します。
謝辞
著者らは、この研究を通じて動物を卓越したケアをしてくれた献身的なビバリウムの職員に感謝の意を表します。また、著者らは、この研究で使用された M. avium 株を共有してくれたコロラド州立大学のHenao-Tamayo研究室にも感謝の意を表します。著者らは、シアトル子供研究所のアデレム研究所とウルダール研究所のメンバーが、オリジナルの方法論のトレーニングを提供してくれたことに感謝します。このプロジェクトは、契約番号75N93021C00029(RNCへ)、および助成金R01AI125160およびR01AI183642(RNCおよびSLBへ)に基づき、国立アレルギー感染症研究所、国立衛生研究所、保健社会福祉省からの連邦資金で全体または一部が資金提供されています。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.05% Tween80 | Sigma | P6224 | |
| 1mL シリンジ | Fisher | 15-823-434 | |
| 7H10 寒天三板 | Moltox | 21-40S234 | |
| 26G 鈍針 | Fisher | NC0981254 | |
| バイオセーフティキャビネット | Nuaire | NU-543-400 | |
| CO2 インキュベーター | Fisher Scientific | 15-103-0513 | |
| 面テープ | コッチ | 3136 | |
| ミルトン701Nマイクロリットルシリンジ | フィッシャー14-824-16 | ||
| ティッシュオムニチップ | フィッシャー15-340-102 | ||
| パッド | トサイエンティフィ | HTP-1500 | |
| スリン針 | フィッシャー | NC1551333 | |
| ケタミン | パターソン獣医 | 07-890-8598 | |
| 照明付き虫 | Brightech | B07MMZ27QK | |
| PBS | ThermoFisher | 10010072 | |
| ティッシュホモジナイザー | Omni | TH115 | |
| ティッシュホモジナイザースタンド | Omni | S1000 | |
| キシラジン | パターソン獣医 | 07-808-1947 |
参考文献
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