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方法論記事

ヒト腸オルガノイドの神経支配

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DOI:

10.3791/67702

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2025年1月17日

 ,  , 
1Program in Children's Regenerative Medicine, Department of Pediatric Surgery, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston

この記事について

サマリー

ヒト腸オルガノイドは、天然のヒト腸の構造と機能をよりよく再現するために神経支配されなければなりません。ここでは、これらの構築物に腸神経系を組み込むための1つの方法を紹介します。

要約

腸の細胞構造と機能の複雑さは、バイオエンジニアリングされた小腸の創作に大きな課題をもたらします。ヒトの小腸に似たヒト腸オルガノイド(HIO)を生成する技術は、これまでに報告されています。HIOには上皮と間葉が含まれていますが、腸神経系(ENS)、免疫細胞、血管系、マイクロバイオームなど、機能的な腸の他の重要な構成要素が欠けています。2つの独立した研究グループが、ENSでHIOを神経支配する独自の方法を発表しました。ここでは、ENSをHIO由来のバイオエンジニアリング小腸に組み込む独自の方法について説明し、これらの先行報告のコンポーネントを利用して、前駆細胞の同一性と発生タイミングを最適化します。

ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、公開されたプロトコルごとに数日間にわたって分化マーカーの時間的調節により、HIOと腸管神経堤細胞(ENCC)を独立して生成するように分化されます。HIOが中後腸スフェロイド段階(約8日目)に達すると、15〜21日目のENCCスフェロイドは解離し、HIOと共培養され、透明な3次元(3D)基底膜マトリックス液滴内に浮遊します。HIO+ENCC共培養は、さらなる開発および成熟のために、>9週齢の免疫不全マウスに移植する前に、28〜40日間 in vitro で維持されます。ENSで移植されたHIO(tHIO)は、4〜20週間後に収穫できます。この方法は、hPSCから生成されたENCCを利用し、発生の初期段階でHIOと共培養することにより、以前に発表された2つの技術の要素を統合し、より成熟した腸の形態の形成に寄与する可能性のある初期の発生手がかりへの曝露を最大化します。

概要

ヒトの小腸は、消化、栄養吸収、体液調節、免疫バリア機能、運動性など、数多くの重要な機能を担う複雑で多層的な器官です。短腸症候群、腸疾患、運動障害などの多くの臨床疾患は、腸の質量の重大な減少または正常な生理機能の混乱を特徴とし、重大な罹患率と死亡率につながります1,2,3,4。現在の治療選択肢には、腸の長さが短くなり、それによって残りの腸の機能的能力が減少する代わりに、機能不全の腸を切除する手術が含まれることがよくあります5。現在の治療パラダイムでは達成できない方法で、機能的な腸の能力を高め、腸の機能を回復させる、本質的に相加的な再生治療が必要です。

バイオエンジニアリングされた小腸は、これらの課題に対する有望な解決策です。ヒト多能性幹細胞(hPSC)に由来するヒト腸オルガノイド(HIO)は、バイオエンジニアリングされた小腸の出発物質の1つです。2011年、Spenceらは、H1およびH9ヒト胚性幹細胞(hESC)および複数のヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)株を含むhPSC株からの最新のHIOの作成に成功したことを初めて報告しました6,7。彼らのプロトコルには、ヒト胎児の腸の発達を模倣するための特定の成長因子を用いた、慎重にタイミングを合わせた一連のインキュベーションが含まれていました。TGFβシグナル伝達分子であるアクチビンAは、hPSCの分化を内胚葉運命に向けて促進し、続いてWnt/FGFによる指向性後方パターニングを促進します。これらの条件下では、hPSCは自己組織化して、分極した上皮と間葉を含む腸内スフェロイドを形成します。基底膜マトリックス内での3D培養により、さらなる開発が可能になり、内部に内腔を持つオルガノイド、上皮の絨毛様退縮、および陰窩様構造内の自己再生前駆細胞ニッチが得られます。

このオリジナルの 2011 年のプロトコルを使用して生成された HIO は、構造的には天然の腸に似ていますが、腸神経系 (ENS) のニューロンまたはグリアを生成する能力が不足しています。2017年には、2つの主要な論文で、HIOを神経支配する類似しているが異なる方法が説明されました。ENS前駆細胞(腸管性神経堤細胞、ENCC)はhPSCに由来します。培養では、ENCCは3Dニューロスフェアを形成し、適切な条件下で腸内ニューロンとグリアに分化することができます。Workman氏とMaheらは、hPSCからENCCを誘導するように既存のプロトコルを変更し、それらをFGFが豊富な培地で処理し、続いてレチノイン酸で2日間処理して、迷走神経運命の事後化と促進を行いました8,9。6日目のニューロスフェアをRAなしでさらに4日間インキュベートし、その後、酵素的剥離後に遊走細胞を採取した。約20,000〜50,000のENCCを初期の中腸スフェロイドと凝集させ、これらのENCC播種腸スフェロイドを透明な3D基底膜マトリックスで28日間in vitroで増殖させ、免疫不全マウスの腎臓カプセルに6〜10週間in vivoで生着させました。得られたHIO+ENSは、上皮および間葉系成分、ならびに神経節に類似した神経膠構造の有意な成熟を示したが、これは天然腸よりも細胞体密度が低く、特定の臨床的に関連するニューロンサブタイプ(すなわち、移植後のHIO+ENSにおけるCHAT陽性ニューロン)の欠如、および全体的な胎児様特性を示すものであった。

同年、Schlieveらは、免疫不全マウスの大網に3ヶ月間in vivo移植した時点で、40〜60個の無傷の15日目ENCCニューロスフェアとより成熟したHIOsの混合物を含む代替方法を発表しました10。ENCC-HIO-TESI(組織改変小腸)と呼ばれる彼らの構築物は、WorkmanとMaheのHIO + ENSよりも成熟したENS表現型を含んでおり、HIO + ENSには見られないニューロンサブタイプの多様性と神経上皮シナプス接続が含まれているように見えました。重要なことに、Schlieveの実験で使用されたENCCは、Fattahi et al.11によって以前に説明したように、異なる方法で導出されました。簡単に説明すると、hPSC(hESCとhiPSCの両方)は、FGF2を濃縮した培地で神経堤誘導を受けました。これらの細胞もRAで治療して腸管迷走神経運命を確立しましたが、5日間(6〜11日目)は、ワークマンとマヘの2日間(4〜5日目)から増加しました。2019年、Barberらは、培養条件のより詳細な説明と、不一致を減らし、当時の細胞培養の好みの変化を反映するための定義された基礎培地への移行を含む、Fattahiプロトコルの改訂版を発表しました12。

以下で詳細に説明するHIOの神経支配方法は、Workman/MaheプロトコルとSchlieveプロトコルの両方の要素を組み込んでいます。SchlieveのENCC-HIO-TESIのENSは、ニューロンの多様性と神経膠細胞の統合が進んだため、より成熟しているように見えましたが、どちらの方法も機能的なENSをHIOに統合することに成功し、胃腸転写発現の変化が実証されました。Workman氏とMahe氏のHIO + ENSは、腸幹細胞および上皮細胞の発生に関連するいくつかの遺伝子の発現増加を誘導しましたが、これらはENCC-HIO-TESIでは変化しませんでした。これらの違いについて考えられる1つの説明は、プロトコル間でENCCとHIOが組み合わされた異なる時点です。当研究室では、早期の共培養では上皮分化や間葉分化に関与する複数の遺伝子の発現が増加し、共培養のタイミングが上皮細胞の多様性に影響を与えることが観察されています(未発表データ)。ENS前駆体がHIOsを発症する早期に曝露されたこと、 またはその逆 の曝露が、上皮の多様性やその他の初期発生過程を促進する未定義のシグナル伝達クロストークの時間を提供する可能性があります。

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プロトコル

ヒト胚性幹細胞(hESC)株H9はWiCell(ウィスコンシン州マディソン)から供給され、hESCを含むすべての実験はUTHealth Houston Stem Cell Research Oversight(SCRO)委員会(プロトコル #SCRO-23-01)によって承認されました。このプロトコルでは、コーティングされたプレートまたはウェルへのすべての言及は、hESC認定の3D基底膜マトリックスで調製されたものを指します。

1. 細胞培養の準備

注:私たちのラボではH9 hESCを使用していますが、H9 hESCs9、10、12、H1 hESCs9、hESCラインUCSF412、WTC1112、WTC11 AAVS1-CAG-GCaMP6f9、WTC10 9,10、WTC10 PHOX2B het (+/Y14X)9、WTC10 PHOX2B null(Y14X / Y14X)9などの複数のhiPSCラインが他のラボでHIOおよびENCCSの生成に成功しています。

  1. 適切な細胞培養培地で希釈した3D基底膜マトリックスで各ウェルをコーティングすることにより、6ウェルプレートを調製します(希釈係数と調製の手順は材料データシートに記載されています)。各ウェルをウェルあたり1 mLでコーティングし、37°Cで少なくとも1時間または一晩インキュベートして細胞をプレーティングする前にインキュベートします。
    注:このプロトコルは、1つのウェルからの細胞だけで完了することも、必要に応じてスケールアップすることもできます。未分化のhPSCのさらなる継代と維持を容易にするために、少なくとも3つのウェルをコーティングすることをお勧めします。
    ほとんどのマトリックスは室温で重合し始めるため、作業中は基底膜マトリックスを冷たく保つことが重要です。コーティングされたウェルは、37°Cで保存した場合、最大2〜3週間使用できます。 コーティングが乾燥するのを防ぐために、ウェル全体を覆うのに十分な希釈剤で保管してください。
  2. hPSC(理想的には低い通過数)を、温水浴で短時間渦巻いて解凍します。層流フードの下で、1バイアルの細胞を2 mLの幹細胞培地に再懸濁します(表1)。細胞をプレーティングする直前に、以前にコーティングした1つのウェルから6ウェル皿で希釈液を吸引し、再懸濁した細胞の2 mL全体をコーティングしたウェルに移します。未分化のhPSC(メンテナンスプレートと呼ばれる)のメンテナンスには、37°C、5%CO2でインキュベートし、ウェルあたり2 mLの幹細胞培地と1日おきに培地を交換します。
  3. 細胞が70〜80%のコンフルエント度に達したときに細胞を継代します。細胞を乱さずにウェルの側面から培地を吸引します。室温の幹細胞解離試薬1 mLをウェルに加え、1分以内に吸引すると、細胞上に液体の薄膜が残ります。プレートを37°Cで5分間インキュベートします。
    注:細胞が継代までの80%のコンフルエント度を超えるまで待つと、早期分化の問題を引き起こし、その後のステップでの収量が低下する可能性があります。
  4. 温かい幹細胞培地のウェルあたり1 mLを加え、プレートの側面を軽くたたいてコロニーを取り除きます。広口ピペットチップ付きのP1000マイクロピペット( 材料表を参照)を使用して培地を静かにピペットし、細胞の損傷を最小限に抑えながらコロニーを分断します。
    注:細胞懸濁液をトリチュレートするときは、大きな細胞の塊をバラバラにすることをお勧めしますが、小さなクラスターはそのまま残すことをお勧めします。単一細胞懸濁液に到達することは推奨されませんが、ウェル全体に均等に広がる少数の小さなコロニーを目指すことをお勧めします。
  5. 6ウェル皿で以前にコーティングしたウェルから希釈液を吸引し、2 mLの温かい幹細胞培地を加えます。hPSCコロニーを維持するために、必要な量の細胞懸濁液をこのウェルに移し、ウェルあたり2 mLの幹細胞培地で培地を隔日で交換します。
    注:当研究室では、週に一度hPSCメンテナンスプレートの継代を可能にするために、通常50〜150μLの容量を移します。この容量は、特定のhPSCラインと通路番号によって異なる場合があるため、調整が必要になる場合があります。残りのセルを使用して、ENCC 生成 (セクション 2) または HIO 生成 (セクション 3) を開始します。新たに解凍したhPSCは、ENCC世代またはHIO世代に進む前に、少なくとも2回通過させる必要があります。

2. ENCCの生成

注:ENCC生成の方法は、Fattahi研究室によって説明され、Schlieveらによって使用された方法と密接に関連しています10。Barber et al.10,12 の「腸内神経堤 (ENC) 誘導 (0-12 日目)」および「ENCC スフェロイド形成 (12-15 日目)」のセクションを通じて、プロトコル オプション B のわずかに変更されたバージョンを利用します。

  1. 新しい6ウェル皿で以前にコーティングしたウェルから希釈液を吸引し、2 mLの温かい幹細胞培地を加えます。ステップ1.5のhPSC細胞懸濁液850μLを同じウェルに移します(通常、継代比は5:6)。
  2. 細胞を37°C、5%CO2に維持します。ウェルあたり2 mLの幹細胞培地を隔日で交換し、密度が60〜80%に達するまで交換します。その後、プレートはENC誘導を開始する準備が整います。
  3. ENCインダクション
    1. 0日目。ウェルの側面から培地を吸引し、2 mLの温かいカクテルA培地を加えます(表1)。48時間インキュベーターに戻ります。
    2. 2日目。ウェルの側面からカクテルA培地を吸引し、2 mLの温かいカクテルB培地と交換します(表1)。48時間インキュベーターに戻ります。
    3. 4日目。ウェルの側面からカクテルB培地を吸引し、2mLの新鮮で温かいカクテルB培地と交換します。48時間インキュベーターに戻ります。
    4. 6-12日目。カクテルB培地をウェルの側面から吸引し、2 mLの温かいカクテルC培地と交換します(表1)。インキュベーターに戻り、12日目のENC導入が完了するまで、48時間ごとに2mLの新鮮で温かいカクテルCと培地を交換します。
      注:この段階では、ENC系統は、Barberら12によって記載されているように、遺伝子発現分析によって確認することができます。
  4. ENCCスフェロイド形成
    1. 13日目。井戸の側面からカクテルCメディアを吸引します。温かい酵素細胞剥離試薬1 mLを加え、37°Cで30分間インキュベートします。プレートの側面を軽くたたいて細胞を取り出し、広口ピペットチップを使用して細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移します。1 mLのNeural Crest Cell(NCC)培地(表1)でウェルを洗浄し、15 mLのコニカルチューブに洗浄液を加えます。
    2. 15 mLコニカルチューブ内の細胞懸濁液を300 × g で1分間遠心分離します。上清を吸引します。ペレットを2 mLの温かいNCC培地に穏やかに再懸濁します。
    3. 再懸濁した細胞を超低結合プレートの新しいコーティングされていないウェルに加え、37°C、5%CO2 で48時間インキュベートします。
    4. 15-21日目。ENCCスフェロイドの増殖をモニタリングし、48時間ごとに培地を2 mLの新鮮で温かいNCC培地と交換します。
      注意: メディアの交換は、ENCCスフェロイドの損傷や誤嚥を避けるために注意して実行する必要があります。これは、プレートを円を描くように渦巻かせてスフェロイドをウェルの中央に集中させ、ウェルの端から培地を吸引することで最もよく達成されます。
      ENCCスフェロイドの形成は通常15日目までに完了しますが、中腸スフェロイドとの共培養の理想的なタイミングに対応するために、21日目まで培養しても問題ありません。

3. HIOの生成(中腸スフェロイド期)

注:HIO生成のための我々の方法は、基本的にMcCrackenらおよびSpence and Wells研究室の他によって詳細に説明された元のプロトコルと同じです6,7。このプロセスは、決定的内胚葉(DE)誘導と中腸スフェロイド形成の2つのフェーズで発生します。

  1. HIO生成の準備
    1. 適切な細胞培養培地で希釈した3D基底膜マトリックスで各ウェルをコーティングすることにより、24ウェルプレートを調製します(希釈係数と調製の手順は材料データシートに記載されています)。各ウェルをウェルあたり500 μLでコーティングし、37°Cで少なくとも1時間または一晩インキュベートして細胞をプレーティングする前に固めます。
      注:ほとんどのマトリックスは室温で重合し始めるため、作業中は基底膜マトリックスを冷たく保つことが重要です。コーティングされたウェルは、37°Cで保存した場合、最大2〜3週間使用できます。 コーティングが乾燥するのを防ぐために、ウェル全体を覆うのに十分な希釈剤で保管してください。
      上記の6ウェルhPSCメンテナンスプレートから、1ウェルごとに24ウェルプレートの6ウェルをコーティングする計画を立てます。この比率は、必要に応じてスケールアップできます。
    2. 以前にコーティングされたすべてのウェルから希釈液を24ウェル皿で吸引します。ステップ1.5からhPSC細胞懸濁液に十分な温性幹細胞培地を添加し、各ウェルに500μLを分配します(例えば、hPSCメンテナンスプレートを継代した後に850μLのhPSC細胞懸濁液が残っている場合、24ウェルプレートの6ウェルに対して、ステップ1.5のhPSC細胞懸濁液850μLと2,150μLの温かい幹細胞培地を混合します。 500μLを6ウェルのそれぞれに分散)。
      注:通常、hPSCメンテナンスプレートを50〜150μLの容量で通過するため、このステップでは通常850〜950μLの容量を利用できます。したがって、24ウェルプレートのウェルあたりのhPSCの量は、約150μL/ウェルです。
      新しく調製した24ウェルプレートをインキュベーターに配置したら、プレートを前後(北から南、東から西)に穏やかに攪拌して、細胞をウェルの底全体にできるだけ均等に分布させます。
    3. 細胞を37°C、5%CO2に維持します。ウェルあたり500μLの幹細胞培地で、密度が50〜70%に達するまで、隔日で培地を交換します。その後、プレートはDE誘導を開始する準備が整います。
      注:DE誘導の前に細胞が>70%のコンフルエンシーに達しないことが重要です。これは、コンフルエンシーが高いと、その後の段階で内胚葉密度と後腸の形態形成に悪影響を与えるためです。理想的には、細胞は指定された継代率で24〜48時間後に約50〜70%のコンフルエントに達します。
  2. DEインダクション
    1. 1日目。hPSCが50〜70%のコンフルエント度に達したら、各ウェルから幹細胞培地を完全に吸引し、ウェルあたり500 μLの温かいDay 1 DE培地(表1)と交換します。37°C、5%CO2 で24時間インキュベートします。
    2. 2日目。Day 1 DEを吸引し、ウェルあたり500 μLの温かいDay 2 DE(表1)培地と交換します。37°C、5%CO2 で24時間インキュベートします。
    3. 3日目。Day 2 DEを吸引し、ウェルあたり500 μLの温かいDay 3 DE(表1)培地と交換します。37°C、5%CO2 で24時間インキュベートします。
  3. 中後腸スフェロイド形成
    1. 4-8日目。各ウェルから培地を完全に吸引し、ウェルごとに500 μLの温かい中後腸培地(MHGM、 表1)と交換します。37°C、5%CO2でインキュベートします。このステップを8日目まで毎日繰り返し、その時点で中腸スフェロイドの収集と共培養の準備が整います(セクション4)。

4. 中腸スフェロイドとENCCの共培養

注: このセクションの図の概要を 図 1 に示します。

  1. ENCCサスペンションの準備
    1. ステップ 2.4.4 から 15-21 日目の ENCC スフェロイドを収集します。ウェルから培地を慎重に除去することにより、そのステップの注に記載されているスワール法を使用してスフェロイドを吸引することを避けます。
    2. 温めた酵素細胞剥離試薬1 mLをウェルに加え、37°Cで30分間インキュベートします。
    3. プレートの側面を軽くたたいてスフェロイドの解離を続け、先端が広口のP1000マイクロピペットでピペッティングをゆっくりと上下させて、混合物が均一になるまで細胞の塊を分解します。
    4. ENCC懸濁液を15mLコニカルチューブに移します。ウェルを1 mLの温かいNCC培地( 表1を参照)で洗浄して、残りの細胞を採取し、これを15 mLのコニカルチューブに加えます。
    5. 細胞懸濁液を300 × g で1分間遠心分離します。滅菌ピペットチップで上清を吸引します。
    6. 広口ピペットチップを使用して、細胞ペレットを温かいNCC培地1 mLに再懸濁します。ENCC懸濁液の濃度を、血球計算盤またはセルカウンターを使用して計算します。
  2. ENCC懸濁液と中腸スフェロイドの組み合わせ
    1. 広口ピペットチップを使用してHIOプレートのすべてのウェルから中後腸スフェロイドを採取し、15 mLのコニカルチューブに移します。
    2. 24ウェルプレート内で使用される共培養ウェルの数を決定します。共培養のために、ウェルあたり10〜30個の中腸回転楕円体と50,000〜100,000個のENCCをプレートすることを目指しています。
      注:実際には、健康なスフェロイドを持つウェルの数と、共培養に必要な最終的なウェル数との間には、1対1の関係があることがよくあります。血球計算盤は、収集された中腸後腸スフェロイドの濃度を計算するためにも利用できます。
    3. 計算された量のENCC懸濁液を追加して、計画された共培養井あたり50,000〜100,000個のENCCを中腸スフェロイドを備えた円錐管に送達します。広口のピペットチップで優しく回転させ、中腸後腸スフェロイドとENCCを均一に混合します。
    4. 300 × g で1分間遠心分離し、滅菌ピペットチップで上清を慎重に吸引します。広口ピペットチップを使用して、細胞ペレットを、フェノールを含まない(透明)成長因子を減少させた低温の基底膜マトリックス(最終共培養ウェルあたり30 μL)に再懸濁します。
      注:再懸濁中に透明な基底膜マトリックスに気泡を形成することは、除去が困難であり、HIO + ENCC共培養による培地の適切な吸収を妨げ、HIO + ENCC共培養の成長に伴う視覚化を低下させるため、避けてください。
    5. 各ドライウェルの中央に、再懸濁した中腸スフェロイド+ENCCの30μL液滴を、周囲の培地のない透明な基底膜マトリックスにピペットで移します。すべての液滴がウェルに播種されたら、プレートを覆って反転させます。インバートして37°C、5%CO2 で30分間インキュベートします。
      注:このステップにより、透明な3D基底膜マトリックスの重合中に、中腸後部のスフェロイドとENCCがプレートの底から離れて浮遊する時間が与えられます。
  3. インビトロ HIO+ENSの共文化
    1. 0日目:透明な基底膜マトリックスが重合したら、各液滴を温かい0日目から3日目のHIO培地500μLで覆います( 表1を参照)。
    2. 3日目:透明な基底膜マトリックス液滴を乱さずに、ウェルの側面から0〜3日目のHIO培地を慎重に吸引します。メディアを500 μLの温かいDay 3-14 HIOメディアと交換します( 表1を参照)。プレートをインキュベーターに戻します。この段階では、3〜4日ごとにメディアを交換します。
    3. 7〜14日目:必要に応じて3〜14日目のHIOメディアを3〜4日ごとに交換し続け、成長を監視します。
  4. HIOの分割
    1. 14日目:顕微鏡で各ウェルを注意深く調べ、透明な各3D基底膜マトリックス液滴に発生中のHIO + ENSがいくつあるかを評価します。
    2. 2 mLの微量遠心チューブに30 μLの透明な基底膜マトリックスを入せて調製し、氷上に保存します。
    3. 層流フードの下で、細い鉗子を使用して、懸濁したHIO + ENSで透明な3D基底膜マトリックス液滴を慎重に除去します。個々のHIO + ENSをそっと引き離します。
      注:この段階では、手術用ルーペや解剖顕微鏡が非常に役立ちますが、HIOは肉眼で大きく見えることが多いため、厳密には必要ではありません。
    4. 分離された各HIO + ENSを、鉗子または広口ピペットチップを使用して、30μLの透明な基底膜マトリックスを含む準備された微量遠心チューブの1つに入れます。
      注:古い透明な3D基底膜マトリックスは、この段階で液化または溶解する必要はありません。可能であればHIOを混乱させないでください、ただし、これが発生した場合でも、後の段階で成長する可能性があります。
    5. 分割して再メッキされたHIO + ENSについて、手順4.2.5を繰り返します。透明な3D基底膜液滴が重合したら、500 μLの温かく新鮮なDay 3-14 HIO培地を各ウェルに加え、一晩インキュベートします。
  5. HIO+ENSの共培養は継続
    1. 15日目:3日目から14日目のHIO培地を井戸の側面から慎重に吸引します。メディアを500 μLの温かい15-28日目のHIOメディアと交換します( 表1を参照)。
    2. 15-40日目:必要に応じて15-28日目のHIOメディアを3〜4日ごとに交換し続け、HIO + ENCCの成長を監視します。

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結果

ENSは、蠕動運動、栄養吸収、体液輸送、上皮バリアの維持など、成熟した小腸の本質的な機能を調節します。したがって、HIOを神経支配する目標は、これらのコンストラクトに、より成熟した高レベルの機能を開発するために必要な要素を提供することです。この目的のために、私たちの研究室では、HIO内のENSの発達と、さまざまな段階での機能的結果を特に研究しています。

細胞の成長、分化、形態形成を経時的にモニタリングし、各ステップが期待どおりに進行していることを確認することで、次のステージに進むことが重要です。ENCCの分化とスフェロイド形成は最大3週間の期間にわたって行われ、 図2に示すように、分化後およびENCCスフェロイド形成のさまざまな段階でのENCCの代表的な明視野顕微鏡写真が示されています。ENCCは、12日目までに細胞単層内で目に見える凝集体を形成し始め、その後、超低接着プレートに再プレーティングした後、自発的にスフェロイドが形成されるはずです。ENCCスフェロイドはこの段階で急速に成長する傾向があり、肉眼で容易に見ることが...

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ディスカッション

HIOは、2010年代初頭からヒトの腸管発達のモデルシステムとして使用されてきましたが、それ以来、ますます複雑化しています。現在では、これらのコンストラクトにENSを提供することが可能になり、多くの臨床胃腸実体の理解とより良い治療に適用できる正常な発達の研究における新たな機会が可能になります。

体外 移植
ENCCは中腸スフェロイドに統合され、in vitro共培養段階でENSを形成します。ただし、私たちを含むいくつかのグループは、宿主の血管系に支えられた追加の成長と成熟を促進するために、28日目以降にHIO + ENSを生きている宿主に移植することを選択します。通常、HIO + ENSをin vitro成長の28日目から40日目の間にin vivoで移植します。しかし、in vitroで40日以上HIOを培養した研究室は他にもあります。これらのより長い...

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開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

Noah Shroyer氏、Michael Helmrath氏、James Wells氏、Faranak Fattahi氏など、多くの共同研究者やメンターの方々に、彼らの研究室を訪問することを許可し、長年にわたって私たちのプロトコールを洗練させるのを助けていただき、ありがとうございました。また、シンシナティ小児病院医療センターの多能性幹細胞施設および幹細胞・オルガノイド医学センター(CuSTOM)のChris Mayhew氏とAmy Pitstick氏には、HIOのトレーニング、指導、アドバイスを提供していただいたことに感謝します。この研究は、Texas Medical Center Digestive Diseases Center Pilot/Feasibility grant Award(一部はNIH/NIDDK P30DK056338)(Speer)、NIDDK(NIH 1K08DK131326-01A1)(Speer)、Men of Distinction award(Speer)、American Neurogastroenterology and Motility Society(ANMS)Transition Award(Speer)から資金提供を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
100x 非必須アミノ酸溶液 (NEAA)ThermoFischer Scientific11140050
15 mL コニカルチューブThermo Scientific12565269
AccutaseSTEMCELL Technologies07920"酵素細胞剥離試薬"
B-27 サプリメント (50x)、ビタミン AThermoFischer Scientific12587010ENCC用
B-27 サプリメント (50x)、無血清Gibco17504044HIO
Bright-Line 血球計算計用 Hausser Scientific3120
Corning Costar 超低アタッチメント マイクロプレートFisher Scientific07-200-601
Corning Flat-Bottom Plate 24-well, TC treatedVWR29442-044
Corning Flat-Bottom Plate 3516 6 wellVWR29442-042
Essential 6 MediaThermo FischerA1516401
Essential 8 MediaThermo FischerA2858501代替幹細胞培地、ENCCプレートに使用。 
細目鉗子デュモン11223-20
Forma Steri-Cycle i160Thermo Scientific50145522
Gibco Advanced DMEM/F12ThermoFischer Scientific12634-010
Gibco HEPES 1 MThermoFischer Scientific15630-080
Gibco Neurobasal MediumThermoFischer Scientific21103-049
グルタグロ、200 mM、100xコーニング25-015-CI
グルタマックスサーモフィッシャー サイエンティフィ35050061
H9 ヒト ESCウィセル インターナショナル幹細胞バンクN/A
HyCloneTM FBS 定義VWR16777-002
LabGard 生物学的安全キャビネットNuaireNu-430-400
マトリゲルGFR基底膜マトリックス、フェノールレッドフリー、LDEVフリーコーニング356231"クリア3D基底膜マトリックス"
マトリゲルhESC認定マトリックス、LDEVフリーコーニング354277"3D基底膜マトリックス"
マイクロピペットエッペンドルフ(100-1000、20-200、10-100、2-20、0.5-10、0.1-2.5 uL)2231300008
mTeSR 1STEMCELL Technologies85850"幹細胞培地"
カタログ番号には、事前に一括で追加される5倍サプリメントが含まれています。 
N-2 Supplement (100x)Gibco17502048の HIO
用 N-2 Supplement, CTS (Cell Therapy Systems)Thermo FisherA1370701For ENCC.少し異なる処方。
Nikon DS-Fi2 TS-100 顕微鏡NikonTS100
Noggin-conditioned mediaTexas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-coreN/A
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFischer Scientific15140-122
Recombinant Human Activin ACell Guidance SystemsGFH6-100
組換えヒト BMP-4フィッシャー・サイエンティフィック314BP010
組換えヒトEGFタンパク質、CFサーモフィッシャー・サイエンティフィック236-EG-200
組換えヒトFGFベーシック/FGF2 (146 aa) プロテイン・サーモフィッシャー・サイエンティフィ233-FB-010
組換えヒトFGF-4Peprotech100-31
ReLeSRSTEMCELL Technologies5872「幹細胞解離試薬」
レチノイン酸SIGMAR2625-50MG
Rnase-free Microfuge tubes, 2 mLThermo ScientificAM12425
RPMI 1640 MediumThermoFischer Scientific11875093
R-Spondin Conditioned mediaTexas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-coreN/A
SB 431542、Tocris Bioscienceフィッシャーサイエンティフィック16-141-0
Sorvall ST 16R 遠心分離機Thermo Scientific
スタンダード ワイドオリフィス ピペットチップVWR89049-166
Stemolecule Chir99021 溶液中 Stemgent04-0004-02
滅菌フィルターピペットチップVWR (1000uL、200uL、10uL)76322-154、76322-150、89174-520
ビトロネクチンXF幹細胞技術7180ENCCプレートに使用される代替3D基底膜マトリックス。 
ック ック

参考文献

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