方法論記事

その場で分離チップを用いた難治性土壌細菌の分離と培養 (iChip)

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DOI：

10.3791/67692

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2025年8月6日

 ,  , ADSB-2024 Participant Cohort,  , 
1Department of Bioscience and Bioengineering, Indian Institute of Technology-Jodhpur, 2Department of Microbiology, Molecular Genetics, and Immunology, University of Kansas Medical Center

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、自然環境における難治性土壌微生物の in situ 培養のための分離チップ(iChip)の設計と使用について説明しています。また、抗菌剤を産生する土壌細菌の その場 培養についても説明しています。このプロトコルは、他の望ましい特性を持つ多様なニッチから細菌を回収するように適応させることができます。

要約

生態系には何百万もの環境微生物が生息しており、その中には酵素、ビタミン、アミノ酸、有機酸、抗寄生虫剤、抗菌剤などのバイオテクノロジーに関連する製品を生産できるものもあります。これらの環境細菌のほとんどは、実験室での培養方法が栄養/環境要件を満たしていないため、「培養不可能」と見なされます。さらに、それらは自然界に共存しているため、微生物群集の別のメンバーによって生成される栄養素/代謝産物にも依存している可能性があります。「培養されていない」微生物の多様性を培養物に持ち込むことで、微生物がコードする可能性のある膨大な数の生理活性製品を探索する機会が得られます。この記事では、「培養不可能な」細菌のハイスループットの in situ 培養のために開発されたマルチチャネル拡散チャンバーである iChip テクノロジーの実装について説明します。抗菌薬耐性の世界的な脅威を考慮して、この記事では、例として、抗菌剤を生産できる微生物「ダークマター」からの分離株の in situ 培養と回収のための詳細なプロトコルを提供します。このプロトコルは、土壌サンプルの収集ステップから分離株の回収まで、関連するステップを説明し、分離の成功に影響を与える可能性のあるもっともらしい要因を強調しています。この技術を使用すると、抗生物質の発見のために「培養不可能な」細菌の分離が容易になるだけでなく、研究者は複雑な土壌生態系を掘り下げることができ、それを他の無数の用途に活用できるようになります。

概要

これまで未踏の微生物の豊富なリポジトリは、土壌、水域、極限環境などの自然環境に存在します。しかし、微生物のほとんどは従来の実験用培地や方法では簡単に培養できないため、この膨大な微生物の生物多様性を利用することは困難です。大きなプレート数異常は、この現象を表しており、視覚的に観察できる微生物と培地1で増殖することが観察される微生物の数が一致していないことを強調しています。この障壁を回避し、培養不可能な微生物とその製品へのアクセスを可能にすることで、さまざまなバイオテクノロジーのニーズに対応できる可能性があります。

たとえば、抗菌薬耐性の発生は、世界の公衆衛生に対する脅威となっています。大手製薬会社は新しい抗菌薬の発見を追求することに消極的であり、既存の抗生物質に対する耐性の出現率と比較して発見率が低下しています2,3。したがって、新しい抗菌薬の発見が決定的に必要とされています4。微生物群集は同時に、または競合して進化してきたため5、生存の可能性を高める新しい化合物を生成する可能性を発達させてきました。従来の実験室培養ベースの方法では、同様の既知の微生物の分離につながることが多いため、環境微生物とその生成物の膨大な多様性は十分に調査されていません。これは、従来の培地や方法が人間に関連する微生物の培養に偏っており、自然環境を模倣できないためです。環境微生物を培養するための培地の設計は、一部の種の増殖には、多くの場合、近くの他の微生物によって生成されるさまざまな栄養素や特定の環境条件を必要とする場合があるため、困難です。

この問題に対処し、その 場で環境微生物を培養するために、最初に拡散チャンバーが開発されました6。拡散チャンバーはステンレス鋼のOリングです。リング内のスペースは、適切なサンプル希釈で播種された寒天で満たされます。次に、リングの上部と下部はポリカーボネート膜で密閉され、他の微生物のチャンバーへの浸透を防ぎながら、土壌由来の栄養素と代謝産物の拡散を可能にします6。播種後、プレートはサンプルが収集される環境に置かれ、 その場で培養されます。拡散チャンバーは非常に効率的で、これまで培養できなかった多数の微生物を培養することができました。しかし、寒天を使用したOリング設計は手間がかかり、スループットが低くなり、さらなる革新のための問題の余地が残されました6。その後まもなく、その 場培養 と純粋培養物の同時ハイスループット回収が可能な単離チップ(iChip)が設計されました7。この設計は、概念的には拡散チャンバーと同じですが、各チャネルが独立した拡散チャンバーとして機能する複数のチャネルで構成され、各チャンバー8から単一のマイクロコロニーを回収する可能性があります。拡散室設計の再考により、技術のスループットが大幅に向上し、土壌、海水9、温泉10などから、より多様な分類群の分離と培養が可能になりました。最近報告された抗生物質であるテイキソバクチンは、上記の技術に従って発見されました11.これは抗菌作用の新しいメカニズムを示し、侵襲性感染症を引き起こす病原体に対して致死的であることが判明し、微生物の「ダークマター」からの微生物のハイスループット単離が、この技術を使用してバイオテクノロジーに関連する天然物の発見のために効率的に合理化できることを実証しました12。

この記事は、土壌微生物の「ダークマター」から抗菌剤を産生する難治性細菌をその 場 で培養および回収するためのこのハイスループット技術を効果的に実装するための手順ガイドとして機能します。このプロトコルは、単離チップの設計、サンプルの収集、サンプル調製、播種、インキュベーション、および回収の概要を示しています。提示されたプロトコルは、土壌からの微生物の in situ 培養を示していますが、同じことを任意の環境からの微生物の in situ 培養に容易に適応させることができます。この技術のハイスループット機能により、新しい微生物を発見し、その生合成の可能性をさまざまなバイオテクノロジー用途に活用する可能性が高まる可能性があります。

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プロトコル

1. デザインと3Dプリント

  1. サンプルの種類、拡散チャンバーあたりの容量、使用するメンブレンの寸法、および必要なスループット(拡散チャンバーの数)に基づいて、設計とサイズを選択します。
    注:中央プレートの厚さと各チャネルの直径によって、各円筒形拡散チャンバーの体積が決まります。サイズは、収容する個々の拡散チャンバーの数に依存し、メンブレンの寸法は、カバーされる拡散チャンバーの数に直接依存します(図1)。
  2. プレゼンテーション ソフトウェア プログラムの [図形 の挿入 ] オプションを使用して、iChip として機能するために必要な寸法の円を挿入します。チャネルを表すために、中に小さな円を挿入します。小さな円を希望のパターンに配置して、上部/下部と中央のプレートの予備設計を準備します。デザインを選択し、右クリックメニューを使用して、予備デザインを画像として保存します。
  3. 予備設計をテンプレートとして使用し、コンピュータ支援設計 (CAD) ソフトウェアを使用して 2 次元 (2D) 設計の作成を開始します。
    1. スケッチ メニューから、定義済みの形状 (主に円) を挿入して、プレートとチャネルの配列の基本デザインを作成します。
    2. 寸法オプションを使用して、プレートとチャネルの実際の寸法を設定します。[ OK ] をクリックして設計を完成させ、押し出し機能を使用して 2D 設計を希望の厚さの 3D モデルに変換します。
    3. 最後に、ファイル メニュー の [保存] を使用して、3D プリントと互換性のある光造形 (STL) ファイル形式で 3D モデルのコピーを保存します。
  4. 希望する滅菌方法や植栽場所などの要素を考慮して、希望する用途に基づいて印刷材料を選択します。例えば、滅菌にオートクレーブ滅菌を使用する場合や、温度の高い場所に植える場合は、耐熱性のある材料を選択してください。
    注:この実験の3Dプリンティングは、最大268°Cの高温に耐えることができるセラミックのような材料を使用して実行され、したがってオートクレーブ滅菌可能でした。
  5. 寸法 (詳細と解像度) と使用する材料に応じて、適切な 3D プリント方法を選択してください。
    注: 積層造形法である光造形を使用した 3D プリンティングでは、熱硬化性樹脂を紫外線 (UV) レーザーで硬化させることで複雑な構造を作成できます。ステレオリソグラフィーは、複数の材料に使用でき、優れた表面仕上げと高精細な解像度を可能にします。

2. 土壌サンプルの採取

  1. 任意のモバイルアプリケーションストアからサイトの一意の3ワードアドレスを提供することで、世界中の3 m x 3 mのサイトを識別できるジオコーディングモバイルアプリケーションをダウンロードしてインストールします。土壌サンプル採取の場所を特定します。次に、ジオコーディング モバイル アプリケーションを開いて、対象のサイトとその一意の 3 ワード アドレスを識別します。
  2. 一意の3語の住所、日付、時刻、サンプルを採取する深さ、気象条件、近くの動植物、サイトの露出、およびサイトの温度(希望の深さの地表と地下)を記録します。
    注:土壌には病原菌が含まれている可能性があります。したがって、適切な個人用保護具 (手袋、白衣など) を使用し、バイオセーフティ レベル 2 に適したプロトコルに従ってください。接触を最小限に抑えて、サンプルの汚染や暴露を防ぎます。土壌サンプルの取り扱いの前後に作業面を消毒します。
  3. シャベルに70%エタノールをスプレーし、きれいに拭いて除染します。土を集めるポリスチレン箱に70%エタノールを噴霧し、きれいに拭いて除染します。先に進む前に、残留エタノールを完全に乾燥させます。
    注:このプロトコルでは、ポリスチレンボックスを使用してサンプルを収集し、インキュベーションを実行しますが、必要に応じて、ガラスや金属の容器などの代替品を使用することもできます。
  4. 表土を露出させるために、表面から植物材料、落葉、石を取り除きます。以前と同じようにシャベルを再び除染し、表土を取り除き、地下3〜6インチの深さで土壌を評価します。定規を使用して、表面からの深さを測定します。表面滅菌シャベルを使用して、4〜5 kgの土を希望の深さからポリスチレンの箱に集めます。
  5. 箱を蓋で密封します。複数のサンプルを収集する場合は、相互汚染を避けるために、2つのサンプリングサイト間でシャベルを除染します。すべてのサンプルが収集されたら、すぐにサンプルをラボに持ち帰ります。

3. 播種のためのサンプル準備

  1. 採取した土壌サンプルから、破片、岩石、落葉のない土壌1 gを、10 mLの滅菌生理食塩水を含む滅菌50 mL遠心分離管に入れます。
    注:土壌サンプルの一部をグリセロールストック13,14として-80°Cで保存し、将来の要件に備えて天然微生物集団を保存します。
  2. 土壌と生理食塩水を約10秒渦巻きして混合し、土壌スラリーを作成します。遠心分離管を5分間放置して、チューブ内の大きな土壌粒子が落ち着くようにします。次に、上清土壌懸濁液を「S」とラベル付けされた新しい試験管に慎重に移します。
  3. 土壌懸濁液を原液サンプルとして使用し、サンプル1 mLを新鮮なチューブ内の滅菌生理食塩水9 mLに移すことにより、連続希釈を行います。10-1 から10-5までの希釈液を調製します。
    注:非選択的培地上の希釈した土壌懸濁液のプレートカウントは、サンプル中の細菌の密度に関するいくつかの洞察を提供することができ、播種に適切な希釈液を選択するために使用できます。ただし、これはサンプル中に存在する培養可能な細菌の推定値にすぎないことに注意してください。

4. 播種と組み立て

  1. バイオセーフティキャビネット内で、70%エタノールに10分間浸して、トッププレート、ボトムプレート、ミドルプレートの表面を除染します。プレートを滅菌脱イオン水で洗浄して余分なエタノールを洗い流し、滅菌ペトリ皿で自然乾燥させます。
  2. 中央のプレートを滅菌ペトリ皿に入れ、播種の準備をします。次に、SMS寒天培地を電子レンジで溶かし、冷ましてから、22.5 mLのSMS寒天培地を45°Cで50 mLの遠心分離管に移します。
  3. これに、土壌サンプルの適切な希釈液2.5 mLを加え、気泡の侵入を避けながら、穏やかな反転でよく混合します。
    注:播種には適切な希釈液を選択してください。10-4 希釈のような最終播種密度を達成するには、サンプルが播種に使用される培地でさらに10倍に希釈されるため、10-3 懸濁液を選択します。
    1. 播種希釈液を選択してチャンバーごとに1つの細胞を固定化し、その 場でコロニーに発達させることができます。
      注:蒸留水は、土壌環境を模倣し、そのような条件下でのみ増殖する微生物の増殖を可能にするために、SMS培地の代わりに使用することもできます。任意選択で、シクロヘキシミドのような抗真菌剤を、真菌の増殖を避けるために播種培地に添加してもよい。
  4. 播種したSMS寒天培地3〜4 mLを中央のプレートにゆっくりと注ぎ、表面全体を覆います。次に、SMS寒天培地を約5〜10分間硬化させます。SMS寒天培地が設定されているか確認してください。次に、滅菌カミソリの刃で、プレートの表面から余分なSMS寒天をこすり落とし、個々の拡散チャンバーに寒天プラグを残します。
  5. 0.03μmのポリカーボネート膜フィルターの1つから保護シートを剥がした後、滅菌鉗子を使用して天板の内側に慎重に置きます。次に、滅菌鉗子を使用して、播種された中間プレートの露出側に別の0.03μmポリカーボネート膜フィルターを配置します。
  6. 上部プレートと下部プレートを配置し、中央のプレートとポリカーボネート膜を挟み込み、すべてのプレートのネジ穴を位置合わせするように注意して、組み立てを完了します(図1B)。ナットとボルトを締めてアセンブリを固定します。
    注:播種せずに滅菌SMS寒天のみを使用して対照iChipを並行して組み立て、播種した寒天培地と一緒に土壌に植えてシールを確認することをお勧めします。これにより、環境からの微生物の侵入の可能性が排除され、ネガティブコントロールとして機能します。

5. 原地 栽培と回収

  1. 滅菌シャベルを使用して、ポリスチレンの箱に集められた土壌にiChipのサイズよりも大きなくぼみを作成します。アセンブリをくぼみ内に垂直に植え、土をしっかりと詰めて、すべての表面が完全に覆われていることを確認します。次に、2〜4週間の所望の期間、 その場培養を可能にします 。インキュベーション中は、滅菌蒸留水を使用して定期的に土壌を湿らせ、拡散チャンバー内の播種されたSMS寒天プラグが乾燥するのを防ぎます。
    注意: アセンブリを垂直位置に配置すると、水平に植えられた場合に発生する可能性のある、通常の土壌湿潤中に拡散チャンバーからの継続的な水の浸透を防ぐことができます。
  2. 希望のインキュベーション後、植えたiChipの周りの土をそっと取り除いて回復します。次に、滅菌生理食塩水で洗浄して付着した土壌粒子を除去し、さらなる処理のためにバイオセーフティキャビネットに移します。
  3. アセンブリからナットとボルトを緩めます。その後、慎重に分解します。滅菌鉗子を使用して、ポリカーボネート膜を取り除き、中央のプレートを準備したペトリ皿に移します。
  4. 滅菌木製アプリケーターを使用して、各拡散チャンバー内の個々の寒天プラグを回収します。寒天プラグをSMS寒天や0.1xトリプシン大豆ブロス寒天培地などの適切な培地に接種して、実験室での栽培を試みます。
    注:培養分離株は、寒天オーバーレイ15などの日常的な方法によって抗菌産生についてスクリーニングすることができます。
  5. あるいは、 in situ で培養された難治性土壌細菌を含む回収された寒天プラグを染色して画像化し、 in situ 条件下でのマイクロコロニーの増殖を確認します。
    注:検出の感度を高めるために、砕いた寒天プラグは、細菌を染色する蛍光色素を使用して染色し、その後蛍光顕微鏡で染色することもできます。

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結果

このプロトコルで使用されるiChipは、 図1に示すように設計、3Dプリント、および組み立てられました。説明されているプロトコルの概要を 図2に示します。実験に使用された土壌サンプルは、インドのラジャスタン州にある IIT ジョードプル キャンパスから収集されました。その場所のユニークな 3 語の住所は「communicate.supervising.recurrence」でした。選ばれた場所は、サンプリング当日の気温が40°Cの半乾燥地帯でした。土壌サンプルは真夏に採取されました。サンプルは、表面下温度35°Cで深さ6〜7インチで無菌的に無菌で収集され、収集後24時間以内に処理されるラボに運ばれました。次に、それらを連続的に希釈し、トリプシン大豆寒天培地にプレーティングして、適切な希釈を推定しました。土壌の培養可能な微生物密度は、土壌の 8 ×10 6 CFU でした。土壌懸濁液の10-3 希釈液には、播種用に選択された~8 x 102 CFU / m...

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ディスカッション

地球上の数多くのユニークな生息地には、膨大な多様性を表す独特の微生物群集が生息しています。これは、栽培に必要な適切な生育条件の提供に限界があるため、未調査のままです。一部の細菌は、生存のために他の細菌から放出される代謝産物に依存しているため、実験室条件では独立して生き残ることができません。さらに、細菌は生物地球化学的サイクルを調整する上で重要な役割も果たしますが、これは実験室環境ではエミュレートできません。微生物の生物多様性とそれらがコードする新しい化学構造の大部分は、微生物の「暗黒物質」の培養不可能な部分で失われています。

現場栽培の概念は、この重要な問題を解決します。細菌は、栄養素や代謝産物の流入を可能にしながら汚染を防ぐ拡散チャンバーを使用して、自然の生息地で培養されます。このプロトコルは、iChip技術の実装、培養のための拡散チャンバーのハイスループットの進歩、およびあらゆる環境(この場合は土壌)からの培養不可能な細菌の純粋な培養確立のための手順上のガイダンスを提供します。

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開示事項

著者らは利益相反を明らかにしていない。

謝辞

A.V.は、インド政府の首相研究フェローシップ(PMRF)プログラムによって支援されました。V.V.は、インド政府科学技術省によるInnovation in Science Pursuit for Inspired Research Fellowship(INSPIRE)プログラムの支援を受けました。I.B.の訪問は、USIEFのフルブライトAPEフェローシップによって部分的に資金提供されました。著者らは、この作業のための後方支援とインフラの提供に対して、生物科学・生物工学部とインド工科大学ジョードプル校に感謝しています。Sudarshna Negi 博士、Aastha Kapoor 氏、Tamal Dey 氏、Bharat Pareek 氏、Ajeet Singh 氏、および IIT ジョードプルの微生物生理学研究所の他のメンバーからの技術支援に感謝します。

ADSB-2024 参加者コホート

ジョードプルのインド工科大学生物科学・生物工学部で開催された、土壌細菌における抗生物質発見 (ADSB) 2024 の短期コースの参加者コホート (名前はアルファベット順にリストされています):

アビナシュ・クマール・イェナ、バニシュリー・ジャリ、バーラト・グルナニ、バーラト・パリーク、ディプロ・ムケルジー、ガリマ・カンワル・シェカワット、GTヴィシュヌ、ジャイタ・サルカル、クリシュナ・サハラ、クリティ・シンガル、レク・ラージ、ミッタ・ビンドゥスリー、プーレン・サルマ、プリヤンカ・クマリ、ラチャナ・ディネシュ、サティエンドラ・シン、スワティ・スジス

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3D プリンターProtolabs、米国1631-8333D プリンティング サービス プロバイダー
アガロース Himedia、インドMB002地成分
カサミノ酸Sisco、インド68806地成分
カゼイン消化 ASES、インドC5890メディアコンポーネント
ポリカーボネート膜Sterlitech、米国PCT00347100消耗品
ポテトスターチHimedia、インドGM403メディアコンポーネント
PowerPointMicrosoft、米国N/AiChip コンポーネントの作成に使用 予備設計
PTC CreoPTC、米国N/A3D コンピュータ支援に使用iChipコンポーネントのモデリング
Tryptic Soy BrothHimedia, IndiaM011実験用培地
What3WordsWhat3Words, UKN/A サンプリング場所の座標の記録に使用
培培

参考文献

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