マウス肺への液体送達の方法論の改善:消費者向け耳鏡を使用した挿管

サマリー

このプロトコルは、マウスを最適に配置し、カメラベースの耳鏡を経経口的に挿入することで、声門の視覚化、組織の外傷を最小限に抑えた迅速な挿管、および肺への一貫した液体の送達を可能にする方法を示しています。

要約

潜在的な治療法を含む液体を肺に一貫して送達することは、肺疾患のモデリングと前臨床治療開発にとって重要です。しかし、現在のマウスの方法(舌引き法による中咽頭吸引など)では、ばらばらの送達が生じる可能性があります。ここでは、手頃な価格の携帯電話にリンクされた照明付き耳鏡を使用して、声門を視覚化し、気道への直接接種を可能にする方法について説明します。適切な照明とポジショニングエイドを備えた最適化されたステージング技術について詳しく説明します。また、20Gのフレキシブルカテーテルを使用して、光ファイバーライトの有無にかかわらず、挿管を確実に行う方法についても説明します。この技術は、肺内送達のばらつきを大幅に減らし、肺に到達する送達された液体の量を増加させます。ばらつきが減少するため、舌引き法による中咽頭点眼の代わりにこの方法を採用する際には、より小さな動物のコホートサイズを使用することができます。以下は、マウスの効果的、迅速、かつ一貫した挿管と肺への送達のための方法であり、気管内チューブの配置の堅牢な確認が含まれます。この改善された方法論により、一貫性のある安全な挿管と、肺への再現性のある効率的な送達が手の届くところにあります。

概要

世界的に、呼吸器疾患は5歳未満の子供の最大の死因であり、成人の罹患率と死亡率の主な原因です¹。2021年、SARS-CoV2感染は米国で3番目に多い死因でした²。マウスモデルは、喘息、肺炎、慢性気障疾患、肺線維症などの肺疾患の研究によく使用されます。これらのモデルのほとんどすべてで、液体剤を肺に送達する必要があります。これは、気管の直接カニューレ挿入(通常は外科的カットダウン技術を使用した直接視覚化)、鼻腔内送達、または確立された舌引き法による中咽頭吸引によって行うことができます^3,4,5。ただし、これらの手法にはすべて欠点があります。外科的カットダウン技術後の瘢痕組織形成は、肺への薬剤の反復投与を必要とする研究には不適切であり、後者の 2 つの技術は、さまざまな肺送達につながる可能性があります。さらに、舌引き法を使用すると、舌への組織の外傷が顕著になる可能性があり、送達効率は手順を実行する研究者に依存します(図1を参照)。

図1:ガイド付き挿管とIT点滴は、舌を引っ張る場合と比較して、肺への送達を改善し、変動を少なくします。 (A)3人の異なる研究者が、中咽頭(OP)投与の確立された方法である舌引きによって50μLの希薄インドインクを送達しました。また、2人の研究者が、前述のように挿管を使用して肺にインクを送達しました。(B)肺は分娩後1〜4時間で摘出され、2倍の倍率で撮影されました。写真の染色領域について、ImageJを使用して評価しました。(n = 6(挿管)または9(OP投与)、2〜3人の異なる研究者による2回または3回の独立した反復の結果、p<0.0001ウェルチのT検定)(C)肺投与の変動性も、平均からのパーセント偏差として計算されました。OP投与ははるかに変動性がありました。(p = 0.0317、ウェールズのT検定、GraphPad Prism 10.2.3 すべての統計とグラフ化)(C57BL/6J オスマウスとメスマウスを使用し、生後~10週齢でした。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

マウスの解剖学的構造は、挿管を困難で時間のかかるものにします。口は小さく、頬側組織は研究者の声門の視界を遮る可能性があります⁶。さらに、声帯は非常に小さく、舌の付け根の近くに横たわっているため、声帯を見るのが難しい場合があります。最後に、気管内チューブの適切な配置の確認は、小さな潮汐量が^ミラー7を曇らせるのに失敗することが多いため、困難です。これらの困難は、マウスを挿管するためのさまざまな革新的な技術を奨励しています。これらの改善された方法には、カテーテルを気管^8,9に前進させるための新生児喉頭鏡およびワイヤーの使用、カテーテル^10,11をガイドし硬くするための光ファイバー光源の使用、およびライブビデオフィード⁶の使用が含まれる。最近では、臨床耳鏡の使用が口腔気管挿管に役立っています¹²。他のものは、声門を視覚化し、マウスを挿管するためにトランスイルミネーションを採用している^7,13,14。ただし、これらの方法には多くの欠点があります。マウスの首に脱毛剤を使用し、動物が高温の光源に近接しているため、トランスイルミネーションは理想的とは言えないアプローチです。カテーテル内で針を使用したり、鋭利な器具を口に挿入したりすると、カテーテルを硬くする方法によっては、動物を過度のリスクにさらすことになります。最後に、配置を確認するために気管を切開すると、無菌性の必要性や瘢痕組織の蓄積など、重大な欠点があります。この時点まで、挿管による気管内注入は、広く採用するには難しすぎることが証明されており¹⁵、方法論開発の進歩は、多くの研究所によって孤立し、未使用のままでした¹⁵。さらなる研究では、分娩中の麻酔薬の選択に焦点を当てており、ケタミンがイソフルラン⁵よりも優れている可能性があることがわかっています。しかし、イソフルランは規制物質ではなく、手順の完了時に急速に消耗する魅力的な利点を示したため、この方法論の他の側面を最適化しながら、この形態の麻酔を使用しました^16,17。

この方法は、他の人が取り組もうとしてきた視覚化の課題を克服し、実験動物へのリスクを軽減し、気管内チューブを介して少量を気管内に注入するために必要な時間を短縮し、肺に到達する液体の量を増やし、気管内チューブの配置確認のための改善された方法を提供します。サスペンションスタンド、マグネット式のヘルピングハンド(ベースに固定された柔軟なアームのワニ口クリップ)、および明るい照明を使用することで、個々の研究者は効率的な気管内送達を行うことができます。WIFI接続を備えた「自宅」の耳鏡を使用すると、視覚化が容易になります。このデバイスは、市販の挿管器具よりも手頃な価格です。さらに、WIFI接続により、ポータブルデバイス(携帯電話など)で同時にビデオフィードを行うことができるため、トレーニングに適しています。挿管は、20 g x 1インチのフレキシブル(PTFE)カテーテル(針を抜いたもの)に通した光ファイバー光源、またはライトなしのカテーテルのいずれかを利用できます。深さは、挿管安全ウェッジ(カテーテルの円錐形ガード)の追加と、ビデオフィードでの深さ観察の2つの方法で制御されます。気管内チューブの配置は、従来のミラーフォグ法¹⁸よりも明確に潮汐量を視覚化するために、「バブル法」を使用して確認されます。これは、配置を確認するために呼吸切迫感¹⁰ を修正するために気管閉塞に頼るよりも、動物にとってストレスが少ないです。挿管の成功を確認するためにカテーテルに結合された延長チューブの併用(以下、バブル法と呼ぶ)は、Watanabe et.AL⁷、および消費者向けビデオ耳鏡を1回の手順で実現することで、挿管は肺への治療送達のための実用的な方法となり、舌引き法は明らかに改善されます( 図1を参照)。特に規制物質(ケタミンなど)や高価な機器を使用せずに、マウスの肺に非外科的液体を送達するための信頼性、一貫性、手頃な価格の方法を探している場合は、次の方法が理想的かもしれません。

プロトコル

これらの手順は、プロトコルに記載されている施設動物管理および使用委員会(IACUC)によってレビューおよび承認され、進行する前に獣医スタッフに相談することが不可欠です。私たちの機関のIACUCは、実験を開始する前にプロトコルを承認し、提出前にビデオコンテンツをレビューしました。テュレーン大学の比較医学科を通じて支援とトレーニングを受け、すべての実験動物に最高水準のケアを提供しました。

1. セットアップ

メモ: セットアップについては、 図 2 を参照してください。

図2:ガイド付き挿管に使用されるステーションは、図のように準備されています。 左から:分娩用ピペット、適切な気管内チューブの配置を確認するためのバブルチューブ、鉗子、へら、小児用鼻鏡(説明されていますが、この手順には必要ありません)、ヘルピングハンド、拡大ライト、ノーズコーン付きマウススタンド、光ファイバープローブ、麻酔導入チャンバー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. 挿管キットに付属の安全ウェッジをイソプロパノール準備パッドで清掃します。.清潔な安全ウェッジ(ビデオでは緑色)を20Gのフレキシブルカニューレにスライドさせ、付属の針を安全に廃棄します。
   注:使用されるげっ歯類の挿管キット(材料の表)には、挿管安全ウェッジが含まれています。これらは、20 G x 1インチのフレキシブルカテーテルにフィットする小さな円錐形のスリーブです。カテーテルがカリーナを損傷するのを防ぎます。
2. 携帯電話、市販の耳鏡、ノーズコーン付きのマウススタンド、細かく鋸歯状の曲がった鉗子、準備した気管内チューブ(1.1から)、光ファイバーライト(使用する場合)など、必要な他のツールを収集します。使用前に、これらすべてをイソプロパノール調製パッドで清掃してください。
3. 約20cmのフレキシブルチューブを取ります。U字型に曲げ、片方の端にルアーロック接続を追加し、ツイストタイで固定します。200〜300μLの滅菌ろ過水またはインドインクをチューブに加えます。以下、このアセンブリを「バブルチューブ」と呼びます。
4. サイズ0の編組シルク縫合糸を~13cm円で結んで縫合糸ループを作ります。このループをスタンドの上部に置き、縫合糸の両側が固定され、スタンドがきれいであることを確認します。マウススタンドを金属製の拡大ライトベースの上に置きます。マウスの口がある場所に助けの手を置きます。
   注:多くのベンダーは交換可能なスタンド(材料の表を参照)を製造しており、ラボ内で1つを安価に作成できます^4,7,14。サイズ0の編組絹縫合糸を使用して動物を吊り下げました。しかし、同じ目的での他の材料の使用については、^4,13が記載されている。
5. 麻酔誘導室にマウスを置きます。0.8 L / minおよび2%イソフルランで一定の流量O₂ を使用してください。動物に十分に麻酔をかけます(注を参照)鼻円錐の配置中に動物が目覚めないようにします。マウスの呼吸数を大幅に抑制しないでください。定期的な呼吸は、声帯の理解に役立ちます。
   注:マウスの呼吸数は正常である必要があります。この基準は、麻酔の適切な深さを確立するために使用されます。これは動物によって異なり、200呼吸/分を超える場合があります。そのため、呼吸数を数えたり、つま先をつまんだりすることは現実的ではなく、必要もありません。
   注意: この手順は、必要に応じて中止できます。ただし、動物は厳密に必要な時間を超えて誘導チャンバーに留まってはいけません。
6. 耳鏡を携帯電話に接続し、ビデオフィードが安定していることを確認します。
   注意:この手順中の研究者のイソフルラン曝露を最小限に抑えるために、この方法で複数の挿管またはトレーニングを行う場合は、化学呼吸器を使用してください。または、ヒュームフードで手順を実行します。

2. 動物のステージング

1. 最初の動物が眠ったらすぐに、誘導室から取り出し、首筋を伸ばし、上の歯を縫合糸の長さに置きます。マウスをスタンドに戻しながら縫合糸の位置を維持するために、動物に軽い張力をかけます。
   注:平均して、動物は誘導を含めて合計2分間麻酔をかけられます。これにより、動物へのリスクが大幅に減少し、眼科用潤滑剤が不要になり、唾液の蓄積を防ぐことができます。動物をできるだけ短い時間で鎮静させるように働きます。
2. ネックの角度を少し後ろに調整します(ネックをマイナーエクステンション、5°〜15°に配置します)。ノーズコーンを鼻孔にそっと押し込みます。コーンをしっかりと押し下げると、縫合糸に干渉してマウスが吊り下げられる可能性があるため、押さないでください。
3. 大きくて細かく鋸歯状の曲がった鉗子を使用して、舌を下唇にできるだけ近づけてしっかりとつかみます。それを下に引っ張り、上の歯から下の歯の片側に引き離します。
   注意: 長時間の牽引、過度の緊張、または舌の押しつぶしは、動物の健康を損なう可能性があります。外傷の兆候(あざ、出血、腫れ、乾燥)がないか舌を監視し、観察された場合は、手順を中止し、獣医スタッフに警告してください。
4. 助けの手を使用する場合は、この位置で鉗子を支えます。研究者の経験と視力によっては、照明付きの虫眼鏡が動物を適切に配置するのに役立つ場合があります。
5. 挿管安全ウェッジ(ビデオでは緑色)を所定の位置に置き、フレキシブルカテーテルに光ファイバーライト(使用している場合)を送ります。
   注意: 光ファイバーケーブルを光源にしっかりと固定しすぎないでください。強く押しすぎると、気管内チューブを所定の位置に残したまま光を取り除くのが難しくなります。

3.声帯の視覚的鑑賞と挿管

1. 耳鏡を利き手ではない手で、舌に軽く押し付けます。次に、カメラとその光源を角度にして、舌の付け根近くの声帯を視覚化します。
   注:解剖学的構造と組織の色のわずかな違いにより、自分の向きが難しくなることがあります。呼吸に関連する動きを使用して、構造的な識別を確認します。
2. 光ファイバーライトをオンにした状態で(使用している場合)、耳鏡の上部に沿ってカニューレを送り、舌の付け根または耳鏡の唇部分に軽く接触させて参照します。それをマウスの口の中、ソフトパレットと耳鏡の唇の間に進めます。
   注意: 光ファイバーライトが使用されていない場合は、この段階でステップ4で説明されている「バブルチューブ」をカテーテルに取り付けることができます。マウスの口の中の明るく焦点の合った照明は、この手順のこの変更に必要です。
3. カテーテルが非常に浅くなるようにアプローチ角度を調整します。カテーテルを挿入した直後(声帯から1mm未満)にカテーテルの先端を上げて、ベンチトップとほぼ平行になるようにします。これにより、喉頭蓋がカテーテルを背側に食道に押し込むのを防ぎます。特にトレーニング中、困難を抱えているとき、または経験の早い段階で、ビデオフィードの使用は、声帯の間に気管内チューブを配置するのに非常に貴重です。
   注:唾液の生成は、この手順の完了中に声帯の観察を妨げません。しかし、閉塞性の唾液を除去するための槍先綿アプリケーターの使用は、ラット¹⁹を挿管する際に、以前の出版物で説明されている。この方法は、唾液が問題になった場合に役立つ可能性があります。
   1. 抵抗が発生した場合は、すぐにカテーテルを取り外し、呼吸が正常に戻るのを待ちます。出血が認められた場合は、獣医師にご相談ください。
      注:カテーテルを前進させるときにはほとんど抵抗がないはずです。

4. 気管内チューブ留置の確認

1. 耳鏡を使用して、気管内チューブが正しい位置にあることを視覚的に確認します。さらに、気管が食道よりも配置中の抵抗が少ないことを考慮して、チューブの正しい配置を確認してください。適切な位置で、気管内チューブが声帯から~5mm離れていることを観察します。首の皮膚を透過する光ファイバー光源からの光を探して、配置が正しいことを再度確認します。
   注:挿管安全ウェッジは、気管内チューブを過度に挿入するのを防ぐ必要があります。安全ウェッジはカリーナへの外傷を防ぎます。しかし、それは進歩を妨げるものではありません。これは安全機能として使用する必要があり、最適な深さは多くの場合、ウェッジで許容されるよりも浅くなります。
2. 次に、気管内チューブを所定の位置に保持しながら、光ファイバーライトを取り外します。ミラーフォギングではなく、「バブル法」(詳細は以下)を使用してカテーテルの適切な配置を確認してください。
3. 手順1.3で準備したバブルチューブを取り出します。手続きに先立って準備し、すべての動物に再利用してください。
   注意: バブルチューブ内の200〜300μLの水またはインクは絶対に吸引しないでください。これを回避するには、液体がルアーロックから離れていることを確認してください。
4. 気管内チューブを所定の位置に固定した状態で、ルアーロックを使用してバブルチューブを所定の位置に固定します。潮汐量はすぐに明らかになるはずです。そうでない場合は、気管内チューブが誤って配置されています。すぐに取り外して、マウスの正常な呼吸数に戻るのを待ちます。
   注意: カテーテルを食道に誤って配置すると、気管が圧迫され、十分な呼吸が妨げられます。位置のずれは、多くの場合、呼吸困難(肋間筋からのかなりの寄与を含む)および/または呼吸数の劇的な減少を伴います。さらに、食道をカニューレ挿入すると、筋肉のけいれんを引き起こし、その後の挿管がより困難になる可能性があります。このため、トレーニング中は複数の動物を使用することをお勧めします。

5. 気管内デリバリー

注意:中咽頭分娩の舌引き法と同様に、挿管 による 分娩は動物を溺死させるリスクがあります。思春期および成体のマウスでは、50 μLは一般的に安全な量の液体を送達し、肺全体に広がるのに十分です。

1. 投与にシリンジを使用する場合:バブルチューブとルアーロックをカテーテルから取り外し、装填されたルアースリップシリンジを取り付け、プランジャーを押し下げて希望の容量(最大50μL)を送達します。
2. 投与にピペットを使用する場合:希望の容量(最大50μL)を直接カテーテルにピペットで挿入し、マウスが溶液を吸入できるようにします。
   注:トレーニングする場合は、希釈、フィルター付きインドインク、メチレンブルーなどのインジケーターの使用を検討してください。
3. 肺への拡散送達を確実にするために、送達された液体を最大500μLの空気²⁰で肺に洗い流します。これは、プリロードされた0.5mLルアーロックシリンジ、またはフィルターチップを取り付けたP1000ピペッターのいずれかを使用して行うことができ、どちらも信頼性が証明されています。必要に応じて、ピペッターの複数のくぼみを、送達された液体の負の吸引を危険にさらすことなく実施することができます。
   注意:この方法を使用して動物に接種する場合は、中咽頭吸引または鼻腔内送達と比較して送達効率が向上するため、接種濃度を下げることを検討してください。
   注:接種物を空気で洗い流す際には、潮汐量(~200μL)を超える量の使用が必要になる場合があります。しかし、500μLの使用は、肺活量²¹の約半分に過ぎないため、圧外傷のリスクはありません。成体マウスの吸気予備能は約~800μLであるため、マウスがフラッシングの直前に吸気したとしても、圧外傷は発生しない²¹。より少ないエアフラッシング量が接種材料の分布のニーズに適しているかどうかを検討してください(100〜200μLが推奨されています)。

6. 納品の評価

注:これは、手順をトレーニングまたは実践している場合にのみ行われます。

1. 承認されたIACUCプロトコルに従って動物を人道的に安楽死させます。ここでは、安楽死の主要な方法としてのCO₂ 窒息と、安楽死の確認方法としての子宮頸部脱臼が採用されました。
2. 胸壁を開き、肺を摘出します。これを行うには、腹膜を開き、尾側から横隔膜にアクセスし、心臓が見える場所に小さなハサミで穴を開けます。これにより、肺が収縮し、肋骨を切って胸腔を開くためのスペースが増えます。
   注:肺の血液を減らすための灌流が必要な場合は、この段階で心臓の右心室から手順を実行します。
3. 除去後、滅菌PBS1mLで肺を短時間すすいでください。それらを白い表面(外科用スポンジなど)に平らに置き、相対的なローブの位置を維持しながら最大領域を露出させます。
4. 生体 外で 肺を撮影し(携帯電話を使用)、ImageJで画像を開き、色素前面の輪郭をトレースして、染色された領域と染色されていない領域を定量化します。バイアスを避けるために、独立した盲検化された研究者を使用して染色された領域を定量化します。
   注: 図3に示すように、発光とIVISを使用する場合は、ステップ6の代わりに in vivo ライブイメージングを実施する必要があります。

結果

図1と図3に見られるように、従来の舌引き法(中咽頭送達)を使用した肺内接種では、インクの分布がばらつきがあり、研究者間のばらつきが大きかった。対照的に、挿管後のIT点滴は、右肺と左肺の両方へのより一貫した送達につながり、変動が少なかった(図1Cおよび図3D)。舌引きを使用した中咽頭吸引によってインクを与えられた動物の肺では、インクは微妙で、動物の大きな気道の近くにのみ存在します(図1A)。 対照的に、ガイド付き挿管を使用してインクを送達すると、インクは組織のはるかに遠くまで広がり、肺のはるかに広い領域を示しました。インクで染色した肺の表面積を方法間で比較したところ、挿管法は舌引き法よりもはるかに優れていることが証明されました(図1B)。インクの送達量のばらつきも、挿管状態で大幅に減少しました(図1C)。 染色される肺面積の増加と、肺に到達する液体量の変動の少なさは、IT送達が舌引きよりも優れていることを強く示唆していた。

ビデオ1で見られるように、従来の内視鏡(以前に公開されたもの)は焦点距離が長すぎるため、声帯を理解し、気管内チューブの配置をガイドすることはできません^6,19。対照的に、民生用耳鏡を使用して撮影されたビデオ画像(ビデオの図S1とタイムスタンプ:6:34と7:05)は、はるかに優れた解像度を示し、声門の視覚化が向上しました。

この挿管方法には、気管内のチューブ配置の複数の検証が含まれます。マウスの潮汐量は、バブル法(図S2 およびタイムスタンプ:8:25)を使用するとすぐに明らかになり、送達された液体が肺に入ることを最終的に保証する役割を果たします。

2つの送達方法のばらつきをさらに評価するために、マウスに1 x 10¹¹ vgのAAV6.2-ルシフェラーゼを接種した後、2つの異なる方法(舌引き法による中咽頭点眼またはガイド付き挿管後の気管内送達)を使用して、肺組織における導入遺伝子発現を評価しました。ベクター投与の7日後、 in vivo イメージングシステム(IVIS)を使用して発光測定を行いました(図3A)。次に、両方の肺の平均放射輝度を計算しました。イメージングの10分前(30秒露光)に、200μLのルシフェリン(15 mg / mL)を(皮下)注入しました。 図3Bに示すように、中咽頭点眼によってベクターを投与された動物は、胸部と鼻の両方の領域に広く分布する発光シグナルを持っていました。対照的に、ガイド付き挿管を用いた気管内送達によりベクターを投与された動物は、肺に集中した発光を示した。挿管された動物の平均放射輝度は、中咽頭送達と比較して大幅に大きく、肺へのベクター送達の効率が向上し、平均との差を使用して計算された送達の変動性が減少したことを示しています(図3C および 図3D)。

挿管法の肯定的な結果は、マウスの肺に最大 50μL の反復可能な点滴 ( 図 1 と 図 3 で実施) であり、肺全体にびまん性に分布し ( 図 1 で証明されているように)、他の領域 ( 図 3 に見られるように上気道/鼻など) には分布しませんでした。

動物への害、過度のストレス、肺に到達する液体量の減少、肺内の接種の分布不良、または長期にわたるトレーニングの必要性は、否定的な結果を構成するはずでしたが、発生しませんでした。

ビデオ1:マウスの中咽頭と声帯の従来の内視鏡像は焦点が合っておらず、効果的に使用するのが困難です。 この内視鏡の焦点距離は3cmであるため、声帯のひだや向きを理解するのが困難です。左下にベロ。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

図3:挿管は、O.P.吸引と比較して変動が少なく、肺への送達が大きくなります。 (A)6-10週齢の雌BALB/cマウスに1x10¹¹ vgのAAV6.2-ルシフェラーゼ(Penn Vector Core)を投与し、7日後に in vivo 生物発光イメージング(IVIS)で評価した。イメージングの10分前(30秒露光)に、200μLのルシフェリン(GoldBio、15mg/mL)を(皮下)注入しました。(biorender.com で作成)(B)OP吸引(舌引き、左)またはIT送達(挿管、右)によりAAV6.2-ルシフェラーゼを投与されたマウスの代表的なIVIS画像。関心領域は同じサイズで、領域内の平均放射輝度が画像に示されています。(C)OP吸引(n = 7)マウスと挿管(n = 5)マウスにおけるルシフェラーゼシグナルの定量化。p<0.0001 生のルシフェラーゼデータの対数変換後の不対応ウェールズ語のt検定による。(D)平均平均輝度のパーセントとしての平均からの偏差。(p=0.0381、ウェールズ語のT検定) この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図S1:ガイド付き挿管について記載されたプロトコルで使用された消費者向け耳鏡(左)および同様のコストと入手可能性の内視鏡(右)の例画像が示されています。 画像間のピントの明らかな違いに注意してください。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

図 S2: 使用中のバブル チューブを示すサンプル画像。 潮汐量は、気泡管内の液滴を数センチメートル速く動かします。チューブが食道にある場合、液滴はほとんど動きません。呼吸数と潮汐量は、この方法で推定できます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

図S3:高価な光ファイバー照明キットを購入する必要をなくす基本的な照明アセンブリ。 20 Gの針を50 mLの円錐形の0.75 mm光ファイバーケーブルに通し、安価に(そして大量に)購入し、かみそりの刃で長さ(~1m)に切断し、所定の位置にテープで固定しました。光ファイバーケーブルにぴったりとフィットするため、カテーテルを所定の位置に固定する必要はありませんでした。円錐形の蓋を携帯電話の懐中電灯に固定すると、暗い部屋で挿管を行うのに十分な光伝達が得られます。このアセンブリは、この技術を組み込んだ研究室が負担するコストをさらに削減します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

挿管と気管内注入は、肺への液体送達のための最良の方法ですが、マウスの解剖学によって提示される豊富な課題が、呼吸器研究室での広範な採用を妨げています¹⁵。これにより、肺への接種物の効率的な送達が保証されますが、この技術や他の挿管技術によるIT送達の潜在的な欠点は、上気道をバイパスすることです。鼻腔内分娩は、上気道をバイパスしない実績のある方法です。鼻腔内送達は、肺ウイルス学研究室でよく使用され、場合によってはより効果的であるかもしれないが²²、一部の吸引剤の自然な曝露経路²³ を反映しておらず、肺内の接種量の変動量が多くなり²⁴、イソフルランを麻酔薬として使用すると効果が低くなります⁵。そのため、エアロゾル化装置と他の肺送達技術との比較について広範な研究が行われてきました²⁵が、これらの方法はエアロゾル関連の危険性を示し、高価になる傾向があります。これらの困難はすべて、舌引き²⁶ による中咽頭点滴につながり、多くの研究室で肺液送達に好まれる方法となっています。私たちが示したように、この方法は挿管後の気管内点滴よりもはるかに変動します。さらに、舌引き法による分娩は投与中に評価することができず、嚥下を防ぐために必要な張力によりマウスの舌に過度の外傷を引き起こす可能性がある。舌は、ガイド付き挿管とIT点滴技術でも保持されます。しかし、ビデオフィードには声門が映っているため、私たちの方法を使用する研究者は、舌に大きな緊張を乗せて喉頭の位置を強制する必要はありません。この牽引力の低下により、組織の外傷が少なくなります。しかし、挿管とIT点滴によってもたらされる大きな利点にもかかわらず、一部の研究室ではその使用を阻む課題がありました。例:食道の誤ったカニューレ挿入による気管の圧迫は、呼吸を妨げ、死亡率を増加させる可能性があります。気管内チューブを深く挿入しすぎると、カリーナまたはメインステム気管支が損傷する可能性があります。そして最後に、従来の方法によるマウスの挿管は長い時間がかかり、信頼性の高い肺内送達を求めるほとんどの研究者にとって実用的ではありません。私たちの方法は、マウスの挿管に関連する困難に対処し、挿管マウスの解剖学的障壁を克服します。

視覚補助を実装することにより、マウス挿管の解剖学的課題を克服するために、いくつかの方法が提案されています。例えば、従来の内視鏡の使用が提案されている⁶。ただし、この装置の焦点深度が長いため、マウスの挿管に使用するには適していません(図S1)。これは、声帯のひだが見えているがぼやけているビデオ1でもすぐにわかります。臨床耳鏡は、直接喉頭鏡検査にも使用されています¹²。しかし、臨床耳鏡のコストとビデオフィードの欠如により、ほとんどの研究室ではアクセスできず、トレーニングには適していません。広く普及している消費者向け耳鏡の使用により、ガイド付き挿管の実用性が大幅に向上しました。焦点距離が短く、体が小さく、デプレッサーリップが長いため、ビデオフィードがより鮮明になり、操作性が向上し、ポジショニングが可能になり、耳鏡リップを使用して舌の付け根に圧力を加えることができるため、声門縁へのアクセスが向上します。これらの視覚補助を超えて、トランスイルミネーションは、声門および挿管マウスを成功裏に視覚化するためにも使用されてきた7,13,14。ただし、トランスイルミネーションベースのアプローチでは、マウスの首を覆う領域に脱毛剤を配置し、高温の光源に近接し、カテーテル内で針を使用し、鋭利な器具をマウスの口に挿入し、および/または配置を確認するために気管に小さな切開を行う必要がある場合があります。ここで説明する方法は、これらのリスクを回避し、これらの公開された方法の最良の側面に基づいて構築されています。挿管に対する解剖学的な障壁を克服することに加えて、私たちの方法ではコストの考慮事項が考慮されています。

補助の手、マウススタンド、耳鏡、光ファイバーライトの使用を組み合わせることで、挿管の習得が容易になり、ラボの費用が削減されます。市販の挿管スタンドのコストは、手作りのもの²⁷を使用することで回避できます。光ファイバーライトアセンブリのコストは、光ファイバーケーブルを別途購入することで賄うことができます(執筆時点では、~9ドル対218ドルの科学的な価格です)。光ファイバー光源を完成させるために、ピンホールとテープを備えた50mLの円錐形の蓋を使用して、携帯電話の懐中電灯から光を集めることができます( 図S3および 資料の表を参照)。Das et.同様のデバイス^{を説明する 11}.一部のラボでは、このソリューションのコストが削減されるため、私たちのメソッドがはるかに利用しやすい手順になる可能性があります。コストだけでなく、気管内チューブの配置を確認するのが難しいため、マウスの挿管は困難になっています。

従来、気管内チューブが適切に配置されていることを確認するために、研究者は気管内チューブ¹⁸の上に歯科用鏡をかざすことによる鏡曇りに頼っていた。しかし、潮汐量が小さく、室温のばらつきがあるため、鏡面の曇りを防ぎ、判断ミスにつながることがよくあります。マウス挿管の場合、これは怪我の深刻なリスクをもたらします。.他の人々は、気管内チューブ¹⁰を閉塞することによって呼吸困難を誘発することに頼ってきた。これにより、動物に大きなストレスがかかり、「バブル法」よりも情報が少なくて済みます。さらに、気管内チューブの配置の確認が不十分なために肺治療薬や空気が胃に導入されると、投与される薬剤の有効性が阻害されるだけでなく、苦痛を引き起こす可能性があります。「バブル法」の使用は、気管内チューブ留置のより迅速で信頼性の高い視覚的確認を提供し、前述の同様の方法²⁸をわずかに改善したものである。「バブル法」では、研究者は動物の呼吸数と潮汐量を大まかに推定することもできます。

動物のポジショニングと声帯の視覚化は、この技術の鍵です。その結果、小児の鼻鏡は大きすぎて、挿管時に口を開けて頬を邪魔にしないのは面倒であることがわかりましたが、研究者が耳鏡の配置を実演できるため、トレーニング中には非常に役立ちました。研修生が関連する解剖学的構造を認識するように指導することは困難であり、マウスの口の視認性を向上させることが重要であり、市販の耳鏡の使用によって大幅に支援されました。照明付きの虫眼鏡を使用したステージングと手伝いは、経験の浅いオペレーターの挿管を支援するために不可欠ですが、経験豊富なオペレーターにとってはそれほど重要ではないかもしれません。

この方法のトレーニング中は、トラブルシューティングが必要になる場合があります。気管内チューブが繰り返し食道に入ると、声門が痙攣したり、軟口蓋が炎症を起こしたり、適切な留置が難しくなったりする可能性があります。この状況では、動物が数分間回復するのを待ってから、再度挿管を試みます。.再試行回数はIACUCプロトコルで指定し、常に遵守する必要があります。声帯が見えにくい場合は、麻酔がかかりすぎて呼吸数が抑制されているか、マウスの位置が不適切である(最も一般的には頭が後ろに傾きすぎている)可能性があります。この場合、動物の位置を変え、麻酔から回復させてから再試行してください。バブルチューブは、動物の潮汐量を明確に示す必要があります。気泡がわずかに動いている場合は、気管内チューブの置き忘れによって気管にかかる圧力によるあえぎがこの動きを引き起こしている可能性があります。この場合、タイムスタンプ:8:25と 図S3 を参照して、正しく配置された気管内チューブの「バブルチューブ」を使用したときに潮汐量がどれほど簡単に明らかになるかを確認してください。気管内チューブを誤って配置した場合は、すぐに取り外して動物が回復するのを待ってから、手順を再試行してください。

挿管と気管内点滴は他の方法よりもはるかに優れていますが、技術的に難しすぎて広く採用されていませんでした。ここで説明する方法は、気管内点滴とマウス挿管をアクセス可能で実用的なものにします。この技術の将来の応用は、肺に何が送達され、どのような状況で与えられるかに大きく依存しますが、簡単で信頼性の高い方法は、肺生物学の多くの進歩への道を開きます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
光ファイバーライトi光ファイバー照明キット、マウスケン	トサイエンティフィック	ETI-12ETI-MSE-02	ファイバーアセンブリのコンポーネントで、他のライトと互換性があり、以下の
ファイバーアセンブリ	Braintree Scientifuc	RW-A37 47	品、議論されていません (ただし、機能しない理由はありません)
代替光ファイバーアセンブリ	ハーバード装置	72-9075	品、議論されていません (ただし、機能しない理由はありません)
代替光ファイバーアセンブリ	ラボによる手作	N/A	ゴム栓を使用した手順はここにあります: DOI 10.3791/50318
代替光ファイバーアセンブリ	ラボによる手作	N/A (以下にリストされている材料)	50mL の円錐形の蓋、テープ、0.75mm 光ファイバー
管スタンド、マウス	Kent Scientific	ETI-MSE-01	管用の調節可能なスタンド、多くの自作バージョンが利用可能、チップラックと木製プラットフォームが使用され、いくつかの代替品は利用可能な多くの適切な代替品をリストアップしました。
代替挿管スタンド	Braintree Scientifuc	RIS 100	代替案、議論されていない (ただし、機能しない理由は見当たりません)
代替挿管スタンド	夏目製作所	KN-1014	、議論されていません (ただし、機能しない理由は見当たりません)
代替挿管スタンド	Vetland	000A3467	代替案、議論されていません (ただし、機能しない理由はありません)
代替挿管スタンド	ラボで手作り	N/A	3 リング バインダーから作られています: DOI 10.3791/60844 (いくつかの代替方法が公開されています)
非吸収性編組シルク縫合糸、サイズ 0	ファイン サイエンス ツール	18020-00	1 インチを超えると、気管部&NBSPが損傷します。
Safelet IV カテーテル 20G x 1"	Nipro	NPRCI+2025	または類似の
RS-5358 マイクロ解剖鉗子	Fisher	RS-5358	または同様のもの、手助けが含まれています
ライトとスタンド付き虫眼鏡、EOOKU フレキシブル磁気ヘルプハンド、5X&10X 12V 108個LEDビーズ拡大ランプ、3モード調整可能なスイベルグースネックアーム&。ヘビーデューティーベースプレート	マゾン	https://www.amazon.com/Magnifying- EOOKU-フレキシブル-調整可能-グースネック /dp/B0C5MC6QNW/ref=sr_1_5?crid=F4 PZY6UOCEE9&dib=eyJ2IjoiMSJ9です。 gj5cKLw4v3CDSkrQKcs73kXqVtnJl JpBKEp_FcTCIEQSO3EirxEYoH ySohcPg0ZDhmnFwGeLit22nM SJxpz1MPP0 q6-PwbPzzMT0RWB_pXkmSBiAo5xB J4QSf8_BoLZ4u8S8lfIo5WI9-VuXj75X eo0LQfygaSM gW58XO2bbasOfaw cwxZXs5cTqCUmKh5bRn7A19_ cY2a0-x_ly-27RXXPinVbBNW00Ww8jY55x fnWFCaK5lnPb4VxSV6iTCOhMnkm TopFiA3rCLNXcBDGCwfLdw22w 17T0c_rRhh-Mrew 。TtsVr89Bo5YLvaXvarcbKxJ07GK zMMVSg5op4U5eyvA&dib_tag= se&キーワード=拡大+ガラス+with +光+EOOKU+3+in+1&qid=1709661 709&sprefix=拡大+ガラス+with+ 光+eooku+3+in+1%2Caps%2C98&sr=8-5	または同様の場合、曲がった細かく鋸歯状の鉗子は機能します
耳ワックス除去 - 耳ぐるみ除去ツール 8個入り耳セット付き - カメラ付き耳クリーナー - ライト付き耳垢除去キット - イヤーカメラ 6 イヤースプーン付き - iOS用イヤークリーナー &Android(ブラック)	Amazon	https://www.amazon.com/Ear-Wax- Removal-Remover-Android%EF% BC%88Black%EF%BC%89/dp/B0 9KZ8TS7L/ref=pd_lpo_sccl_1/147 -1203879-4147304?pd_rd_w=Lt8 Ta&content-id=amzn1.sym.1ad20 66f-97d2-4731-9356-36b3edf1ae 04&pf_rd_p=1AD2066F-97D2-4731 -9356-36B3EDF1AE04&pf_rd_r= MDQ3AHH4AC8T2KFX1RBE& pd_rd_wg=ja4H2&pd_rd_r=52d9 372c-b34b-4f6a-93f6-974754d96 3d9&pd_rd_i=B09KZ8TS7L&PSC = 1	または同様の、いくつかのブランドが利用可能
AZIMOM PMMA プラスチック エンド グロー光ファイバー ケーブル 0.75mm (0.02in) 100m(328ft)/ロール 星空天井用 オール カインド LED ライト エンジン ドライバー ソース	Amazon	https://www.amazon.com/AZIMOM -Plastic-Cuttable-Ceiling-1pcs0-00 98in328ft/dp/B07WC9JV5N/ref=sr _1_9?dib=eyJ2IjoiMSJ9.K7NmvB hJOux4zdNBKSPo-ac4HYPDPUS F85Qlra7o7G2FQl9MQLj1D7QtPJ cxnAeDiYm_yNWPhwj44nhSfwqM vs1AtulruHGEsfjLEAjRGSFpNLgN H-Ewc190MluERArk91lR9Od6ceB Hkz2AJad11hVUkWEOb0-emUWW b2U4fNN0upQKgyD1vE eU0DtClQ73tDe22z4CXrSLP7vC D9jF2APfz1liHou_zdiAyCSFb1Df bC8Ymce6zXV0qOD3gQFkm6j NV5bN1DG8SH_BaV4vofzj98T JVRnNElEzUzjx0rY. AMHl3h-jIz GTeGjvej0Nq8FTPLEPmfiQ UDPz_U6ctI0&dib_tag=se& キーワード=fiber%2Boptic%2Blight %2Bstrands&qid=1722619884&SR =8-9&th = 1	または同様の場合、ファイバーは、ライン 7 のデバイスを構築するために使用されます
50mL コニカル チューブ	セル トリート	229421	不透明なプラスチック 50mL スクリュー キャップ コニカル リッドが機能する必要があります。動物と接触したり、近接したりしないため、無菌の必要はありません。
イソフルラン	VetOne	獣医スタッフ
Innoculum	N/A	実験
ピペットチップ(フィルター)	/A	菌フィルター p100 および p1000 チップは使用されています	ブランド/サプライヤーは関係ありません
誘導チャンバー	N/A	貴社の機関で入手可能なもの	ブランド/サプライヤー 関連なし
イソプロパノール準備パッド	N/A	器具の洗浄用	ブランド/サプライヤーは関係ありません
チューブ	N/A	小径フレキシブルチューブが機能します	「バブルチューブ」の建設用 (私たちのものは直径~3mmで、点滴ラインから採取しました)
上記のチューブにフィットする	ルアーロック	N/A	バブルチューブ」の構造用
3M ハーフフェイスマスクマスク	3M	17-986-9B	への曝露を制限するツ
イストタイ	N/A	N/A	ブルチューブのU字型を維持するための