方法論記事

下流のタンパク質分析のための結 核菌 からの細胞壁および細胞膜タンパク質の分離と分画

DOI：

10.3791/67680

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2025年9月26日

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1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

この記事について

サマリー

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このプロトコルは、等電点に基づく分取等電点フォーカシング(IEF)を使用して、不溶性細胞壁および膜タンパク質を単純な画分(1〜5タンパク質)に分離し、続いて分子量による分離を行います。得られた画分は、それ以上の精製を行わずに、免疫学的およびプロテオミクス分析に直接使用できます。

要約

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結核の病因において中心的な役割を果たすマイコバクテリウム細胞壁および膜タンパク質は、分取等電点集束(IEF)および分取ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を使用して分離することに成功しました。続いてゲル溶出を行い、疎水性タンパク質を分離するための従来の方法の限界を克服します。この手順では、結 核菌 コロニーをローウェンスタイン・ジェンセン傾斜から2mLの7H9ブロスに移し、ガラスビーズで分散させ、37°Cで2週間インキュベートしました。次に、培養物を200 mLまでスケールアップし、シェーカーで4週間増殖させました。さらに500 mLの7H9ブロスで1 Lにアップスケールし、さらに4週間成長させました。増殖したマイコバクテリアを1741 × g で30分間遠心分離してペレット化した。2 gペレットごとに、1 mLの破壊バッファーを添加し、サンプルを超音波処理しました。ライセートを3436 × g で15分間遠心分離して、壊れていない細胞を除去し、上清を濃縮した。この上清(全細胞ライセート)を13751 × g で30分間遠心分離して、細胞壁タンパク質をペレット化しました。残りの上清を100,000 × g で4時間超遠心分離し、細胞膜と細胞質ゾルを分離しました。単離された細胞壁および膜タンパク質を4°Cの液体分取IEFシステムにロードし、電圧が1400 Vで安定するまで12 Wで分離し、20画分を分離しました。これらのIEF画分を分取SDS-PAGEによってさらに分離し、250 mAで全ゲル溶出器を使用してタンパク質を溶出させ、30画分を得ました。このプロトコルを通じて、新規の結核菌の細胞壁と膜特異的バイオマーカーを同定することができ、他の病原体における類似のタンパク質を特徴付ける可能性も示しています。

概要

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免疫学的研究により、精製が容易な可溶性タンパク質に加えて、結核菌などの病原体に対するヒトの免疫応答は、結核菌の細胞壁1および細胞膜タンパク質2に存在する疎水性タンパク質にも指向性があることが実証されています。これらの細胞壁および膜タンパク質は、結核を含む多くの病原体に対する免疫学的制御において重要な役割を果たします。これらのタンパク質のいくつかは、T細胞およびB細胞応答を発動する免疫優性抗原として報告されています。対照的に、他のタンパク質は、免疫細胞による病原体関連分子パターン (PAMP) などの自然免疫応答を開始することが認識され、それによって免疫応答を開始することが認識される病原体の分子シグネチャとして同定されます。たとえば、LprG、LpqH、LprA、およびPhoS1などのマイコバクテリアリポタンパク質は、Toll様受容体23によって認識されます。

細胞壁および膜タンパク質の疎水性は、可溶化と分離の点で重大な技術的課題を提示します。研究によると、膜タンパク質は、マイコバクテリアを含むすべての生物のコード領域の約20%から30%を占めています4,5。細胞壁および膜タンパク質は、その固有の性質と技術的な課題により、可溶性タンパク質と比較して可溶化および単離が困難です。その結果、膜タンパク質構造のわずか2%が報告されています6。これらのタンパク質の単離が困難になる原因はいくつかあります。主な課題は、細胞内での存在量が少ないことであり、さらなる特性評価のための個々のタンパク質の単離が複雑になります7。さらに、これらのタンパク質は凝集する傾向があり、溶解度がさらに複雑になります。この問題は、可溶化を助ける洗剤を加えることで対処できます。ただし、一部のタンパク質は界面活性剤の存在下でも凝集体を形成する可能性があり、その場合、カオトロピック剤および還元剤を使用して溶解性を向上させることができます。

可溶化に界面活性剤を使用すると、その後の分離方法が妨げられる可能性があります。たとえば、荷電界面活性剤はイオン交換クロマトグラフィーでは使用できず、すべての界面活性剤は疎水性相互作用クロマトグラフィーを破壊する可能性があります8。したがって、選択した分離方法と互換性のある洗剤を選択することが重要です。細胞壁および膜タンパク質の単離におけるもう一つの重要なステップは、可溶化に使用される界面活性剤の除去であり、これらはタンパク質のその後の機能分析を妨げる可能性があるためです。

私たちは、膜タンパク質、特に細胞壁と細胞膜からの疎水性タンパク質の分析に関連する多くの課題を克服する堅牢な方法論を開発しました。これらのタンパク質を研究する際の主な課題は、疎水性の性質により抽出と分析が困難になるため、可溶化です。ここで説明する方法論は、細胞壁および細胞膜タンパク質を効率的に可溶化する特別に配合された等電点集束(IEF)バッファーを採用しています。この可溶化ステップは、これらの疎水性タンパク質のその後の分析を可能にするため、非常に重要です。

この方法のさらなる利点は、タンパク質混合物の複雑さを軽減できることです。タンパク質の等電点(pI)と分子量に基づく2つの相補的な分離技術を採用することにより、この方法は細胞壁と細胞膜タンパク質を単純化された画分に効率的に分離します。通常、各画分には1〜3つのタンパク質しか含まれていないため、分離能が大幅に向上し、下流の特性評価が容易になります。

この方法論は、 結核菌 の細胞壁と細胞膜タンパク質をモデルシステムとして使用して開発され、疎水性タンパク質の単離と分析に関連する課題に効果的に対処します。これらは、これらの複雑なタンパク質画分の単離、分離、特性評価のための信頼できるアプローチを提供し、それらを詳細に研究する能力を向上させます。

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プロトコル

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この研究は関連する政府のガイドラインに準拠しており、機関科学諮問委員会および倫理委員会によって承認されました。サンプルを採取する前に、研究集団からインフォームドコンセントが得られました。

1. 結核菌の培養

  1. 約10個の M.結核 コロニーをLowenstein-Jensenスラントから2 mLの7H9ブロス培地に移します(2.35 gのMiddlebrook 7H9ブロスベースを400 mLの蒸留水、50 mLのオレイン酸アルブミンデキストロースカタラーゼ[OADC]サプリメント、0.5 gのTween 80に懸濁し、最大500 mLにします)
    注: 結核菌 はリスク グループ 3 の病原体です。BSL3施設の生物学的安全キャビネット(BSC)で取り扱う必要があります。適切な個人用保護具 (PPE) を使用する必要があります。
  2. ガラスビーズを使用して、無菌条件下でボトルシェーカーで15rpmで1分間細胞を分散させます。
  3. 細菌懸濁液をマッカートニーボトル内の10 mLの7H9ブロス培地に移し、シェーカーインキュベーターで30 rpmで37°Cで2週間インキュベートします。
  4. 対数期培養を200 mLの7H9ブロス培地にスケールアップし、シェーカー培養物で30 rpmで4週間増殖させます。
  5. さらに、500 mLの7H9ブロス培地を含む1Lフラスコで培養物をスケールアップし、37°Cで4週間30rpmでシェーカー培養物として増殖させます。
  6. 1741 g で30分間遠心分離してマイコバクテリアを収穫します。

2. 全細胞ライセートタンパク質の調製

  1. 単離された細菌ペレットを標準プロトコルに従って超音波処理にかけます。
  2. 次の組成で破壊バッファーを調製します:8.5%(100 mLあたり8.5 g)NaClを含む20 mM Tris。
  3. 濃縮HClで最終pHを7.4に調整します。
  4. 新たに調製したプロテアーゼ阻害剤を、以下の濃度の破壊バッファーに添加します(添加するプロテアーゼ阻害剤の詳細は 、補足表1にリストされています)
  5. 細菌細胞ペレット2gごとに結 核菌 (100 mLの充填容量および計量)を処理し、1 mLの破壊バッファーにリゾチーム(1 mg / 5 mLの細胞懸濁液)を加え、穏やかに攪拌しながら37°Cで15分間インキュベートします。
  6. 桿菌をその2倍の体積の破壊バッファーに懸濁します。
  7. 0.04%(wt/vol)アジ化ナトリウムと0.05%トゥイーン80をバッファーに加えます。
  8. 超音波処理器を使用して、9秒オン、9秒オフのサイクルで40%の振幅で30分間、タンパク質の変性を防ぐために懸濁液を氷上に保ち、破壊バッファー内の細菌細胞を破壊します。
  9. 調製したライセートを3438 g で4°Cで15分間遠心分離し、壊れていない細胞を除去します。
  10. 遠心濃縮器(3 kDaカットオフ-5 mL)を使用して上清を濃縮します。
  11. BSAタンパク質を標準として使用したビシンコニン酸(BCA)タンパク質定量アッセイを使用して、上清中のタンパク質濃度を測定します。
    注:SDS-PAGE分析では、分析用に50 μgのタンパク質をロードします。

3. 超遠心分離による細胞壁および細胞膜タンパク質の単離

  1. Rajaらによるプロトコルに従って、全細胞ライセートから細胞壁、細胞膜、および細胞質ゾルタンパク質を単離します9。以下で説明します。
  2. 全細胞ライセートを13751 × g で4°Cで30分間遠心分離し、細胞壁タンパク質をペレットとして分離します。
  3. 超遠心分離機を使用して、上清を4°Cで100,000 × g で4時間超遠心分離し、細胞膜タンパク質をペレットとして分離し、細胞質ゾルタンパク質を上清に残します。
  4. BCAタンパク質アッセイを使用して、細胞壁および細胞膜画分中のタンパク質濃度を推定します。
    注:SDS-PAGE分析では、分析用に50 μgのタンパク質をロードします。分離された細胞壁と細胞膜は、さらなる分析まで-80°Cの冷凍庫に保管されます。

4. 分取液相等電点集束(ロトフォー[IEF装置])

  1. 超遠心分離によって単離された細胞壁および細胞膜タンパク質を、8 M尿素、1 mM DTT、5%グリセロール、2%ジギトニンを含むIEFバッファーに可溶化します。
  2. 2%の両性電解質(pH 3.0〜10.0およびpH 4.0〜6.0を1:4の比率で添加)
  3. 冷却水浴で4°Cに維持された液体IEFシステムを使用して、可溶化タンパク質を分別します。
  4. メーカーの指示に従ってIEF分離を行い、電圧が安定するまで(1300 Vから1600 Vの間)12 Wの定電力を印加します。
  5. 電圧安定化後、さらに30分間IEF実行を継続し、合計実行時間は約5〜6時間です。
  6. 真空ポンプを使用して個々のIEF画分を収集し、それらのpH値を測定します。
  7. 分離した画分(50 μg)をSDS-PAGEにかけ、クマシーブリリアントブルー(CBB)または銀染色を使用してタンパク質を視覚化します。分離したIEF画分は、さらに分析するまで-80°Cの冷凍庫に保管します。

5. 分取SDS-PAGEおよび全ゲル溶出

  1. IEFで分離した細胞壁および細胞膜画分を6x SDS-PAGEサンプルバッファーと混合し、SDS-PAGE分析の前に95°Cで5分間加熱します。
  2. 12.5%の分離ゲルと4%のスタッキングゲルからなる16 cm 20 cmのポリアクリルアミドゲルを使用して、2次元でタンパク質画分を分離します。
  3. サンプルのロードには、長さ13cmのサンプルウェルを1つ使用します。
  4. 色素の前面がゲルの底に到達するまで、50 mA/ゲルの定電流で電気泳動を行います。
  5. 電気泳動実行後、溶出バッファー(60 mM Tris、pH 9.4;40 mM 3-(シクロヘキシルアミノ)-1-プロパンスルホン酸[CAPS])でゲルを平衡化します。
  6. 機器メーカーの説明に従って、ゲルをゲル溶出装置全体に移します。
  7. 溶出器を250 mAの定電流で1時間流すことにより、ゲルからタンパク質を溶出します。
  8. 真空ポンプを使用して、各ゲルからそれぞれ3 mLの容量を持つ約30個のタンパク質画分を収集します。
  9. BCAタンパク質アッセイを使用して、溶出画分中のタンパク質濃度を定量します。
  10. 溶出画分の10μgをSDS-PAGE分析に被験者し、クマシーブリリアントブルー(CBB)染色で視覚化します。
    注:分離された全ゲル溶出画分は、さらなる分析まで-80°Cの冷凍庫に保管されました。

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結果

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高速超遠心分離による細胞壁および細胞膜タンパク質の単離
細胞壁および膜タンパク質は、プロトコルに概説されているように、超遠心分離を介して全細胞ライセートから単離されました。結 核菌 の分離された細胞内画分-細胞壁、細胞膜、および細胞質ゾルタンパク質プロファイルのSDS-PAGE分析を 図1に示します。

分取液相等電点集束による細胞壁タンパク質の分離
結核菌細胞壁タンパク質は、プロトコルに記載されているようにIEFバッファーを使用して可溶化した。可溶化したタンパク質は、等電点に基づいて20の画分に分離されました。図2は、IEFで分離された細胞壁画分のpHプロファイルを示しています。タンパク質プロファイルを示すこれらの画分のSDS-PAGE分析を図3に示します。

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ディスカッション

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細胞壁および膜タンパク質の疎水性は、それらの可溶化と分離において重大な実験上の課題を提示します。上記のプロトコルでは、これらの疎水性タンパク質を効果的に単離するための新しい二次元電気泳動ベースの分離方法について説明しました。このプロトコルでは、最初に液体IEFシステムを使用して、膜タンパク質と細胞壁タンパク質を等電点に基づいて分離しました。可溶化の問題を解決するために、高濃度のカオトロピック剤(尿素)と界面活性剤(デジトニン)を使用し、これらのタンパク質の可溶化を促進し、初期分離時に可溶化の問題なしに高濃度のタンパク質をロードすることを可能にしました。さらに、これらの可溶化剤は、分別に使用されるIEFバッファーに不可欠であり、タンパク質サンプルのさらなる希釈を防ぐことができるという利点があります。

IEFで分離した画分は、SDS-PAGE手順を使用して分子量によって再び分離されました。その後、SDS-PAGEで分離されたタンパク質を、Tris-CAPSバッファーを含む全ゲル溶出器を使用して溶出しました。この方法の主...

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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この研究は、KR Uma Devi 博士の DST SERB 助成金によって完全にサポートされています。B. ラマリンガム博士は、DBT-ラマリンガスワミ フェローシップから資金提供を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
7H9ブロス ヒメディア M198
40% バイオライト 3/10 アンフォライト バイオラッド1631113
BCAタンパク質アッセイ メルクBCA1
Bio-Lyte 5/7 アンフォライト バイオラッド1631152
遠心濃縮器 3 kDaメルクZ629456
デジトニン。メルクD141
ドナーゼメルク11284932001
DTTのメルクD9779
EDTAのメルクE9884
エグタメルクE3889
グリセロールメルクG5516
ロイペプチンメルクE18
ペプスタチンAメルクP5318
PMSFメルク78830
ルナーゼメルク10109134001
ロトフォー バイオラッド170-2986 等電点集束(IEF)装置
ソニケーターVibra-Cell、ソニックスVC750
TLCKのメルクT7254
TPCKのメルク4376
尿素メルクU5378
全ゲル溶出装置 バイオラッド1651250

参考文献

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  1. Seshadri, C., Turner, M. T., Lewinsohn, D. M., Moody, D. B., Van Rhijn, I. Lipoproteins are major targets of the polyclonal human T cell response to Mycobacterium tuberculosis. J Immunol. 190 (1), 278-284 (2013).
  2. Kunnath-Velayudhan, S., et al. Dynamic antibody responses to the Mycobacterium tuberculosis proteome. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14703-14708 (2010).
  3. Drage, M. G., et al. TLR2 and its co-receptors determine responses of macrophages and dendritic cells to lipoproteins of Mycobacterium tuberculosis. Cell Immunol. 258 (1), 29-37 (2009).
  4. Wallin, E., von Heijne, G. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Sci. 7, 1029-1038 (1998).
  5. Almeida, J. G., Preto, A. J., Koukos, P. I., Bonvin, A. M. J. J., Moreira, I. S. Membrane proteins structures: A review on computational modeling tools. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1859 (10), 2021-2039 (2017).
  6. Finkelstein, J. Structures of membrane proteins. Nature. 511 ((Suppl 7509)), 21(2014).
  7. Smith, S. M. Strategies for the purification of membrane proteins. Methods Mol Biol. 1485, 389-400 (2017).
  8. Von Jagow, G., Link, T., Schager, H. Purification Strategies for Membrane Proteins. A Practical Guide to Membrane Protein Purification. , Academic Press. San Diego, CA. (1994).
  9. Raja, A., Uma Devi, K. R., Ramalingam, B., Brennan, P. J. Immunoglobulin G, A, and M responses in serum and circulating immune complexes elicited by the 16-kilodalton antigen of Mycobacterium tuberculosis. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 308-312 (2002).
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  12. Sinha, S., et al. Immunogenic membrane-associated proteins of Mycobacterium tuberculosis revealed by proteomics. Microbiology. 151 (7), 2411-2419 (2005).
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