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方法論記事

結核菌由来の培養濾液タンパク質(CFP)の分離と分画

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DOI:

10.3791/67679

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2025年7月11日

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1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

この記事について

サマリー

このプロトコルは、 結核菌の分泌タンパク質の培養、回収、および濃縮について記述しています。培養ろ液タンパク質(CFP)を定量し、等電点電気泳動により20の画分に分離し、さらに分取SDS-PAGEと電気溶出システムを用いて30の画分に分離します。

要約

結核菌(M. tuberculosis)の分泌タンパク質は、結核の発症、免疫調節、および疾患の進行に重要な役割を果たします。その組成と機能を理解することは、結核の診断、ワクチン開発、および治療介入に役立つ新しいバイオマーカーを特定するために不可欠です。この研究では、培養濾液タンパク質(CFP)の体系的な単離、分画、および特性評価に焦点を当て、包括的な免疫学的およびプロテオミクス分析を可能にします。CFPは、制御されたタンパク質発現を確保するために、化学的に定義された条件で成長したM.tuberculosis H37Rv培養物から得られました。培養上清をろ過して精製し、中空糸システムを使用して濃縮して、10 kDaを超えるタンパク質を保持しました。分画は、液相等電点集光によって達成され、等電点に基づいてタンパク質を20の異なる画分に分離しました。調製ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を使用してさらに分離を行い、続いて電気溶出を行い、30個のタンパク質画分を得ました。このアプローチで得られた分画タンパク質は、免疫学的プロファイリングや質量分析に基づくプロテオミクス解析に貴重なリソースを提供します。この研究は、分泌されたタンパク質を系統的に単離し、特性評価することで、結核特異的タンパク質バイオマーカーの同定に貢献し、診断精度を向上させ、結核菌の病因の理解を深めることができます。

概要

広範な研究により、 結核菌1の増殖と免疫相互作用における分泌タンパク質の重要な役割が浮き彫りになっています。 結核菌 の培養濾液には、タンパク質成分と非タンパク質成分が複雑に配列されているため、その生物学と免疫原性を理解するための貴重なリソースとなっています。初期のプロテオミクス研究では、培養濾液中に約450種類のタンパク質が同定され2、その多くが結核に対する免疫応答の誘発に重要な役割を果たしています。これらの免疫学的に重要な抗原を同定することは、結核の革新的な診断法とワクチンを開発するために不可欠です。しかし、この分野の進歩は、 結核菌 感染に対する免疫応答の複雑さと、マイコバクテリアタンパク質の単離に使用される生化学的精製方法の技術的限界によって困難に直面しています。

結核菌タンパク質の分離にはさまざまな分離技術が採用されており、マイナーでありながら機能的に重要なタンパク質の検出を容易にし、プロテオミクス研究の範囲を拡大しています。理想的な分離法は、複雑なタンパク質混合物を限られた数の異なる画分に効果的に分離します。マイコバクテリアタンパク質の分離に広く使用されている2つのアプローチは、クロマトグラフィーベースの方法と電気泳動ベースの方法1,2です。

アフィニティー、イオン交換、逆相クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー技術は、10 年以上にわたってタンパク質分画の基礎となってきました。これらの方法は、 結核菌 タンパク質の分離に広く使用されています3。しかし、タンパク質収率の低さや非タンパク質成分からの干渉などの要因によって制限され、その後の免疫学的解析を複雑にする可能性があります。これらの欠点により、免疫学的に重要な抗原を同定するためのクロマトグラフィーの有用性が制限されます。

これらの制限に対処するために、2次元電気泳動ベースの分離法が採用されました。最初の次元では、等電点に従ってタンパク質を分離する分取IEFシステムを使用して、等電点集光(IEF)に基づいてタンパク質を分離します。2次元では、分取SDS-PAGEを使用してタンパク質を分子量でさらに分離し、続いて全ゲル溶出装置で溶出します。

この 2 次元アプローチには、いくつかの利点があります。培養濾液タンパク質(CFP)を600の異なる画分に分画することにより、培養濾液タンパク質(CFP)の複雑さを大幅に軽減します。さらに、この画分は、溶出プロセスが細胞免疫学的アッセイ4,5,6を妨害する成分を導入しないため、直接免疫学的分析に適している。

このプロトコールは、免疫学的分析のための培養濾液タンパク質の調製と分離を詳述しています6。

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プロトコル

本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1. 結核菌 の増殖と培養濾液タンパク質(CFP)の調製

  1. Sautonの液体媒体の調製
    1. 以下の成分を950mLの蒸留水に混ぜ合わせます:グリセロール、30.0mL;オルトリン酸二水素カリウム(KH2PO4)、0.5g;硫酸マグネシウム、0.5g;クエン酸、2.0g;カゼイン加水分解物、0.5g;硫酸第二鉄アンモニウム、0.05g;グルタミン酸ナトリウム、4.0 g。
    2. 40%水酸化カリウム(約5mL / L)を使用してpHを7.2に調整します。
    3. 容量を1Lにし、15psiで20分間オートクレーブします。
  2. マイコバクテリア懸濁液の調製
    1. Lowenstein-Jensen(LJ)で増殖した 結核菌 H37Rv(ATCC 27294)のコロニーを2 mLのSautonの液体培地に移します。
    2. 無菌条件下でガラスビーズで激しく振とうすることにより、マイコバクテリアの塊を分解します。
  3. マイコバクテリアの増殖の開始
    1. 細菌懸濁液を10 mLのSautonの液体培地が入ったMcCartneyボトルに移します。.
    2. ボトルを37°Cで2週間インキュベートします。
  4. カルチャのスケールアップ
    1. 成長させた培養物を1Lボトル中の200 mLのSauton培地に移します。
    2. シェーカーで37°Cで4週間インキュベートします。
    3. 対数相培養物を、2 LのSauton培地を含む4 Lフラスコに移します。
    4. 静止条件下で37°Cで培養物をさらに4週間増殖させ、表面のペリクルが形成されるまで培養します。
  5. 培養濾液タンパク質(CFP)の採取
    1. 1,000-1,500 x g で室温で30分間遠心分離することにより、培養物を回収します。
    2. 0.45 μmの真空ろ過システムで上清をろ過します。
    3. CFPを含む濾液を、10 kDaのカットオフを備えたタンジェンシャルフローろ過システムを使用して濃縮します。
  6. 収穫したCFPの保存
    1. 市販のBCAアッセイキットを使用してタンパク質含有量を推定します。
    2. タンパク質を分注し、アジ化ナトリウムを最終濃度0.2%まで加え、-80°Cで保存します。

2. 液相等電点電気泳動(IEF)の調製

  1. タンパク質サンプルの調製
    1. 8 Mの尿素、1 mMのジチオスレイトール(DTT)、5%グリセロール、2%ジギトニン、2%両性質(pH 3.0-10.0およびpH 4.0-6.0、1:4の比率)を含む60 mLのIEF分離バッファーに結核 菌 CFPを溶解します。
  2. IEF システムのセットアップ
    1. アノードチャンバーに0.1 Mリン酸を充填し、カソードチャンバーに0.1 M水酸化ナトリウムを充填します。
    2. 製造元の指示に従って、分取IEFセルを組み立てます( 材料の表を参照)。
  3. IEF の実行
    1. 最大350 mgのタンパク質をIEFシステムにロードします。
    2. 冷却循環水システムにより、タンパク質を4°Cで集束させます。
    3. 電圧が約1400Vで安定するまで12Wの一定の電力を印加し、その後さらに30分間続けます。
  4. 分数の収集と分析
    1. IEFフラクションを採取し、そのpHを測定します。
    2. SDS-PAGEにより各アリコートを解析し、銀染色によりタンパク質を可視化します。

3. SDS-PAGEおよび全ゲル溶出

  1. SDS-PAGEのサンプル調製
    1. IEFフラクションを市販の6x SDS-PAGEサンプルバッファーと混合します。
    2. 混合物を95°Cで5分間加熱します。
  2. SDS-PAGE調製の実行
    1. 16 cm × 20 cm のポリアクリルアミドゲルに最大 10 mg のタンパク質をロードし、4% スタッキングゲルと 12.5% 分離ゲルを添加します。
    2. 50mAの定電流で電気泳動を行い、色素の前面が底部から2cmになるまで測定します。
  3. ゲルからタンパク質を溶出
    1. 溶出バッファー(60 mM の Tris、40 mM の CAPS、pH 9.4)でゲルを 10 分間平衡化します。
    2. ゲルを全ゲル溶出装置に移します。
    3. 250mAの定電流を1時間印加してタンパク質を溶出します。
  4. 分数の収集と分析
    1. 分離したタンパク質を、それぞれ容量2.5 mLの30種類の画分に溶出します。
    2. 製造元の指示に従って、BCAタンパク質推定法を使用してタンパク質濃度を決定します。
    3. 各画分から10 μgのタンパク質をSDS-PAGEで解析し、銀染色を用いて可視化します。

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結果

図1は、調製した培養ろ液タンパク質(CFP)の複雑さを示しています。最初に、100 μg の CFP を 2D-SDS PAGE 分析にかけ、その複雑さを評価しました。この分析により、CFPには約100の異なるタンパク質スポットが存在することが明らかになりました(図1)。

各ランから収集された20のフラクションをSDS-PAGEで分析しました。これらのうち、3つの異なるランからの3つの代表的なフラクションを 図2に示します。

図3は、分離されたフラクションのpH分布を示しており、2.54〜12.9の範囲でした。ほとんどの画分(画分5〜14)のpHは4〜6で、マイコバクテリアタンパク質の大部分が焦点を当てていました。フラクション全体でpHの緩やかな上昇が観察されました(

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ディスカッション

結核菌の培養ろ液タンパク質(CFP)は、さまざまな濃度で存在する多様なタンパク質成分の複雑な混合物を表しています。プロテオミクス研究により、CFP 4,5 内に最大 1,314 のタンパク質が同定されています。数多くの研究により、免疫応答の調節におけるCFPの重要な役割が浮き彫りになっています。具体的には、CFPは、T細胞応答4,5,6,7とB細胞誘導性抗体応答8,9,10,11を特徴とする細胞性免疫の両方において不可欠な役割を果たします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ÄKTAフラックス接線流ろ過システム サイトバ29038437
両性電解体(pH 3.0〜10.0)バイオラッド1632094
両性電解体(pH 4.0〜6.0)バイオラッド1631143
BCAタンパク質アッセイ メルク71285-M
キャップメルクC2632
カゼイン加水分解物メルク65072-00-6
クエン酸メルクC0759
デジトニンメルク300410
DTTのメルクD9779
硫酸第二鉄アンモニウムヒメディアGRM10944
グリセロールメルクG5516
グリセロール メルク252859
ローウェンスタイン・イェンセン傾斜 ヒメディアSL001
硫酸マグネシウムメルクM7506
Millipore Stericup クイックリリース真空ろ過システムメルクS2HVU11RE
リン酸 メルク695017
オルトリン酸二水素カリウムメルクP0662
水酸化カリウム メルク484016
分取IEFセル(Rotofor) バイオラッド170-2986 
アジ化ナトリウム メルクS2002
グルタミン酸ナトリウムメルク49621
水酸化ナトリウムヒメディアMB095
トリスメルク252859
尿素メルクU5128
全ゲル溶出装置 バイオラッド1651250

参考文献

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  15. Rodríguez-Hernández, E., et al. Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis. J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).
  16. Deenadayalan, A., Sundaramurthi, J. C., Raja, A. Immunological and proteomic analysis of preparative isoelectric-focusing separated culture filtrate antigens of Mycobacterium tuberculosis. Exp Mol Pathol. 88 (1), 156-162 (2010).

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再版と許可

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タンパク質分画等電点電気泳動SDS-PAGEタンパク質バイオマーカー免疫学的プロファイリング接線流ろ過プロテオーム解析T細胞抗原
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