ヘリコバクター・ピロリおよび抗生物質耐性を検出するための胃粘膜定量的ポリメラーゼ連鎖反応解析

サマリー

ピロリ菌の検出と薬剤耐性試験のための迅速かつ正確な方法は、臨床診療で効率的にピロリ菌を根絶するために非常に重要です。このプロトコルは、ピロリ菌と抗生物質耐性の迅速な検出のための胃粘膜定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR) を含む特定の方法論を提示することを目的としています。

要約

ヘリコバクター・ピロリは、世界人口の約半数が感染する主要な病原体であり、抗生物質耐性の増加により公衆衛生を脅かしています。また、ヘリコバクター・ピロリは、慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃癌、胃粘膜関連リンパ組織(MALT)リンパ腫の原因にもなります。したがって、ピロリ菌のタイムリーで正確な診断と、その抗生物質耐性の決定を行うことが不可欠です。現在、ピロリ菌の診断法としては、主に迅速ウレアーゼ検査(RUT)、尿素呼気検査(UBT)、血清抗体検査、抗原検査、胃内視鏡検査、細菌培養などの治療法が主流となっています。しかし、最初の5つの検出方法では細菌を培養することはできず、薬剤耐性の検出は言うまでもありませんでした。細菌の培養には時間がかかり、抗生物質感受性試験を迅速かつ日常的に実施することはできません。臨床現場では、ピロリ菌とその抗生物質に対する感受性を迅速かつ正確に同定することが、その効果的な除去に不可欠です。このプロトコルの目的は、胃粘膜サンプルに対する定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR) を利用して、ピロリ菌の診断を迅速化し、抗菌剤に対する耐性を評価するための標的アプローチを概説することです。qPCRは、ピロリ菌感染の尿素A遺伝子と、クラリスロマイシンとキノロンに対する耐性に関連する23S rRNAおよびgyrA遺伝子の変異を検出するために利用されました。現在、胃粘膜qPCRには、標準的な操作手順がないため、課題が残っています。したがって、実験手順の正確な伝達を確保するためには、実験の詳細と方法論を共有することが不可欠であり、透明性を高めるゴールドスタンダードプロトコルに貢献します。全体として、このプロトコルは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)技術の適用により、H.ピロリ菌感染とその抗生物質に対する耐性を評価するための従来の方法に代わる経済的で迅速な代替手段を提供します。

概要

ピロリ菌は、低酸素レベルの存在下でも生存できるグラム陰性菌です。この生物はいくつかの異なる遺伝的集団に属し、高い遺伝的多様性を示しています。通常、生物はらせん状であるが、ロッド¹に変更することもできる。これは、世界人口の約50%が感染する主要な病原体^です2。ほとんどの場合、感染は、患者が小児期に健康な保因者であり続け、成人期の後半に症状が現れるときに発生します。慢性胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍、胃癌、および胃粘膜関連リンパ組織(MALT)リンパ腫³に関連していることが報告されています。ピロリ菌感染の症状の違いは、異なる細菌株の病原性要素、宿主の属性、およびそれらの食事パターンから生じる可能性があります⁴。この研究は、喫煙や飲酒に従事する男性は、ピロリ菌感染症にかかるリスクが高いことを示しています⁵。胃がんおよび前がん病変を予防するためのピロリ菌の排除の有効性は、いくつかの研究で確認されています^6,7。そのため、ピロリ菌の除....

プロトコル

既存の研究は、中国広州市南医科大学広東省人民病院の倫理委員会によって確立された倫理的考慮事項に準拠して実施されました (承認番号: KY2024-1115-01)。18歳から60歳までの患者がこの研究に登録されました。この研究では、参加者が最近抗生物質、抗菌薬草療法、プロトンポンプ阻害剤 (PPI)、または_H2 受容体拮抗薬を投与していた場合、試験前の 2 週間以内に除外されました。また、過去3カ月以内に抗ピロリ 菌療法を受けた方、または心臓、肝臓、腎臓に重大な問題がある方、重度の神経障害、精神障害のある方は参加資格がありませんでした。胃腸穿孔、高齢、不安定なバイタルサインなど、胃内視鏡検査が禁忌の人は除外されました。この研究には、妊娠中または授乳中の女性も含まれていませんでした。被験者のインフォームドコンセントフォームには、主に次の内容が含まれています:(1)研究の背景と目的。(2)本研究プロジェクトへの参加に不適当なのはどのような方ですか?(3)研究に参加するための要件は何ですか?(4)研究に参加することで得られる可能性のある利益。(5) 副作用、リスク、不快感のおそれ(6)プライバシー保護。(7)対象の権利。(8)被験者の宣言。(9)研究者声明等

1. 胃粘膜の採取

1. サンプリング消耗品の調製
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結果

qPCRによる胃組織におけるピロリ菌感染と抗生物質耐性の評価
ピロリ菌を同定するためのqPCRアッセイは、尿素A遺伝子を標的として実施し、23S rRNAおよびgyrA遺伝子の特異的変異を調べることにより、抗生物質耐性を確認しました(表1)。3つのグループすべてのCT値で表される品質保証データは、許容範囲内に収まり、テスト時にサンプルが標準状態にあったことを示し、結果の信頼性を確保しました。この研究では、実験デザインの信頼性を確認するために、結果が異なる5つのサンプル(A、B、C、E、Fとラベル付け)を選択しました(図2)。H.ピロリ菌の検査で陽性となったサンプル「A」は、H.ピロリ菌の検出可能な範囲内にしかCT値を示しておらず、患者が両方の抗生物質に感受性があることを示唆しており、どちらの薬剤による治療も成功する可能性を示して.......

ディスカッション

RUT、UBT、組織学、培養、血清学などの従来の検査は、 ピロリ菌 の検出に利用されています。各診断アプローチには明確な利点があり、臨床状況に応じて特定の課題に直面しています¹⁷。胃粘膜生検からの ピロリ菌 の培養は、診断の基準と見なされることがよくあります。それにもかかわらず、この方法は労働集約的であり、その精度は技術的な課題、インキュベーションに必要な条件、および低細菌濃度の可能性によって制約されます。一方、病理組織学的検査は高い感度と特異性を誇っているが、細菌濃度や染色方法の選択は、組織学的評価に直接影響を与える可能性がある¹⁸。 従来のピロリ菌の検出方法の限界と比較して、分子診断アプローチは効率的に培養法を回避し、検出時間を大幅に短縮することができる¹⁹。

また、薬剤耐性率の増加は、除菌治療の有効性に深刻な影響.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
バスインキュベータ	ーALLSHENG	MK2000-2	一定の温度環境を提供します
バイオセーフティキャビネット	ハイアール	HR1500-B2
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	THERMO ST16R	チューブの壁に残った液体を遠心分離します。
Chelex-100	シグマ	C7901	樹脂
胃鏡 生検鉗子	ボストン・サイエンティフィック・コーポレーション		胃粘膜のサンプリング
ヘリコバクター・ピロリ 23S rRNA遺伝子およびgyrA遺伝子変異検出キット	江蘇モール・バイオサイエンス	CFDA 20223400137	ピロリ菌Mおよび薬剤耐性遺伝子(クラリスロマイシンおよびキノロン)のためのqPCR検出キット核
酸抽出試薬	Jiangsu Mole Bioscience	SEDA 20150076	DNA抽出用
SDSソフトウェア	Applied Biosystems	7300/7500	データ解析
サーモシルサーモフィ	ッシャーサイエンティフィック	ABI 7500	ピロリ菌および薬剤耐性遺伝子(クラリスロマイシンおよびキノロン)のqPCR検出用
テックスミキサー	JOANLAB	VM-5005	混合試薬用

ボル